Содержание к диссертации
Введение
2 Обзор литературы
2.1 Эпизоотология АЧС 14
2.2 Устойчивость вируса АЧС 19
2.3 Патогенез, клинические признаки и патологоанатомические изменения 22
2.4 Иммунитет и вакцинопрофилактика АЧС 25
2.5 Классификация и таксономия 27
2.6 Структура вириона 27
2.7 Морфогенез вируса АЧС 30
2.8 Структура генома вируса АЧС 34
2.9 Анализ структуры генома вируса АЧС 37
2.10 Заключение по обзору литературы 46
3 Собственные исследования и обсуждение 48
3.1 Материалы и методы 48
3.2. Результаты собственных исследований и обсуждение 54
3.2.1 Изучение культуральных свойств изолятов ВАЧС 54
3.2.2 Биопробы на естественно восприимчивых животных 61
3.2.3 Биопроба на свиньях с заражением штаммом Ставрополь 01/08 61
3.2.4 Биопроба на свиньях с заражением изолятом Kashino 04/13 67
3.2.5 Биопроба на свиньях с заражением изолятом Odintsovo 02/14 72
3.2.6 Сравнительный анализ результатов биопроб 79
3.2.7 Полногеномное секвенирование 82
3.2.8 Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей 92
3.2.9 Усовершенствование схемы первичной оценки и группирования изолятов ВАЧС 108
4 Заключение 111
4.1 Выводы 113
5 Список сокращений
- Патогенез, клинические признаки и патологоанатомические изменения
- Морфогенез вируса АЧС
- Биопробы на естественно восприимчивых животных
- Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Африканская чума свиней (АЧС, Pestis africana suum) – контагиозная вирусная геморрагическая болезнь, поражающая свиней всех пород и возрастов. Может протекать в формах от сверхострой до инаппарантной, с явлениями геморрагической лихорадки. Уровень смертности достигает 100%. Эффективных мер специфической профилактики и лечения АЧС на сегодняшний день не существует. На территорию Российской Федерации в 2007 году из Грузии был занесён вирус АЧС II генотипа 8 сероиммунотипа.
На сегодняшний день дифференцируют 22 генотипа вируса и 9 сероиммунотипов. Особенности эпизоотологии, патогенеза и иммуногенеза АЧС определяются уникальностью строения вирусного генома и ферментативного аппарата, а высокая генетическая и антигенная гетерогенность состава популяции вируса АЧС является одной из причин отсутствия эффективных вакцин.
Исходя из вышеизложенного, необходимы разработка и совершенствование средств специфической профилактики, диагностики и борьбы с АЧС, что требует дальнейшего всестороннего изучения болезни и её возбудителя.
Степень разработанности темы. Первые исследования по изучению вируса АЧС в СССР были выполнены в институтах ВИЭВ и ВНИИВВиМ.
Сведения о высокой вирулентности российских изолятов ВАЧС приводятся в работах как российских, так и зарубежных исследователей. На данный момент полностью не изучены функции многих вирусных генов. Идентификация генов, ответственных за вирулентность ВАЧС, делает возможным создание его делетированных мутантных вариантов, и, следовательно, разработку и испытание экспериментальных вакцин на их основе.
Изучение свойств выделяемых вирусных изолятов АЧС основано на совокупности исследований их культурально-биологических свойств и генетической структуры, поскольку сопоставление изменений в вирусном геноме вновь выделенных изолятов с изменениями их биологических свойств позволяет установить генетические причины, обуславливающие изменения клинических проявлений и антигенную вариабельность вируса. Основным и наиболее
продуктивным методом для изучения генома вируса АЧС является сравнительный анализ данных, получаемых в ходе полногеномного секвенирования.
Таким образом, работа по анализу культурально-биологических свойств новых изолятов и изучению структуры их геномов является актуальной.
Цели и задачи исследований. Цель работы - изучение культурально-биологических свойств современных полевых изолятов вируса АЧС, выделенных на территории Российской Федерации и анализ структуры их генома.
Для достижения цели необходимо было решить следующие задачи: а) изучить культурально-биологические свойства вируса АЧС изолятов Kashino 04/13 и Odintsovo 02/14; б) провести сравнительный анализ биологических свойств указанных изолятов с референс-штаммом Ставрополь 01/08; в) разработать адаптированные к лабораторным условиям методы очистки вируса АЧС и получения его геномной ДНК, пригодной для полногеномного секвенирования; г) провести полногеномное секвенирование вируса АЧС изолятов Kashino 04/13 и Odintsovo 02/14; д) провести сравнительный анализ структуры геномов вируса АЧС изолятов Kashino 04/13 и Odintsovo 02/14 с геномом изолята Georgia 2007/1; е) определить маркерные области в геноме вируса АЧС, по которым возможно установить родство изолятов вируса АЧС, циркулирующего на территории РФ.
Научная новизна результатов исследований. Впервые определены биологические свойства вируса АЧС изолятов Kashino 04/13 и Odintsovo 02/14, установлены основные параметры развития болезни: длительность инкубационного периода, сроки наступления гибели, скорость передачи вируса при прямом контакте, а также характерные патологоанатомические признаки.
Впервые определены и опубликованы в базе данных GenBank полноразмерные нуклеотидные последовательности геномов изолятов Kashino 04/13 и Odintsovo 02/14 под номерами KJ747406.1 и KP843857.1, соответственно.
Проведенный сравнительный анализ позволил выявить достоверные различия в нуклеотидных последовательностях геномов изолятов Kashino 04/13 и Odintsovo 02/14, затрагивающие области генов и мультигенных семейств, ответственных за вирулентность вируса и его репликацию в организме клещей; в том числе
структурные белки, гомологи клеточных белков, ферменты обмена нуклеиновых кислот, а также вспомогательные протеины, учавствующие в сборке вириона.
Впервые в РФ была обнаружена встройка, представляющая собой прямой тандемный повтор в интергенном регионе 9R/10R длиной 17 нуклеотидов. Проведен анализ пространственно-временного распространения современных российских и европейских изолятов вируса АЧС, содержащих встройки в интергенных регионах 9R/10R и I73R/I329L в своём геноме. Установлены предположительные сроки и регионы возникновения встроек в геноме циркулирующего вируса. Показана возможность проводить внутригенотиповую дифференциацию и отслеживать динамику распространения вируса АЧС по наличию данных встроек.
Теоретическая и практическая значимость работы. а) получены полные геномные последовательности российских изолятов вируса АЧС Kashino 04/13 и Odintsovo 02/14, которые могут быть использованы для изучения молекулярно-биологических свойств вируса АЧС; б) в международную базу данных GenBank внесены первые полные геномные последовательности российских изолятов ВАЧС Kashino 04/13 и Odintsovo 02/14; в) Вирус АЧС изолята Odintsovo 02/14 депонирован в ФГБУ «ВНИИЗЖ»; д) разработана схема предварительной систематизации вновь выделяемых изолятов вируса АЧС.
Разработано, утверждено и применяется в ФГБУ «ВНИИЗЖ» 12 методических рекомендаций по выделению, титрованию, серогрупповой классификации и наработке вируса АЧС, выявлению вирусного генома, концентрации и очистке вирусной ДНК из разных видов сырья с контролем качества полученного продукта, проведению и оценке результатов биопроб.
Методология и методы исследования. Методология проведенных
исследований включает стандартные процедуры с использованием различных
материалов и естественно восприимчивых животных. В работе использовали
молекулярно-биологические, вирусологические, серологические и
иммунологические методы исследований со статистической обработкой данных.
Положения, выносимые на защиту:
а) биологические свойства вируса АЧС изолятов Kashino 04/13 и Odintsovo 02/14 отличаются от таковых референс-штамма Ставрополь 01/08; б) сравнительный
анализ нуклеотидных последовательностей геномов вируса АЧС изолятов Kashino 04/13 и Odintsovo 02/14 позволил выявить изменения нуклеотидов в полноразмерных последовательностях генов и мультигенных семейств в геномах вируса АЧС российских изолятов, составившие 0,033% и 0,051% от размера генома, соответственно; в) в геноме изолята Odintsovo 02/14 присутствует прямой тандемный повтор GGAATATATA, отсутствующий в геномах изолятов ВАЧС Kashino 04/13 и Georgia 2007/1; г) в геноме изолята Kashino 04/13 присутствует прямой тандемный повтор GATAGTAGTTTAGTTAA, отсутствующий в геномах изолятов ВАЧС Odintsovo 02/14 и Georgia 2007/1; д) данные тандемные повторы могут быть использованы для дифференциации современных российских и европейских изолятов вируса АЧС.
Личный вклад автора. Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Автор выражает искреннюю благодарность сотрудникам референтной лаборатории по африканской чуме свиней ФГБУ «ВНИИЗЖ» за консультативную помощь и содействие в выполнении отдельных этапов работы.
Степень достоверности и апробация результатов. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета ФГБУ «ВНИИЗЖ» (2013-2015 гг.), Научно-технического совета Россельхознадзора (2014-2015 гг.), 4 и 5 международных ветеринарных конгрессах (Казань 2014 г, Москва 2015 г.), VII-VIII ежегодных встречах Европейской исследовательской группы Epizone (2013-2014 гг.), 18-й Международной научно-методической конференции по патанатомии животных (Москва 2014 г.), 17-й Международной конференции по вирусологии и инфекционным болезням (Лондон 2015 г.).
Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 12 научных работ, 3 из них в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ для докторских и кандидатских диссертаций.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 148 страницах, содержит разделы: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, приложения. Список использованной литературы включает 184 источника. В приложении представлены копии титульных листов документов, подтверждающих достоверность и практическую значимость.
Патогенез, клинические признаки и патологоанатомические изменения
Кроме того, вирион АЧС защищён суперкапсидной оболочкой, приобретаемой при почковании вириона сквозь плазматическую мембрану клетки. Несмотря на содержание липидов в составе плазматической мембраны возбудитель АЧС устойчив к действию жирорастворителей, поскольку даже при утрате суперкапсида вирус сохраняет свою вирулентность [18, 21, 46, 63, 160].
Вирус АЧС высоко устойчив и способен длительное время сохранять инфекционность вне организма хозяина: на поверхностях, в кормах, подстилке, отходах и нечистотах, свином мясе и продуктах его переработки, костной муке, на шкурах животных.
Согласно обобщённым данным различных исследователей, возбудитель резистентен к протеолитическим ферментам и нуклеазам; сохраняет стабильность при pH 4-10, что позволяет ему сохраняться при вызревании мяса; устойчив к многократному замораживанию и оттаиванию, гниению, способен длительно храниться в лиофилизированном состоянии [20, 127, 162].
На поверхностях во внешней среде вирус сохраняется до 5-7 суток. Низкие температуры, а также содержащие белки выделения и биологические жидкости организма значительно повышают выживаемость вируса. Кроме того, органические компоненты в составе отходов могут ухудшать действие дезинфектантов, нейтрализуя их и защищая вирионы от разрушительного воздействия. Так, при pH 13,4 без сыворотки вирус сохраняет инфекционную активность 21 час, а в присутствии 25% сыворотки – до 7 суток; в свином навозе вирус АЧС способен сохранять инфекционность до 160 суток, в разложившихся кровяных сгустках и охлаждённом мясе до 4 месяцев, в замороженных тушах до 15 лет. При этом общая инфекционность туши превышает 1013 ИЕ вируса, 96% которого сосредоточено в костном мозге, а значительная часть остального вируса – в крови и лимфоузлах (до 1,3х1011 ИЕ) [28, 29, 90, 94, 140].
В популяции аргасовых клещей рода Ornithodoros вирус АЧС может размножаться до 4-8 лет, накапливаясь в организме клеща в титре 104 ИЕ [18, 21].
Вирус АЧС чувствителен к высушиванию, ультрафиолету, окислителям, щелочам, детергентам и мылам. Инактивируется при нагревании до 60C в течение 20 минут. При дезинфекции наиболее эффективны растворы гипохлорита натрия 2-3%; едкого натра 2%; Виркона 2-3%; глютаральдегида 1-2% [20, 90, 127, 143].
Обуславливаемая специфическим строением вириона высокая устойчивость вируса АЧС позволяет возбудителю не только длительно сохраняться в сыром мясе и продуктах переработки свинины, не прошедших термическую обработку (сало, соленья, копчёности); но также выдерживать длительную перевозку и хранение в замороженном состоянии, включая транспортировку между странами и континентами. Таким образом, возможен перенос возбудителя с контаминированными продуктами свиноводства на значительное расстояние от первоначального места вспышки, а также возникновение «отложенных» вспышек заболевания при замораживании заражённых продуктов для длительного хранения, что во многом обуславливает специфические черты эпизоотологии АЧС [18, 94, 119]. 2.3 Патогенез, клинические признаки и патологоанатомические изменения
Патогенез. Проникновение вируса АЧС в организм животного может происходить при вдыхании вируссодержащей аэрозоли, поедании контаминированных отходов или трупов павших животных, вместе с жидкостями организма и при укусе заражённых аргасовых клещей рода Ornithodoros. Инкубационный период после проникновения возбудителя АЧС составляет обычно от 4 до 20 дней. Тяжесть заболевания, скорость и степень проявления клинических признаков зависят как от свойств изолята вируса АЧС, определяемых его геномом, так и от заражающей дозы, пути заражения и индивидуальных особенностей инфицированных животных [9, 15, 16, 126, 161].
Внутри организма хозяина вирус АЧС изначально попадает макрофаги и моноциты близлежащих к входным воротам инфекции лимфатических узлов, где происходит его первичная репликация [162]. При оральном заражении в первую очередь поражаются миндалины и подчелюстные лимфатические узлы, откуда через кровеносную и лимфатическую системы вирус распространяется в основные места вторичной репликации, проникая в скопления макрофагов в лимфоузлах, лёгких, а также клетки селезёнки, печени, почек и костного мозга.
Виремия у больных животных обычно начинается на 3-5 сутки после заражения. Её длительность может достигать нескольких месяцев, поскольку вируснейтрализующие антитела к вирусу АЧС не дают защитного эффекта. В крови возбудитель ассоциируется с эритроцитами благодаря наличию в составе суперкапсида его вирирона протеина vpE402R – вирусного гомолога макрофагального белка CD2, обуславливающего гемадсорбцию [57, 67, 72, 107, 124, 125, 126, 161].
Клинические признаки. Для АЧС характерна картина геморрагической лихорадки. При этом геморрагии могут возникать в результате сочетанного действия нескольких поражающих факторов: нарушения проницаемости сосудов и капилляров, фагоцитарной активации клеток сосудистого эндотелия, а также размножения в клетках эндотелия вируса АЧС на поздних стадиях заболевания. В поражённых лёгких активация пульмонарных интраваскулярных макрофагов вызывает развитие альвеолярного отёка, зачастую непосредственно приводящего к гибели животного. Клиническая и патологоанатомическая картины при острой и сверхострой формах заболевания схожи с картиной, наблюдаемой при заражении вирусом КЧС и рожей свиней, поэтому для достоверной дифференциации этих заболеваний необходимо проведение лабораторных исследований [9, 120, 143, 161, 162, 173].
АЧС может протекать в острой, сверхострой, субклинической и хронической формах. При сверхострой форме АЧС гибель животных наступает стремительно, без развития клинических признаков заболевания.
При острой форме АЧС гибель до 100% заражённых животных наблюдается на 5-7 сутки после развития клинических признаков. В числе характерных клинических признаков отмечают слабость, лихорадку, отказ от пищи, общее угнетённое состояние, иногда конъюнктивиты, кровавый понос, поражения нервной системы, такие, как парезы конечностей и изменения походки; а также цианоз кожи ушей и конечностей. В крови животных при заболевании АЧС в острой форме развивается лимфопения, вызываемая апоптозом лимфоцитов.
Для субклинического течения АЧС типичны геморрагии на коже (преимущественно ушей и конечностей), нарушения дыхания, в составе клеток крови животных отмечается перемежающаяся тромбоцитопения и лимфопения. При заболевании АЧС в субклинической и хронической формах животные являются вирусоносителями, что играет важную роль в персистенции АЧС на поражённых и эндемичных территориях.
Хроническое течение АЧС обычно сопровождается затруднённым дыханием, абортами, иногда распуханием суставов конечностей свиней и кожными поражениями [15, 16, 19, 45, 99, 130, 161, 182].
Морфогенез вируса АЧС
Для расчёта систем праймеров использовали программу Oligo 6. Синтез праймеров выполнен НПК СИНТОЛ. Оборудование. В процессе выполнения работы было использовано следующее оборудование: - система для электрофореза Эльф-4 («ДНК-технология», Россия); видеосистема для документирования результатов электрофореза Doc-print VX5 (Vilber Lournat, Франция); инвертированный микроскоп Olympus CX 41 (Япония); pH-метр «PB-11» (Satorius, Германия); СО2–инкубатор (Nuaire, США); ламинарный бокс (Labconco, США); бытовой холодильник 2 - 8С (Indesit, Россия); низкотемпературный холодильник - 70С (Nuaire, США); счётчик клеток Countess (Invitrogen, США); весы аналитические Explorer EX224 (Ohaus, Швейцария); центрифуга напольная Janetzki T23 (Heinz, Польша); термостат Гном («ДНК-технология», Россия); RT-PCR амплификатор MasterCycler (Eppendorf, Германия); ультрацентрифуга (Bechman Coulter, США); спектрофотометр Biospectrometer (Eppendorf, Германия); центрифуга Sigma 3-18 KS (Sigma Laborzentrifugen GmbH, Германия); водяная баня (Россия); пипетки автоматические (Eppendorf, Германия; Ленпипет, Россия).
Виварное оборудование. Шприцы одноразовые стерильные 5 см3 (Россия); вакуумные пробирки и иглы 0,8мм к ним (Vacuette, Австрия); контейнеры для проб 30 см3 (Россия); хирургические инструменты нержавеющие (Россия); термометры ртутные (США).
Выращивание перевиваемых культур клеток. Клетки в концентрации 0,4-0,5 млн/см3 вносили в культуральные матрасы с соответствующей питательной средой, содержащей 10% фетальной сыворотки КРС, после чего инкубировали их в CO2-инкубаторе при температуре 37С в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа. Для промывания монослоя клеток при необходимости использовали физиологический раствор с рН 7,0-7,4.
Определение титра вируса. Титрование вируссодержащего материала проводили с использованием чувствительных культур клеток на пластиковых 96-луночных планшетах по стандартной методике, используя 4 параллели на каждое разведение в соответствии с разработанными в ФГБУ «ВНИИЗЖ» методическими указаниями (см. Приложения 4, 5). Инфекционный титр вируса вычисляли по методу Кербера или Рида и Менча и выражали в lg ГАдЕ50/см3.
Определение серотиповой принадлежности вируса. Определение серотиповой принадлежности выполняли в реакции задержки гемадсорбции (РЗГаД) в соответствии с разработанными в ФГБУ «ВНИИЗЖ» методическими указаниями (см. Приложение 6).
Отбор проб. Отстрел диких животных осуществляли охотники и егеря. Фрагменты трубчатых костей, селезенки и т.п. доставляли в ветеринарные лаборатории, где проводили исследования. Далее пробы направлялись в ФГБУ «ВНИИЗЖ» в замороженном виде.
Обнаружение вируса АЧС в патматериале. В полученных пробах патматериала обнаруживали наличие генома возбудителя АЧС методом РВ-ПЦР; цельного вируса в реакции прямой иммунофлуоресценции (РПИФ) и по наличию гемадсорбции в соответствии с разработанными и утверждёнными в ФГБУ «ВНИИЗЖ» методическими указаниями (см. Приложения 6, 7, 9).
Постановку РВ-ПЦР проводили с использованием «тест-системы "АЧС" для диагностики африканской чумы свиней методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме "реального времени"», производства ИнтерЛабСервис, согласно рекомендациям производителя.
Для постановки РПИФ использовали конъюгат протеина А с флуоресцентной меткой «Protein A – FITC» (Sigma); ФБР и глицерин с применением инвертированного микроскопа Olympus.
Вирусовыделение. Пробы, показавшие в РТ-ПЦР и/или РПИФ положительный результат, использовали для вирусовыделения методом инокуляции культуры клеток альвеолярных макрофагов свиньи (АМС) с проведением не более 3 пассажей. Культуру клеток АМС выращивали в пластиковых матрасах объёмом 25 см3 на среде Дюльбекко МЕМ с добавлением 10% фетальной сыворотки, в соответствии с методическими указаниями, разработанными и утверждёнными в ФГБУ «ВНИИЗЖ» (см. Приложение 3).
Для проведения вирусовыделения образцы проб патматериала гомогенизировали в фарфоровых ступках до получения мелкодисперсной 10% суспензии органа (селезёнки) в физрастворе. Полученную суспензию осветляли центрифугированием и фильтровали через нитроцеллюлозные мембраны с диаметром пор 0,45 мкм, после чего инокулировали культуру клеток в соотношении объёмов 1:10. Длительность пассажа составляла 7-10 суток. В ходе пассирования проводили ежедневное микроскопирование и учитывали время появления гемадсорбции и наступления 65-70% ЦПД. Всего выполняли не более 3 последовательных пассажей. Если признаков накопления вируса не обнаруживалось, проводили «слепой» пассаж, инокулируя новый матрас с КК АМС вируссодержащей суспензией предыдущего пассажа также в соотношении 1:10.
Культивирование вируса. Для накопления значительных объёмов вируса АЧС с целью последующего выделения вирусной ДНК и определения её нуклеотидной последовательности выполняли пассирование вируса на первичной культуре клеток альвеолярных макрофагов свиньи согласно методическим рекомендациям, разработанным и утверждённым в ФГБУ «ВНИИЗЖ» (см. Приложение 1). Для заражения культуры клеток использовали 10% суспензию измельчённой селезёнки в физрастворе. Титрование и определение инфекционной активности вируса проводили в реакции гемадсорбции.
Выделение вирусной ДНК. Выделение нуклеиновой кислоты вируса АЧС проводили согласно методическим рекомендациям, разработанным и утверждённым в ФГБУ «ВНИИЗЖ» (см. Приложения 1, 2). Оценка гомогенности, чистоты и концентрации вирусной ДНК. Для полученных препаратов ДНК вируса АЧС контроль чистоты выделенной ДНК вируса АЧС выполняли спектрофотометрически, определяя коэффициенты поглощения на длинах волн 260, 280 и 320 нм. Оценку целостности ДНК проводили методом электрофоретического разделения в агарозном геле, согласно методическим рекомендациям, разработанным и утверждённым в ФГБУ «ВНИИЗЖ» (см. Приложения 1, 2).
Пиросеквенирование. Для фрагментации двухцепочечной геномной вирусной ДНК применяли азотную небулизацию при помощи наборов «GS Rapid Library Prep Nebulizers», «GS RL Buffers Kit» (Roche, Германия) согласно инструкциям производителя. Затем подготавливали генетическую библиотеку и проводили пиросеквенирование, используя наборы «GS Rapid Library Rgt/Adaptors Kit», «GS Rapid Library MID Adaptors Kit», «GS Junior emPCR Reagents (Lib-L)», «GS Junior emPCR Bead Recovery Reagents», «GS Junior emPCR Oil & Breaking Kit », «GS Junior Seq. Reagents and Enzymes», «GS Junior Sequencing Buffers», «GS Junior Packing Beads & Supplement CB» (Roche, Германия) согласно инструкциям производителя.
Постановка биопроб на свиньях. Для изучения клинико-анатомического проявления АЧС при заражении домашних свиней проводили биопробы на чувствительных животных. В качестве экспериментальных животных использовали поросят крупной белой породы массой 15-20 кг, в возрасте 2 месяцев, полученных из хозяйств, благополучных по африканской и классической чуме свиней.
Биопробы на естественно восприимчивых животных
Влияние способа заражения. Во всех случаях животные, которым вводили вирус внутримышечно в равных дозах погибали раньше животных, заражённых интраназально. При этом длительность инкубационного периода и время жизни после введения вируса у животных, заражённых внутримышечно, практически совпадали (до 1 суток). Поросята, зараженные интраназально в равных дозах, демонстрировали значительную разницу в длительности инкубационного периода и времени жизни после введения вируса (до 9 суток).
При заражении животных в естественных условиях попадание вируса в организм через дыхательные пути более вероятно, в то время, как внутримышечное его введение представляется практически невозможным. Однако, при интраназальном введении вируссодержащей суспензии в экспериментальных условиях сложно гарантировать доставку полного объёма вводимой жидкости в лёгкие животного, поскольку ее введение в дыхательные пути может вызвать у животного кашлевой рефлекс, в результате чего вируссодержащая жидкость может быть потеряна или проглочена животным. Алиментарный путь заражения наименее эффективен, поскольку вирус разрушается, попадая в агрессивную среду пищеварительной системы [120].
В то же время внутримышечное введение позволяет гарантировать отсутствие потерь вирусного материала при его введении, а процесс заражения проходит значительно быстрее. Также, естественная воспалительная реакция организма на введение чужеродного агента, возникающая после инъекции, ускоряет генерализацию инфекции за счёт привлечения макрофагов к месту введения вируса. Этим, по-видимому, объясняется значительная разница в скорости наступления клинической картины заболевания у поросят при интраназальном и внутримышечном введении равных доз. Следовательно, внутримышечный способ введения вируса является предпочтительным для заражения экспериментальных животных с целью воспроизведения болезни.
Влияние заражающей дозы. Все исследованные в наших экспериментах варианты ВАЧС обладали 100% летальностью для свиней. При заражении одним и тем же способом и изолятом разница в продолжительности жизни животных, заражённых в дозе 5000 ГАдЕ50 и 50 ГАдЕ50, составляла до 12 суток. Практически во всех случаях заражение в большей дозе ускоряло развитие лихорадки и гибель животных. Однако, по результатам вскрытий павших поросят было установлено, что выраженность патоморфологических изменений у животных находится в обратной зависимости от заражающей дозы. Кроме того, ранняя гибель (1-3 дня после заражения) заражённых в высокой дозе поросят не оставляет времени для развития антительного ответа. Таким образом, заражение животных в дозе 50 ГАдЕ50 не только приводит к развитию заболевания и гибели животных, но и оставляет время для проявления специфических для АЧС клинических признаков и патологоанатомических изменений.
Различия биологических свойств изученных изолятов. Из данных, представленных на рисунке 14 видно, что быстрее всего при экспериментальном заражении гибель опытных животных вызвал ВАЧС штамма Ставрополь 01/08. Срок жизни заражённых животных составлял 6-9 суток с момента заражения. При этом разница в длительности инкубационного периода и сроках жизни животных, заражённых в разных дозах и различными способами, составила в среднем не более суток. Так, заражённые интраназально в дозах 50 и 5000 ГАдЕ50 поросята погибли одновременно, что свидетельствует о высокой вирулентности данного изолята и гомогенности состава популяции.
При для поросят, заражённых вирусом АЧС изолята Kashino 04/13 продолжительность жизни составляла 8-21 суток после заражения; в то время, как для ВАЧС изолята Odintsovo 02/14 продолжительность жизни поросят после заражения варьировала в пределах 12-32 суток.
Следовательно, поросята, зараженные вирусом изолятов ВАЧС Kashino 04/13 и Odintsovo 02/14 проявили тенденцию к увеличению сроков течения болезни, что выражается в увеличении продолжительности инкубационного периода в 1,5-6 раз (в зависимости от заражающей дозы) и продолжительности жизни животных в 3-4 раза.
Поскольку для исследуемых изолятов вируса АЧС были обнаружены различия в проявлении как культуральных (уменьшение количества прикрепленных эритроцитов), так и биологических свойств, было принято решение о необходимости проведения полногеномного секвенирования для установления полных нуклеотидных последовательностей геномов выбранных изолятов с целью сопоставления изменений их культурально-биологических свойств и структуры генома.
Выбор исходного материала. Для проведения анализа структуры генома методом высокопроизводительного полногеномного секвенирования необходимо получить материал ДНК с концентрацией не менее 20 мкг/см3, что предъявляет высокие требования к количественному содержанию вируса в исходном материале, очищенный концентрат которого используется для выделения ДНК. Как показал анализ литературы и результатов предварительных исследований для очистки вируса и выделения вирусной ДНК целесообразно использовать цельную кровь заражённого животного, отбираемую прижизненно на пике виремии. В ходе отработки метода выделения ДНК из цельной крови установлено, что минимальный объём получаемой крови должен быть не менее 500 мл с титром инфекционности вируса АЧС не менее 6 lg ГАдЕ50/см3.
Для тех случаев, когда получение цельной крови от живого животного невозможно, необходимо проводить накопление вируса АЧС в первичной культуре клеток для его последующей очистки и концентрирования. В ходе отработки и совершенствования метода было исследовано более 30 проб вирусных препаратов цельной крови свиней и суспензий культур клеток, заражённых вирусом АЧС.
Выбор первичной культуры клеток для культивирования вируса АЧС обусловлен тем, что размножение вируса в течение 3-5 последовательных пассажей в первичных КК не приводит к существенному изменению структуры генома и сокращению его длины, в то время, как при культивировании возбудителя АЧС в перевиваемых КК при адаптации геном вируса теряет от нескольких тысяч до 2 десятков тысяч пар оснований в результате сокращения числа генов в составе мультигенных семейств и потерь интергенных регионов [60, 105].
В таблице 12 приведены данные, полученные при изучении сроков и уровня накопления вируса АЧС изолята Odintsovo 02/14 в различных первичных КК свиней: костного мозга (ККМС), лейкоцитов (ЛС) и почки (СП) свиньи.
Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей
Представленные данные свидетельствуют о том, что применение метода фенол-хлороформной экстракции позволяет получать препараты ДНК вируса АЧС с соотношением А260/А280 1,7.
Таким образом, на основании проведенных исследований разработаны «Методические рекомендации по получению препаратов ДНК вируса африканской чумы свиней из цельной крови свиней для высокопроизводительного полногеномного секвенирования», а также «Методические рекомендации по наработке ДНК вируса африканской чумы свиней в первичной культуре клеток макрофагов свиньи для последующего пиросеквенирования», позволяющие получать конечный продукт высокой чистоты в необходимом количестве.
С использованием данных методов были получены концентрированные препараты ДНК с высокой степенью очистки вирусов АЧС изолята Kashino 06/13 (объём цельной свиной крови 780 мл, титр вируса в препарате 7,50 lg ГАдЕ50/см3, чистота выделенной ДНК 1,96 (A260/A280), количество полученной ДНК 24 мкг) и изолята Odintsovo 02/14 (объём исходной клеточной суспензии 2400 мл, титр вируса в препарате 5,7 lg ГАдЕ50/см3, чистота выделенной ДНК 1,7 (A260/A280), количество полученной ДНК 72,1 мкг).
Пиросеквенирование. Определение полной нуклеотидной последовательности генома изолятов вируса АЧС проводилось к.б.н. Зиняковым Н.Г. на базе референтной лаборатории вирусных болезней птиц ФГБУ «ВНИИЗЖ» с использованием автоматического секвенатора 454 GS Junior (Roche, Германия) согласно методическим рекомендациям, разработанным и утверждённым в ФГБУ «ВНИИЗЖ».
Сборку полученных с пиросеквенатора первичных данных (ридов) в контиги, и дальнейшую сборку контигов в полноразмерные геномы проводили с помощью пакета компьютерных программ «GS De Novo Assembler» и «GS Reference Mapper Software» (454 Life Science Corp.) [25]. Для выявления рекомбинаций использовали программу Recombination Detection Program (RDP), версия 3.44 [157].
В результате пиросеквенирования были получены полноразмерные нуклеотидные последовательности геномов изолятов вируса АЧС, опубликованные в базе данных GenBank под номерами KJ747406.1 и KP843857.1 соответственно.
Анализ изменений в полных нуклеотидных последовательностях геномов проводили, сравнивая геномы исследуемых изолятов ВАЧС и изолята Georgia 2007/1, с которого началось распространение АЧС по территории РФ в 2007 году. Его последовательность была получена из базы данных GenBank (номер FR682468.1).
Было проведено выравнивание геномов методом ClustalW с использованием программы MEGA версии 6.0 [131]. Эта операция позволяет легко обнаруживать гомологичные и варьирующие участки в нуклеотидных последовательностях и изучить их функциональные, структурные или эволюционные взаимосвязи. Также проводилось обобщение данных по функциональной принадлежности отдельных генов вируса АЧС.
Сопоставление обнаруженных изменений со функциональной картой генома возбудителя АЧС, составленной L. Dixon с соавт., (2013) позволило выявить гены и интергенные регионы, содержащие в своём составе изменённые нуклеотидные последовательности.
Нами были обнаружены моно- и полинуклеотидные встройки, включая прямые тандемные повторы GGAATATATA и GATAGTAGTTTAGTTAA, делеции, а также замены нуклеотидов. Наиболее часто отмечался однонуклеотидный полиморфизм (ОНП) – различия в последовательности ДНК длиной в один нуклеотид.
Изменения в геноме изолята ВАЧС Kashino 04/13. Анализ изменений генома показал, что в сравнении с последовательностью изолята Georgia 2007/1 в геноме изолята Kashino 04/13 обнаружены 53 единичные встройки, 13 делеций и 8 замен, что составляет 0,033% изменений от общей длины его генома. Наибольшее число изменений (51,35 %) локализуется в левом концевом регионе: 4 замены, 27 встроек и 7 делеций.
Перечень обнаруженных изменений представлен далее в таблице 17. Таблица 17 – сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей геномов изолятов Kashino 04/13 и Georgia 2007/1
Всего в геноме изолята Kashino 04/13 обнаружено 74 изменения (инсерции, делеции и замены). Большая часть изменений локализуется в некодирующих областях генома. Тем не менее, нельзя исключать возможного влияния таких изменений на биологические свойства возбудителя АЧС, поскольку они могут входить в состав промоторов или иных регуляторных областей. Часть изменений нуклеотидной последовательности выявлена в составе генов вируса АЧС. Их перечень приведён в таблице 18. Таблица 18 – изменения нуклеотидной последовательности генов изолята
Таким образом, мутации затронули 25 генов в геноме изолята ВАЧС Kashino 04/13. При этом анализ предсказанной аминокислотной последовательности белкового продукта транскрипции генов позволил выявить её изменения в 22 случаях. В число генов, несущих подобные именения, вошли 5 генов, входящих в состав мультигенных семейств 110, 360 и 505, отвественных за вирулентность вируса и его репликацию в организме клещей; 6 генов, кодирующих белки с установленной функцией: вирусный гомолог ингибитора апоптоза, NifS-подобный белок, лектиноподобный белок, ДНК-полимераза, тимидкиназа и ген, кодирующий протеин, содержащий трансмембранный домен; а также 11 генов, чьи функции на данный момент неизвестны.