Модельные биосистемы для оценки защитной эффективности препаратов от оспы обезьян и гриппа птиц (А/H5N1) у человека Сергеев Артемий Александрович

Содержание к диссертации

Введение

1 Обзор литературы: известные модельные биосистемы для изучения защитной эффективности препаратов от инфекций человека, вызванных вирусами оспы обезьян и гриппа птиц А/H5N1 17

1.1 История выделения патогенных для человека вирусов оспы обезьян и гриппа птиц 17

1.2 Чувствительность человека, подопытных животных и их первичных клеточных культур к вирусу оспы обезьян и высокопатогенному вирусу гриппа птиц А/H5N1

1.2.1 Чувствительность человека и животных и их первичных клеточных культур к вирусу оспы обезьян 19

1.2.2 Чувствительность человека и мышей и их первичных клеточных культур к вирусу гриппа птиц 31

1.3 Распространение вируса оспы обезьян и высокопатогенного вируса гриппа птиц А/H5N1 в организме человека и подопытных животных 37

1.3.1 Накопление вируса оспы обезьян в органах и тканях человека и животных 37

1.3.2 Накопление вируса гриппа птиц в органах и тканях человека и мышей 47

1.4 Патоморфологические изменения у человека и подопытных животных, инфицированных вирусом оспы обезьян и высокопатогенным вирусом гриппа птиц А/H5N1 51

1.4.1 Данные световой и электронной микроскопии органов и тканей человека и животных, инфицированных возбудителем оспы обезьян 51

1.4.2 Данные световой и электронной микроскопии органов и тканей человека и мышей, инфицированных вирусом гриппа птиц... 53

1.5 Использование модельных видов животных для оспы обезьян и гриппа

птиц (А/H5N1) при изучении эффективности противовирусных препаратов 57

1.6 Подходы к созданию модельных биосистем для изучения защитной эффективности противооспенных и противогриппозных препаратов у человека 66

1.7 Заключение 71

2 Материалы и методы 73

2.1 Лабораторные животные 73

2.2 Перевиваемая клеточная культура и куриные эмбрионы 74

2.3 Первичные культуры клеток крови и легких человека 74

2.4 Первичные культуры клеток подопытных видов животных 77

2.5 Вирусы 79

2.6 Методы инфицирования животных 80

2.7 Методы изучения инфекционного процесса в первичных клеточных культурах 85

2.8 Подготовка биоматериалов от инфицированных животных 88

2.9 Вирусологический и молекулярно-генетический анализ проб 91

2.10 Оценка остаточной инфекционности кусочков органов сурков, зараженных вирусом оспы обезьян 92

2.11 Оценка титров противооспенных антител 92

2.12 Патоморфологические исследования 93

2.13 Исследуемые противовирусные препараты 94

2.14 Определение цитотоксичности и антиортопоксвирусной активности химических препаратов 94

2.15 Схемы применения препаратов у инфицированных вирусами сурков и мышей 95

2.16 Экстраполяция на человека и животных 50 %-х инфицирующих доз вируса, полученных с использованием первичных культур клеток. 98

2.17 Статистическая обработка результатов 98

Результаты и обсуждение 100

3 Стратегия поиска модельных биосистем для изучения защитной эффективности препаратов от инфекций человека, вызванных вирусами оспы обезьян и гриппа птиц а/h5n1 100

4 Поиск модельных видов животных для оспы обезьян по изучению защитной эффективности препаратов для человека 106

4.1 Экспериментальная и прогнозная оценка чувствительности людей и под опытных животных к патогенным ортопоксвирусам 106

4.1.1 Оценка чувствительности первичных клеток-мишеней животных и человека к патогенным ортопоксвирусам 106

4.1.1.1 Данные по чувствительности первичных клеток-мишеней животных к возбудителю оспы обезьян 106

4.1.1.2 Данные по чувствительности первичных клеток-мишеней человека и животных к возбудителю натуральной оспы

4.1.2 Оценка 50 %-х инфицирующих доз вируса оспы обезьян для подопытных животных при интраназальном заражении 124

4.1.3 Прогнозная оценка чувствительности к патогенным ортопоксвирусам человека и подопытных животных .

4.1.3.1 Прогнозная оценка 50 %-х инфицирующих доз патогенных ортопоксвиру-сов для человека и подопытных животных по данным заражения первичных их клеток-мишеней и самих животных 135

4.1.3.2 Прогнозная оценка 50 %-й инфицирующей дозы возбудителя оспы обезьян для человека 144

4.2 Распространение возбудителя оспы обезьян в организме степных сурков и аутбредных мышей ICR 149

4.2.1 Диссеминация вируса в организме сурков 149

4.2.2 Диссеминация вируса в организме мышей 157

4.3 Патоморфологические изменения у степных сурков и аутбредных мышей ICR, зараженных возбудителем оспы обезьян 164

4.3.1 Световая и электронная микроскопия органов и тканей сурков, зараженных вирусом 163

4.3.2 Световая и электронная микроскопия органов и тканей мышей, зараженных вирусом 171

4.4 Оценка возможность использования степных сурков и аутбредных мышей ICR для изучения эффективности препаратов от оспы обезьян у человека 179

4.5 Испытание и пределы практического применения модельных биосистем для оспы обезьян на основе степного сурка и аутбредной мыши ICR 192

5 Поиск модельной биосистемы для изучения защитной эффективности препаратов от гриппа птиц (а/h5n1) у человека 205

5.1 Чувствительность человека и подопытных животных к высокопатогенному вирусу гриппа птиц А/H5N1... 205

5.1.1 Прогнозная оценка 50 %-й инфицирующей дозы вируса для человека по данным заражения его первичных клеток-мишеней 205

5.1.2 Оценка 50 %-х инфицирующих доз вируса для подопытных животных при респираторном заражении 214

5.2 Диссеминация высокопатогенного вируса гриппа птиц А/H5N1 в организ ме кур генетической линии Род-Айланд, гусей генетической линии A. anser и аутбредных мышей ICR 223

5.2.1 Распространение вируса в организме кур и гусей 223

5.2.2 Распространение вируса в организме мышей 2 5.3 Патоморфологические изменения у аутбредных мышей ICR, инфицированных высокопатогенным вирусом гриппа птиц А/H5N1.. 243

5.4 Оценка возможности применения модельной биосистемы «аутбредная мышь ICR –штамм A/Chicken/Kurgan/05/2005 высокопатогенного вируса гриппа птиц А/H5N1» для изучения защитной эффективности препаратов у человека 252

5.5 Испытание и пределы практического применения модельной биосистемы для гриппа птиц А/H5N1 на основе аутбредной мыши ICR 261

Заключение 268

Список сокращений и условных обозначений 278

Список литературы

• Чувствительность человека и мышей и их первичных клеточных культур к вирусу гриппа птиц
• Методы изучения инфекционного процесса в первичных клеточных культурах
• Прогнозная оценка чувствительности к патогенным ортопоксвирусам человека и подопытных животных
• Оценка 50 %-х инфицирующих доз вируса для подопытных животных при респираторном заражении

Введение к работе

Актуальность темы исследования. Болезни инфекционной природы составляют одну пятую часть среди причин смерти людей в мире, по данным Всемирной организации здравоохранения за последние 15 лет (Saker et al., 2004; WHO, 2012). При этом из числа вирусных инфекций наибольшую значимость с эпидемиологической точки зрения представляют заболевания, входными воротами для которых являются органы респираторного тракта. Возбудители этих заболеваний имеют преимущественно аэрозольный механизм передачи и короткий инкубационный период (Zhao, Zhao, Xianing, 2005; Gerba, 2007; International Scientific Forum, 2012). К числу таких инфекций (из разряда особо опасных) относятся оспа обезьян и грипп птиц (A/H5N1). Несмотря на то, что возбудители этих зооантропонозных заболеваний, принадлежащих к семействам Poxviridae (род Orthopoxvirus) и были открыты достаточно давно, внимание ученых к данным патогенам не ослабевает и по настоящее время, что связано с шестью основными причинами:

с высокой опасностью высокопатогенного вируса гриппа птиц (в/пат ВГП) A/H5N1 и вируса оспы обезьян (ВОО) для человека (летальность достигала 60 и 17 % соответственно) (Gispen, 1975; Di Giulio, Eckburg, 2004; WHO, 2013);

с низким уровнем иммунитета или его отсутствием у людей к гриппу птиц (A/H5N1) и оспе обезьян: вакцинация от первого заболевания не проводится, а от натуральной оспы, которая защищает и от оспы обезьян, была прекращена с 1980 г. (Jezek et al.,1986; Wkly Epidemiol. Rec., 1997; Beigel et al., 2005);

- с продолжающимися эпидемическими вспышками гриппа птиц (A/H5N1) и оспы
обезьян (Борисевич и др., 2012; Levine et al., 2007; WHO, 2013);

с отсутствием исчерпывающей информации о резервуарах ВОО и в/пат ВГП A/H5N1 в природе (Causey, Edwards, 2008; WHO, 2011);

с существующей возможностью распространения ВОО и в/пат ВГП A/H5N1 по всему миру и выраженной генетической изменчивостью особенно последнего, которая в любой момент может существенно увеличить контагиозность вызываемого им заболевания среди людей, приведя к пандемии (Борисевич и др., 2012; Imai et al., 2012; et al., 2012);

с отсутствием или ограниченностью спектра разрешенных к применению эффективных лечебно-профилактических химиопрепаратов от оспы обезьян и гриппа птиц (A/H5N1), а также вакцин против последнего (Седова и др., 2012; Magee et al., 2008; Jordan et al., 2010).

Для достижения успеха при проведении противоэпидемических мероприятий, направленных на борьбу с оспой обезьян и гриппом птиц (А/H5N1), необходимы высокоэффективные средства медицинской защиты. При этом испытания протективных свойств данных средств на начальных этапах (научно-исследовательская работа и доклинические исследования) должны проводиться в экспериментах in vivo на модельных биосистемах, включающих в себя актуальные вирулентные для людей штаммы ВОО и в/пат ВГП А/H5N1, а также доступные виды животных, воспроизводящие соответствующий инфекционный процесс у человека. Регулярное появление новых штаммов этих вирусов, регистрируемых во время вспышек заболеваний у людей и животных, делает актуальной проблему совершенствования таких модельных биосистем.

Степень разработанности. К началу данного исследования известны модельные биосистемы для оспы обезьян, созданные на основе шести видов животных: иммуноде-фицитных мышей (Americo, Moss, Earl, 2010; Hutson et al., 2010; Stabenow et al., 2010),

сусликов (Spermophilus tridecemlineatus) (Tesh et al., 2004; Sbrana et al., 2007a,b), луговых собачек (Cynomys ludovicianus) (Xiao et al., 2005; Hutson et al., 2009, 2010), сонь Келлена (Graphiurus kelleni) (Schultz et al., 2009) и низших приматов (Macaca cynomolgus и mulatta) (Zaucha et al., 2001; Parker, Handley, Buller, 2008; Chapman et al., 2010). Тем не менее, все эти модельные виды животных имеют те или иные недостатки, касающиеся возможности их воспроизводства в неволе, дороговизны, удобства и адекватности их применения при моделировании оспы обезьян у людей:

иммунодефицитная мышь, соня Келлена и суслик при инфицировании ВОО не воспроизводят основную симптоматику оспоподобного заболевания; первая может лишь частично моделировать инфекционный процесс у людей с подавленной иммунной системой, доля которых во время эпидемических вспышек оспы обезьян, вероятно, не очень значительна, и вряд ли может быть использована для оценки активности противовирусных средств, в основе действия которых заложен механизм их влияния на систему иммунитета; кроме того, инбредные мыши дорогие и имеют слабовыраженное генетическое разнообразие, в то время как человеческая популяция по существу представляется аут-бредной (межрасовое скрещивание, межнациональное и межсемейное); соня Келена и суслик относительно дорогие, не являются лабораторными животными и требуют специальных условий при проведении экспериментов;

низшие приматы и луговая собачка, хотя и воспроизводят при инфицировании ВОО симптоматику оспоподобного заболевания, однако первые виды используются с высокими дозами ВОО (7 lg БОЕ – бляшкообразующая единица) для оценки защитной эффективности химиопрепаратов (Stittelaar et al., 2006; Huggins et al., 2009; Jordan et al., 2009), являются дорогими животными, применение которых в экспериментах сопряжено с большими трудозатратами, а второй вид плохо приживается в неволе и поэтому для экспериментов доставляется, как правило, из естественной среды обитания: Северная Америка (Свободная энциклопедия), что порождает необходимость проведения у него оценки состояния здоровья, а также наличия/отсутствия антител к ортопоксвирусам.

Из мелких лабораторных животных, удобных для оценки эффективности разрабатываемых для человека препаратов против гриппа птиц (А/H5N1), чаще всего использовали инбредных мышей (BALB/c), а также вирусные штаммы, которые не являются актуальными для России, так как они были выделены на территории зарубежных стран (Yen et al., 2005; Koudstaal et al., 2009; Kitano et al., 2013).

Цели и задачи. Целью настоящих исследований явилась разработка модельных биосистем на основе актуальных высоковирулентных для человека штаммов вирусов, а также доступных и адекватных при воспроизведении болезни у людей видов животных для оценки защитной эффективности препаратов от оспы обезьян и гриппа птиц (А/H5N1). Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи:

разработать стратегию поиска модельных биосистем для изучения защитной эффективности препаратов от оспы обезьян и гриппа птиц (А/H5N1);

провести экспериментальную и прогнозную оценку чувствительности человека и подопытных животных в отношении патогенных ортопоксвирусов и в/пат ВГП А/H5N1 и выбрать для кандидатных модельных биосистем применительно к оспе обезьян и гриппу птиц (А/H5N1) соответствующие штаммы и виды модельных животных для дальнейшего изучения;

изучить динамику диссеминации ВОО и в/пат ВГП А/H5N1 в организме канди-датных модельных видов животных;

- исследовать патоморфологические изменения, включая выявление клеток-
мишеней, в организме кандидатных модельных видов животных, инфицированных ВОО
или в/пат ВГП А/H5N1;

- оценить возможность использования кандидатных модельных биосистем для
изучения защитной эффективности препаратов от оспы обезьян и гриппа птиц (А/H5N1);

- провести испытания и определить пределы практического применения модель
ных биосистем для оспы обезьян и гриппа птиц (А/H5N1).

Научная новизна:

1. определена чувствительность при интраназальном (и/н) заражении аутбредных мышей ICR и степных сурков к ВОО (центральноафриканский - ц/афр штамм V79-1-005) в виде величины ID₅₀ (50 %-я инфицирующая доза), оцененной по наличию соответственно инфекционного процесса в легких или внешней клинической картины оспопо-добного заболевания; на основе данных относительно чувствительности первичных клеток-мишеней животных определены прогнозные значения ID₅₀ ВОО для сурков и мышей, а также вируса натуральной оспы - ВНО (штамм Ind-3a) для аутбредных мышей ICR; в опытах in vitro с применением первичных моноцитов-макрофагов человеческой крови оценено прогнозное значение ID₅₀ ВНО в отношении людей;

2. изучен патогенез оспы обезьян у и/н инфицированных ВОО (штамм V79-1-005) степных сурков и аутбредных мышей ICR с учетом динамики накопления патогена у животных этих видов (выявленные первичные и вторичные органы-мишени), патологических изменений и идентифицированных видов клеток-мишеней;

3. определена чувствительность по ЛД₅₀ при и/н и аэрозольном заражении аут-бредных мышей ICR и кур генетической линии Род-Айланд к ВГП А/H5N1 (штаммы A/Chicken/Kurgan/05/2005, A/Chicken/Crimea/04/2005, A/Chicken/Omsk/2006, A/Chicken/Krasnodar/02/2006, A/Chicken/Dagestan/2006, A/Duck/Kurgan/08/2005, A/Turkey/Suzdalka/Nov-1/2005 и A/Chicken/Suzdalka/Nov-11/2005); по данным опытов in vitro с применением первичных клеток легких человека оценены прогнозные величины ID₅₀ в/пат ВГП A/H5N1 (штаммы A/Chicken/Suzdalka/Nov-11/2005 и A/Chicken/Kurgan/05/2005) для людей; приведены результаты сравнительного изучения чувствительности кур по ЛД₅₀ ВГП А/H5N1 (штамм A/Chicken/Suzdalka/Nov-11/2005) при различных способах инфицирования: внутривенный, аэрозольный, и/н, оральный и интрагастральный;

4. представлен патогенез гриппа птиц (А/H5N1) у и/н зараженных в/пат ВГП А/H5N1 (штамм A/Chicken/Kurgan/05/2005) аутбредных мышей ICR с учетом динамики накопления патогена у животных этого вида (выявленные первичные и вторичные органы-мишени), патологических изменений и идентифицированного типа клеток-мишеней; приведены результаты диссеминации в/пат ВГП А/H5N1 (штамм А/Chicken/Suzdalka/Nov-11/2005 и/или A /Chicken/Kurgan/05/2005) в организме и/н инфицированных кур генетической линии Род-Айланд и гусей генетической линии A. anser;

5. с использованием разработанных модельных биосистем («степной сурок – штамм V79-1-005 ВОО», «аутбредная мышь ICR – штамм V79-1-005 ВОО» и «аутбред-ная мышь ICR - штамм A/Chicken/Kurgan/05/2005 в/пат ВГП A/H5N1»), запатентованных нами (Патенты РФ № 2496149, 2526504, 2361917), представлены данные по оценке про-тивооспенной и противогриппозной активности некоторых известных и разрабатываемых препаратов.

Теоретическая и практическая значимость работы:

созданная нами методология поиска модельных видов животных для вирусных инфекций, основанная на изучении показателей взаимодействия подопытных животных с возбудителем заболевания по сравнению с таковыми у людей (известных видов модельных животных), использована при разработке трех модельных биосистем по оценке защитной эффективности препаратов от оспы обезьян и гриппа птиц (A/H5N1);

разработанная нами методология поиска модельных видов животных для вирусных инфекций уже применялась для создания модельных биосистем («морская свинка – штамм GPA вируса вакцинии» и «аутбредная мышь ICR - штамм A/Salekhard/01/2009 вируса гриппа - ВГ A/H1N1pdm») с целью изучения протективной активности различных препаратов и может быть использована при поиске видов модельных животных для других инфекций вирусной природы;

разработанные нами модельные биосистемы «аутбредная мышь ICR – штамм V79-1-005 ВОО», «степной сурок - штамм V79-1-005 ВОО» и «аутбредная мышь ICR – штамм A/Chicken/Kurgan/05/2005 в/пат ВГП А/H5N1» были успешно применены на этапе доклинических испытаний российских противооспенного химического соединения НИОХ-14 и противогриппозного препарата Реаферон-ЕС-липинт, что открывает перспективу их дальнейшего изучения в клинических исследованиях;

разработанные нами модельные биосистемы «аутбредная мышь ICR – штамм V79-1-005 ВОО», «степной сурок - штамм V79-1-005 ВОО» и «аутбредная мышь ICR – штамм A/Chicken/Kurgan/05/2005 в/пат ВГП А/H5N1», а также методические рекомендации (МР) по их применению (МР 4.2.001-16, МР 4.2.002-16, МР 4.2.004-16 Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» - ГНЦ ВБ «Вектор») могут быть взяты для изучения защитной активности других препаратов от оспы обезьян и гриппа птиц (А/H5N1);

ранее существующий подход прогнозной оценки величины ID₅₀ вируса, основанный на применении первичных клеточных культур животных и человека и продемонстрировавший при его использовании адекватность результатов таковым, полученным в прямых экспериментах на животных, может быть взят для исследования чувствительности разных видов млекопитающих к патогенным ортопоксвирусам и в/пат ВГП A/H5N1;

прогнозные величины ID₅₀ ВНО (штамм Ind-3a) для аутбредных мышей ICR, определенные на основе экспериментов (in vitro), уже использованы при создании модельной биосистемы для оценки защитного действия препаратов от натуральной оспы;

прогнозные величины ID₅₀ ВНО, ВОО и в/пат ВГП A/H5N1 для людей, определенные на основе экспериментов (in vitro), могут быть полезными при поиске модельных биосистем не только для изучения защитной эффективности препаратов от соответствующих инфекций, но и для оценки показателей их патогенеза и контагиозности;

при работе с мышами, сурками, первичными культурами клеток человека и животных с применением ВОО и ВНО по сей день в ГНЦ ВБ «Вектор» руководствуются методами, представленными в созданной нами инструкции № 1/02;

в организациях, проводящих работы с возбудителями особо опасных инфекций, руководствуются разработанной нами методологией подготовки фрагментов органов и тканей от животных, инфицированных этими патогенами, для проведения патоморфоло-гического изучения (методические указания - МУ 1.3.3103-13 Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека – Роспотребнадзор), которая обеспечивала гарантированную инактивацию жизнеспособного ВОО в этих биоматериалах при исследовании на остаточную инфекционность;

- в организациях, проводящих работы с в/пат ВГ типа А, руководствуются разработанной нами методологией забора и приготовления биологических образцов от людей, инфицированных этим патогеном, для вирусологических исследований (временные МУ Роспотребнадзора от 01.05.2009 г. №01/5963-9-23 и МУ Роспотребнадзора от 24.05.2009 г. №01/7161-9-34).

Методология и методы исследования. При поиске модельных видов животных для гриппа птиц (A/H5N1) и оспы обезьян в работе применяли методологию, основанную на оценке показателей взаимодействия подопытных животных с возбудителями этих заболеваний при заражении через дыхательный тракт для сравнения с таковыми у людей (известных модельных видов животных).

Для оценки чувствительности первичных клеток-мишеней подопытных животных и людей в отношении патогенных ортопоксвирусов и в/пат ВГП A/H5N1 применяли ранее созданный нами подход по приготовлению этих клеток и проведению экспериментов in vitro. В ряде случаев была взята методология прогнозного определения значений ID₅₀ ВОО, ВНО и в/пат ВГП A/H5N1 для животных и людей, базирующаяся на использовании их первичных клеток-мишеней для этих патогенов. В работе также были применены следующие методы исследований: вирусологические, культуральные, гистологические, электронно-микроскопические, серологические, молекулярно-генетические, аэрозольные и статистические.

Положения, выносимые на защиту. В рамках данной работы выносятся на защиту следующие положения:

1. при и/н и подкожном (п/к) заражении ВОО (штамм V79-1-005) степные сурки воспроизводят внешнюю клиническую симптоматику оспоподобного заболевания, включая наличие гибели;

2. аутбредные мыши ICR чувствительны к штамму V79-1-005 ВОО: величина ID₅₀ вируса по его наличию в легких животных через 7 суток после заражения и/н способом составляет 2,4 (2,0…2,8) lg БОЕ;

3. органами первичной репродукции ВОО (штамм V79-1-005) при и/н заражении степных сурков в дозе 3,7 lg БОЕ являются легкие и трахея, а основной механизм диссе-минации патогена в организме этого вида животных - лимфогенный с размножением в лимфатических органах;

4. аутбредные мыши ICR после и/н введения 25 ID₅₀ ВОО (штамм V79-1-005) демонстрировали генерализованную инаппарантную форму инфекции с основным гематогенным механизмом диссеминации патогена, связанным с его репликацией в клетках кровеносной системы и крови;

5. у степных сурков после и/н заражения ВОО (штамм V79-1-005) воспалительно-некротические изменения происходят как в органах дыхательной системы, так и в других, а у аутбредных мышей ICR данный вид поражения в основном сосредоточен в респираторных органах;

6. у степных сурков и аутбредных мышей ICR в результате и/н инфицирования ВОО (штамм V79-1-005) размножение вируса происходит в первичных клетках-мишенях (макрофагах и эпителиоцитах дыхательных органов), а также в других видах клеток (гладкомышечных и ретикулярных, плазмоцитах, эндотелиоцитах, фибробластах);

7. изученные восемь штаммов в/пат ВГП А/Н5N1, выделенные от птиц на территории России, достоверно не различаются между собой по вирулентности (летальной активности) для кур генетической линии Род-Айланд при аэрозольном и и/н заражении;

8. наиболее высокая чувствительность кур генетической линии Род-Айланд к в/пат ВГП A/H5N1 (на примере штамма A/Chicken/Suzdalka/Nov-11/2005), судя по летальному

эффекту, наблюдается при аэрозольном заражении, которая выше примерно в 30 раз, чем при и/н, в 500 раз, чем при оральном, и в 10000 раз, чем при интрагастральном;

9) исследованные штаммы в/пат ВГП А/Н5N1 для аутбредных мышей ICR при и/н
заражении обладают разной степенью летальной активности и подразделяются на три
группы: высоковирулентная (LD₅₀ - 50 %-я летальная доза < 3,0 lg ЭИД₅₀ – 50%-я эмбри
ональная инфицирующая доза) - A/Chicken/Kurgan/05/2005, A/Chicken/Crimea/04/2005,
A/Chicken/Omsk/2006, A/Chicken/Krasnodar/02/2006, A/Chicken/Dagestan/2006; средней
степени вирулентности (LD₅₀ = 3,0–4,5 lg ЭИД₅₀) - A/Duck/Kurgan/08/2005; авирулентная
(LD₅₀ > 4,5 lg ЭИД₅₀) - A/Turkey/Suzdalka/Nov-1/2005 и A/Chicken/Suzdalka/Nov-11/2005;

10) у аутбредных мышей ICR при и/н инфицировании в/пат ВГП A/H5N1 (штаммы
A/Chicken/Kurgan/05/2005, A/Duck/Kurgan/08/2005 и A/Chicken/Suzdalka/Nov-11/2005)
первичные органы-мишени респираторного тракта находятся в нижнем его отделе, а у
кур генетической линии Род-Айланд – в верхнем, при этом генерализация инфекционно
го процесса у этих видов животных, сопровождающаяся внешней клинической симпто
матикой, происходит в основном путем гематогенного распространения патогена;

11) и/н инфицирование аутбредных мышей ICR в/пат ВГП А/H5N1 (штамм
A/Chicken/Kurgan/05/2005) вызывает воспалительно-некротические изменения в трахее и
слизистой носа, а также аналогичный вид поражения, кровоизлияния и тромбоз крове
носных капилляров - в легких, головной мозге, почках и селезенке; в легких размножение
вируса происходит в эпителиоцитах;

12) модельные биосистемы «степной сурок – штамм V79-1-005 ВОО», «аутбредная
мышь ICR – штамм V79-1-005 ВОО» и «аутбредная мышь ICR - штамм
A/Chicken/Kurgan/05/2005 в/пат ВГП A/H5N1» могут быть использованы при оценке за
щитной активности разрабатываемых препаратов от инфекций человека, вызванных ВОО
и в/пат ВГП А/H5N1;

13) прогнозные величины ID₅₀ штамма Ind-3a ВНО, а также штаммов
A/Chicken/Suzdalka/Nov-11/2005 и A/Chicken/Kurgan/05/2005 в/пат ВГП A/H5N1 для лю
дей, оцененные в опытах in vitro с использованием человеческих первичных клеток-
мишеней для этих вирусов, составляют 1,0 (0,6…1,4) lg БОЕ, а также -2,4 (-2,8…-2,0) и -
2,5 (-2,9…-2,1) lg ЭИД₅₀ соответственно;

14) прогнозные значения ID₅₀ ВОО (штамм V79-1-005) для степных сурков и аут-
бредных мышей ICR, а также ID₅₀ ВНО (штамм Ind-3a) для аутбредных мышей ICR, оце
ненные в опытах in vitro с применением их первичных клеток-мишеней для этих вирусов,
согласуется с таковыми, полученными при и/н заражении этих животных.

Степень достоверности и апробация результатов. Результаты исследований обработаны с использованием стандартных статистических методов (Закс, 1976) и пакета компьютерных программ «Statistica 6.0» (StatSoft Inc. 1984-2001) (Халафян, 2010) с определением достоверности отличий на 5 %-м уровне значимости.

Результаты работы были доложены на 19 российских и международных научных конференциях, конгрессах и митингах. В общей сложности в рамках тематики данной диссертации было получено 7 патентов Российской Федерации (РФ), опубликовано 20 статей в отечественных изданиях, 8 статей в зарубежных журналах, а также 2 монографии.

Личный вклад соискателя: в разработке стратегии подбора модельных биосистем для изучения защитной эффективности препаратов от оспы обезьян и гриппа птиц (A/H5N1) у человека; в прогнозной и экспериментальной (in vitro) оценке чувствительности человека к ВОО, ВНО и в/пат ВГП A/H5N1 (при участии Сергеева Ал.А. – научный сотрудник отдела «Коллекция микроорганизмов»); в экспериментальной (in vitro) оценке

чувствительности сурков и мышей к ВОО; в экспериментальной (in vitro) оценке чувствительности сурков и мышей к ВНО (при участии Овчинниковой А.С. – младший научный сотрудник отдела «Коллекция микроорганизмов»); в экспериментальной (in vivo) оценке чувствительности сурков, мышей, мини-свиней и кроликов к ВОО (при участии Сергеева Ал.А. – научный сотрудник отдела «Коллекция микроорганизмов»); в экспериментальной (in vivo) оценке чувствительности кур, гусей и мышей к в/пат ВГП A/H5N1; в изучении динамики распространение ВОО у инфицированных сурков и мышей; в изучении динамики распространение в/пат ВГП A/H5N1 в организме инфицированных кур, гусей и мышей; в изучении патологических изменений в органах и тканях, инфицированных ВОО или в/пат ВГП A/H5N1 кандидатных модельных животных (при участии Таранова О.С. - заведующий отделом микроскопических исследований); в проведении сравнительной оценки исследованных показателей взаимодействия кандидатных видов модельных животных с ВОО или в/пат ВГП A/H5N1 при заражении через дыхательный тракт с таковыми у человека (известных видов модельных животных); в использовании разрабатываемых модельных биосистем «степной сурок – штамм V79-1-005 ВОО», «аутбредная мышь ICR - российский в/пат штамм A/Chicken/Kurgan/05/2005 ВГП A/H5N1» и «аутбредная мышь ICR – штамм V79-1-005 ВОО» с цель оценки возможности применения для изучения защитной эффективности препаратов от оспы обезьян и гриппа птиц (A/H5N1) (при участии Сергеева Ал.А. и Овчинниковой А.С. - сотрудники отдела «Коллекция микроорганизмов», а также Кабанова А.С. – научного сотрудника отдела профилактики и лечения особо опасных инфекций).

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 332 страницах машинописного текста, включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение (3 раздела), заключение с выводами, список сокращений и условных обозначений, список литературы и список иллюстративного материала. Работа иллюстрирована 39 таблицами и 46 рисунками. Список литературы содержит 464 источника, в том числе 385 зарубежных статей.

Чувствительность человека и мышей и их первичных клеточных культур к вирусу гриппа птиц

ВОО является зооантропонозом и принадлежит к роду Orthopoxvirus семейства Poxviridae. ВОО был впервые изолирован в Государственном институте сывороток в г. Копенгаген (Дания) в 1958 году во время изучения болезни у яванских макак, схожей с натуральной оспой. Один из выделенных штаммов получил название Copenhagen и впоследствии был использован, как референс-штамм этого вируса [100]. В последующем аналогичные вспышки заболевания среди обезьян, содержавшихся в неволе, продолжали регистрироваться в ряде стран: Соединенные Штаты Америки (США) [316, 352], Нидерланды [347] и Франция [307].

В 1971 г. было представлено первое сообщение [5] о том, что ВОО может вызывать заболевание у людей, клинически напоминающее натуральную оспу. Спустя некоторое время была исследована географическая зона, на которой регистрировалась оспа обезьян у людей. Данная территория охватывала экваториальную часть западной и центральной Африки. Стало известно, что не все штаммы ВОО имеют одинаковую вирулентность для человека: те, которые были выделены от больных людей в центральной Африке были более вирулентными, чем в западной [108].

Вирус гриппа (ВГ), так же как и ВОО, относится к зооантропонозам и принадлежит к семейству Orthomyxoviridae. За последние 100 лет было зарегистрировано четыре пандемии гриппа: в 1918 г., вызванная ВГ А/H1N1, в 1957 г., – А/H2N2, в 1968 г., – А/H3N2 и в 2009 г., – А/H1N1pdm. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), ежегодно в эпидемии сезонного гриппа обычно вовлекается около 1 миллиарда людей Земного шара, из которых 3–5 млн. человек имеет тяжелые формы заболевания, а 300– 500 тыс. из них погибает [289]. Практически не отличалась от них и пандемия гриппа 2009 г., вызванная ВГ А/H1N1pdm09, по широте охвата населения Земного шара (11–21 %) и показателю летальности (284,5 тыс. человек) [201, 378]. ВГ А/H1N1pdm09, явив 18 шийся причиной пандемии в 2009 г., в дальнейшем заменил человеческий сезонный ВГ А/H1N1 и вместе с другими сезонными ВГ А/H3N2 и В вызывает с 2009 года эпидемии [329].

Впервые человеческий штамм в/пат ВГП А/H5N1 был выделен в 1997 г. в Гонконге от 3-летнего мальчика, умершего от гриппозной пневмонии, осложненной синдромом Рейе [137, 148, 154]. В дальнейшем и по настоящее время регистрируются спорадические случаи заболевания среди людей, вызванного этим субтипом вируса. При этом отмечаются одиночные случаи передачи возбудителя заболевания от человека к человеку лишь при тесном контакте. Однако ряд ученых в экспериментальных целях провел работы с использованием методов точечного мутагенеза (4 мутации в гене НА и 1 – в гене PB2) и реассортации (замена 7 генов ВГП А/H5N1 на таковые ВГ А/H1N1pdm09) по созданию вариантов ВГП А/H5N1, обладающих способностью связываться не только с рецепторами сиаловой кислоты (CA) с -2,3 связью к галактозе, но и с рецепторами СА с -2,6 связью к галактозе и передаваться воздушно-капельным путем между хорьками. Эти результаты показали принципиальную возможность возникновения в природе новых генетически измененных вариантов этого вируса с пандемическим потенциалом [89, 208].

Из 144 известных субтипов ВГП (Н1–16 и N1–9), которые делят на высоко- и низкопатогенные c учетом величины внутривенного индекса патогенности для кур (IVPI) [167], 103 циркулирует в настоящее время среди дикой и домашней птицы [294] у более 100 видов птиц [134], вызывая летальный эффект у более 40 видов, включая 3 домашних (куры, индюки и страусы). Причем известно, что 9 субтипов этого вируса вызывали заболевание у людей: - в/пат ВГП А/H5N1 в Гонконге, Азербайджане, Бангладеш, Китае, Джибути, Египте, Индонезии, Ираке, Камбодже, Лаосе, Мьянмаре, Нидерландах, Пакистане, Таиланде, Турции и Вьетнаме (более 700 случаев с летальностью около 60 %) [138, 273]; - низкопатогенный ВГП А/H7N2 (4 случая без гибели) в США в 2004 г. и Великобритании в 2007 г. [115, 136]; - высоко- и низкопатогенный ВГП А/H7N3 (12 случаев без гибели) в Италии в 1999–2003 г., Канаде в 2004 г., Великобритании в 2006 г. и Мексике в 2012 г. [135, 136, 332]; - высоко- и низкопатогенный ВГП А/H7N7 (93 случая, включая один летальный) в Великобритании в 1959, 1977 и 1996 г. и Нидерландах в 2003 г. [131, 288, 410, 431]; - низкопатогенный ВГП А/H7N9 (251 случай, включая 56 летальных в период с февраля по май 2013 г., 199 случаев в период с октября 2013 по май 2014 г.) в Китае в 2013 г. [435]; - низкопатогенный ВГП А/H9N2 (15 случаев без гибели) в Китае, Гонконге в 1998–1999, 2003, 2007, 2009, 2013 и 2014 г., а также в Бангладеш в 2011 г. [112, 253, 270, 356, 359, 460]; - низкопатогенный ВГП А/H6N1 (1 случай без гибели) в Китае в 2013 г. [333]; - низкопатогенный ВГП А/H10N7 (4 случая без гибели) в Египте в 2004 г., Австралии в 2010 г. [116, 275]; - низкопатогенный ВГП А/H10N8 (2 случая, включая 1 летальный) в Китае в 2013 и 2014 г. [357, 358].

Методы изучения инфекционного процесса в первичных клеточных культурах

В доступной нам научной литературе имеется мало информации о патоморфоло-гических изменениях у людей, умерших от оспы обезьян, и она в основном ограничена данными гистологических, макроскопических и электронно-микроскопических исследований кожных повреждений (элементов сыпи) [121, 414, 417], а также клиническим описанием лимфаденитов [146, 257, 258]. При этом, по данным электронной и световой микроскопии с учетом признаков репродукции ВОО в кератиноцитах регистрировали сходство с теми, которые наблюдались при натуральной оспе у людей [173]. Большинство исследователей отмечало отсутствие существенных различий между клиническими признаками оспы обезьян у человека и натуральной оспы с обычным клиническим типом, а также модифицированным [146, 158, 387], что делает возможным использование результатов исследования патогенеза этих инфекций, как взаимодополняющих друг друга. Причем несколько больше информации в научной литературе имеется в отношении патологических изменений, наблюдаемых при натуральной оспе у людей и описанных всего в трех публикаций [127, 166, 293], которые основывались на результатах описания 168 случаев смерти людей от натуральной оспы с обычным клиническим типом и 43 – с геморрагическим клиническим типом (ранний – 30, поздний – 13), а также на сведениях из разных информационных источников.

В обобщенном виде данные этих исследований представлены в обзорной статье [158]. У людей при натуральной оспе поражалось большинство исследованных органов и тканей, и патологические очаги пролиферативного и воспалительно-некротического типов часто с кровоизлияниями наблюдались в коже, легких, селезенке, миндалинах, красном костном мозге, лимфоузлах, печени, яичках, яичнике, почках, сердце и костях [127, 166, 293]. Причем их степень выраженности часто зависела от типа (клинического) заболевания: - при обычном, который напоминал оспу обезьян, данные изменения были в основном воспалительного и пролиферативного типов; - при геморрагическом – воспалительно-некротического типа с тромбозами сосудов и геморрагиями.

В крайне скудном объеме представлена и информация по изучению некоторых показателей крови при оспе обезьян у людей, которая ограничивалась результатами исследований, поведенных во время эпидемической вспышки этого заболевания в 2003 г. в США. Причем у 45 % заболевших был отмечен лейкоцитоз (9,13–26,8) 109/л, у 35% -снижение уровня тромбоцитов (90–143) 109/л и у 50% – гипоальбуминемия 11–34 г/л [146]. Результаты этих исследований напоминали те, которые наблюдали у больных натуральной оспы с обычным клиническим типом [239, 265, 433]. При изучении спинномозговой жидкости в разгар заболевания у больного оспой обезьян зарегистрировали повышенную концентрацию лейкоцитов (21 кл./мм3) за счет увеличения процента поли-морфонуклеаров (60) [260]. Если для человека при оспе обезьян данных о патологических изменениях было очень мало, то для известных модельных видов животных такая информации была приведена в достаточно внушительном объеме, и касалась луговых собачек [161, 213, 217, 318], Macaca cynomolgus [96, 98, 106, 152, 153, 155, 210, 241, 280, 291, 315, 331, 341, 402, 424, 453], Macaca mulatta [349, 388], сусликов [156, 193, 211], африканских сонь [209] и мышей SCID/BALB, а также C57BL/6 stat1-/- и 129 stat1-/- [92, 162]. При этом патологические изменения у этих модельных для оспы обезьян видов животных, инфицированных ВОО разными способами, напоминали таковые у людей с обычным клиническим типом натуральной оспы. При осуществлении световой и электронной микроскопии, в том числе иммуногистохимии и иммунофлуоресценции, органов и тканей зараженных ВОО животных исследователям удалось идентифицировать клетки-мишени для возбудителя заболевания, спектр которых был представлен достаточно широко и в основном совпадал с описанным для многих других ортопоксвирус-ных болезней: макрофаги, эпителиоциты, плазмоцитах, эндотелиоциты, фибробласты, клетки ретикулярные и гладкомышечные, кератиноциты, перициты, клетки соединительной ткани, клетки Купфера, моноциты, гепатоциты, дендритные клетки.

Таким образом, все известные модельные для оспы обезьян виды животных (луговые собачки, Macaca cynomolgus и mulatta, суслики, иммунодефицитные мыши и африканские сони) после респираторного и других способов заражения в определенной степени воспроизводили картину патологических изменений в органах и тканях, отмеченную при оспе обезьян у людей и натуральной оспе с обычном клиническим типом: воспалительно-пролиферативные очаги и некротические иногда с геморрагиями.

В научной литературе имеется много информации, касающейся изучения патологических изменений у больных и умерших людей от инфекции, вызванной сезонным ВГ, включая ВГ А/H1N1pdm09, и в/пат ВГП А/H5N1, которая в обобщенном виде представлена в некоторых обзорах [157, 225, 423].

Сезонный грипп, протекающий обычно у людей без осложнений, вызывает легкое воспаление в органах верхних отделов дыхательного тракта (ринит, параназальный синусит, фарингит и ларингит) и нижнего (диффузный поверхностный некротизирующий трахеобронхит с десквамацией эпителиальных клеток, отеком, гиперемией и инфильтрацией лимфоцитами и гистиоцитами). При этом эпителиальная регенерация чаще всего начиналась через 2 суток после появления первых симптомов заболевания [130]. В тоже время, при развитии осложнений наиболее часто при гриппе встречается вирусная пневмония с обширными уплотнениями разной степени выраженности и кровоизлияниями с диффузными альвеолярными повреждениями. [165, 409, 411]. Патологические изменения в легких, наблюдаемые при гриппе, вызванном ВГ А/H1N1pdm09 и в/пат ВГП А/H5N1, как правило, имели ту же картину поражения (диффузные альвеолярные повреждения). При исследовании погибших людей от сезонного и пандемического гриппов чаще, чем при гриппе птиц (А/H5N1), регистрировали признаки воспаления в носу, трахее, бронхах и бронхиолах [234, 248, 423]. Инфекция, вызванная в/пат ВГП А/H5N1, регулярно сопровождалась поражением и органов других систем организма человека: гистоцитарная гиперплазия лимфоидной ткани лимфоузлов; реактивный гема-фагоцитарный синдром; атрофия белой пульпы селезенки, центральнодолевые некрозы печени, острый тубулярный некроз почек, некроз волокон скелетных мышц и некроз ткани головного мозга с формированием микроглиальных узлов [82, 344, 366]. Заражение же людей сезонным ВГ А/H1N1, включая А/H1N1pdm09, редко приводило к гема-фагоцитозу, поражению нервно-мышечной и сердечной тканей и других экстрареспираторных органов [379, 398].

С помощью иммуногистохимического и вирусологического методов в органах респираторного тракта людей, включая умерших от гриппа, были выявлены клетки-мишени для ВГ А/H1N1pdm09 и в/пат ВГП А/H5N1, которыми являются эпителиоциты [53, 111, 251, 274, 382]. Причем, если сезонный ВГ А/H1N1, включая А/H1N1pdm09, преимущественно размножался в реснитчатых клетках и альвеолоцитах 1 и 2-го порядка, то в/пат ВГП А/H5N1 регистрировали в основном в пневмоцитах 2-го порядка, а также в эндотелиоцитах кровеносных капилляров легких людей. В отношении участия макрофагов в репродукции ВГ вопрос по настоящее время остается открытым (п. 1.3.2).

Грипп птиц (А/H5N1) в отличие от сезонного гриппа более часто сопровождается у человека лейкопенией, лимфопенией, тромбоцитопенией, повышением уровней амин-трансфераз [113, 114, 199] и выбросом в кровь большого количества цитокинов (цито-киновый шторм): фактор некроза опухоли - , интерликин-6 и 10, -гамма-интерферон и др. [222, 267, 355]. Причем появление острого респираторного дистресс-синдрома и синдрома полиорганной недостаточности при гриппе может быть связано именно с ци-токиновым штормом, индуцированным, по всей видимости, гемофагоцитарным синдро 55 мом [344, 366], степень выраженности которого, в свою очередь, прямо коррелировала с концентрацией вируса в респираторном тракте людей (в глотке) [222]. Например, инфекционный процесс, происходящий в эндотелиальных клетках капилляров легких, сопровождался мощным выбросом цитокинов и хемокинов [197]. В свою очередь цитоки-новый шторм может привести в организме к активному тромбообразованию [104, 218], которое даже встречалось у людей (5,9 % случаев), госпитализированных во время пандемии гриппа, вызванной ВГ А/H1N1pdm [337].

Многие ученые занимались вопросом изучения патологических изменений у различных подопытных видов животных, в том числе модельных (мыши, хорьки, крысы, включая хлопковые, морские свинки, хомяки, свиньи, кошки, собаки и приматы), инфицированных в/пат ВГП А/H5N1 или ВП А/H1N1pdm09 [240, 304, 423]. Результаты этих исследований напоминали таковые у больных и умерших людей от сезонного гриппа, включая пандемический (А/H1N1pdm09), и гриппа птиц (А/H5N1). Больше всего информации в этом направлении было получено на лабораторных мышах. Некоторые данные в сравнительном плане, касающиеся изучения патологических изменений у этого вида животных, инфицированных ВГ А/H1N1, А/H1N1pdm09 и ВГП А/H5N1, приведены в таблице 1.3.

Прогнозная оценка чувствительности к патогенным ортопоксвирусам человека и подопытных животных

Приготовление органов, тканей и сыворотки крови от сурков, инфицированных вирусом оспы обезьян. В процессе изучения накопления ВОО у 5 из 16 сурков, павших после п/к заражения вирусом дозами 5,6 и 7,1 lg БОЕ, отбирали образцы следующих тканей и органов: носовая перегородка со слизистой; легкие; трахея; сердце; печень; почки; поджелудочная железа; селезенка; головной мозг; подмышечные, под-нижнечелюстные, паховые и брыжеечные лимфоузлы; кусочки кожи с оспенными элементами; яички и яичники. Для микроскопических исследований у этих и двух интакт-ных животных осуществляли забор образцов тех же тканей и органов. При изучении распространения ВОО и патологических изменений в тканях и органах и/н инфицированных сурков давали дозу заражения вирусом 3,7 lg БОЕ/гол. (30 ID50, оцененную по внешней клинической картине заболевания этих животных). При этом осуществляли забор биоматериала (клетки крови, сыворотка крови, носовая перегородка со слизистой, головной мозг, трахея, бифуркационные лимфоузлы, легкие, печень, селезенка, поджелудочная железа, мезентериальные лимфоузлы, двенадцатиперстная кишка, почки, надпочечники и кожа), полученного от инфицированных сурков, используя по 1 животному на каждую точку по времени (2, 3, 5, 7, 9 и 12 суток п.и.). Для патологических исследований у этих и двух интактных животных брали те же образцы тканей и органов, а также дополнительно тимус. Забор крови у сурков осуществляли из вены на поверхности голени без анестезии. Из крови при центрифугировании получали сыворотку, а также сгусток форменных элементов. Перед забором органов и тканей сурков подвергали эвтаназии, вводя внутривенно летальную дозу (100 мкг/кг) препарата «Золетил».

Для вирусологического исследования готовили гомогенаты органов и тканей (10 %-е), инфицированных ВОО сурков, методом механической деструкции пестиком в ступке в присутствии речного песка.

Приготовление органов, тканей и сыворотки крови от мышей, инфицированных вирусом оспы обезьян. Забор проб органов и тканей (за исключением крови) у мышей осуществляли, предварительно проводя процедуру эвтаназии с помощью церви-кальной дислокации. Для вирусологического исследования готовили гомогенаты органов и тканей (10 %-е), инфицированных ВОО мышей. В процессе изучения динамики накопления ВОО в легких мышей было использовано по 5 животных на каждую точку по времени (3, 5, 7 и 10 суток п.и. дозой вируса 5,0 lg БОЕ - 400 ID50, оцененной по регистрации наличия инфекционного процесса в легких), у которых брали целиком легкие для приготовления гомогенатов этих органов, объединяя соответствующие гомоге-наты для каждой временной точки. При проведении исследований по определению чувствительности мышей к ВОО и оценке эффективности действия испытываемых препаратов осуществляли забор легких у инфицированных мышей через 7 суток п.и. для приготовления гомогенатов и последующего вирусологического исследования каждого из них. При этом оценку активности противооспенных препаратов проводили на мышах, зараженных вирусом в дозе 2,4 или 3,4 lg БОЕ (1 или 10 ID50 соответственно). При изучении диссеминации ВОО по органам, тканям и сыворотке крови мышей, и/н зараженных вирусом дозой 3,8 lg БОЕ (25 ID50), было взято по 4 животных на каждую точку по времени (2, 5, 7, 9 и 14 суток п.и.). У данных мышей делали забор крови из ретроорби-тального венозного синуса под эфирным наркозом, из которой центрифугированием получали сгусток форменных элементов и сыворотку. При этом из первого готовили гомогенат. Кроме того, от инфицированных животных брали биоматериал (носовую перегородку со слизистой, трахею, головной мозг, бифуркационные лимфоузлы, печень, легкие, селезенку, поджелудочную железу, двенадцатиперстную кишку и почки) и готовили гомогенаты. Каждый из приготовленных биоматериалов подвергали вирусологическому исследованию.

Для светооптического и электронно-микроскопического исследования органов и тканей мышей, и/н инфицированных ВОО дозой 3,8 lg БОЕ (25 ID50) забор биоматериала (клетки крови, головной мозг, носовая перегородка со слизистой, бифуркационные лимфоузлы, трахея, легкие, печень, поджелудочная железа, селезенка, брыжеечные лимфоузлы, двенадцатиперстная кишка, почки, надпочечники, кусочки кожи) осуществляли через 2, 5, 7, 9 и 14 суток п.и., используя по 4 животных на каждую точку по времени и контроль. При этом клетки крови получали ранее описанным способом. У мышей, и/н инфицированных ВОО дозой 5,0 lg БОЕ (400 ID50), и интактных забор биоматериала (легкие, трахея, носовая перегородка со слизистой) осуществляли через 3, 5, 7 и 10 суток п.и., используя также по 4 животных на каждую точку по времени и контроль.

Приготовление органов, тканей и сыворотки крови от кур, инфицированных вирусом гриппа птиц ВГП А/H5N1. При изучении динамики накопления штамма A/Chicken/Kurgan/05/2005 в/пат ВГП А/H5N1 в организме и/н инфицированных кур до 90 зой 3,2 lg ЭИД50 (10 LD50) соответственно (после проведения эвтаназии путем церви-кальной дислокации) готовили 10 %-е (по объему) гомогенаты биоматериалов (носовая перегородка со слизистой, трахея, легкие, пищевод, желудок, тонкий и толстый кишечник, печень, поджелудочная железа, почка, клоака, селезенка, головной мозг, поперечнополосатая мышечная ткань), а также сыворотку, полученную путем центрифугирования из сгустка крови, взятого из сердца. Данную процедуру осуществляли через 1, 18, 30, 42, 54 часа п.и., используя по 3 животных на временную точку и объединяя соответствующие гомогенаты для каждой временной точки. При изучении динамики накопления штамма А/Chicken/Suzdalka/Nov-11/2005 ВГП А/H5N1 в организме и/н инфицированных кур дозой 3,2 lg ЭИД50 (3 LD50) вируса работу проводили аналогично тому, как описано для кур, инфицированных штаммом A/Chicken/Kurgan/05/2005, с той лишь разницей, что набор отбираемых органов и тканей для приготовления гомогенатов был несколько сокращен (стенки носовой полости со слизистой трахея, легкие, пищевод, желудок, толстый и тонкий кишечник), и процедуру этого отбора осуществляли через 14, 24, 36 и 60 часов п.и.

Приготовление органов, тканей и сыворотки крови от гусей, инфицированных вирусом гриппа птиц ВГП А/H5N1. При изучении динамики накопления штамма A/Chicken/Kurgan/05/2005 в/пат ВГП А/H5N1 у домашних гусей, и/н инфицированных 5,5 lg ЭИД50, (после проведения эвтаназии путем цервикальной дислокации) были приготовлены 10 %-е гомогенаты следующих органов и тканей: легкие, носовая перегородка со слизистой, трахея, головной мозг, селезенка, почки, поджелудочная железа, кишечник, лимфоузел, клоака, испражнения, а также сыворотка, полученная путем центрифугирования сгустка крови, взятой из сердца. При этом отбор данного биоматериала осуществляли спустя 3, 5, 7, 10 и 15 суток п.и., используя по 3 птицы на временную точку и объединяя соответствующие гомогенаты для каждой временной точки.

Приготовление органов и тканей от мышей, инфицированных вирусом гриппа птиц А/H5N1. При изучении динамики накопления 3 штаммов A/Chicken/Kurgan/05/2005, A/Duck/Kurgan/08/2005 и A/Chicken/Suzdalka/Nov-11/2005 в/пат ВГП А/H5N1 у мышей, и/н инфицированных 2,1 lg ЭИД50 (10 LD50); 5,2 lg ЭИД50 (10 LD50) и 5,8 lg ЭИД50 (10 ID50, рассчитанная с учетом регистрации наличия вируса в легких животных через 5 суток после и/н заражения) соответственно, были приготовлены 10 %-е гомогенаты следующих органов и тканей: легкие, носовая перегородка со слизистой, трахея, головной мозг, селезенка, мочевой пузырь, почки, поперечнополосатая мышечная ткань и печень, а также гепаринизированная кровь. При этом отбор данного биоматериала осуществляли в течение 6–18 суток с интервалом в 1–8 суток, используя по 3 мыши на временную точку и объединяя соответствующие гомогенаты для каждой временной точки. Для патоморфологических исследований у мышей, и/н зараженных 2,1 lg ЭИД50 (10 LD50) штаммом A/Chicken/Kurgan/05/2005 в/пат ВГП А/H5N1, проводили забор различных тканей и органов (носовая перегородка со слизистой, трахея, легкие, пищевод, желудок, толстый и тонкий кишечник, почки, головной мозг), как правило, каждые сутки в течение 8 суток п.и., используя по 3 животных на временную точку. В качестве отрицательного контроля брали те же органы и ткани от 3 мышей, не инфицированных вирусом.

Оценка 50 %-х инфицирующих доз вируса для подопытных животных при респираторном заражении

Кроме того, с использованием МПКМС мыши была также оценена и нижняя граница ID50 этого вируса для данного вида животных: 1,0 (0,7…1,3) lg БОЕ в случае беспрепятственного взаимодействия его с клетками такого типа в организме мыши. Данное значение оказалось действительно достоверно более низким, чем то, которое было определено в экспериментах in vivo другими исследователями: 1,7 (1,3…2,1) lg БОЕ [439]. В обоих случаях во время оценки чувствительности к ВНО мышей и людей были использованы только клетки системы мононуклеарных фагоцитов (макрофаги), к которым была добавлена вируссодержащая жидкость. При заражении же человека и мышей через дыхательный тракт вероятность взаимодействия патогена с чувствительными клетками может быть существенно ниже за счет факторов неспецифического иммунитета или более разрозненного и широкого пространственного распределения таких клеток в легких по сравнению с их компактным размещением в монослое.

Кроме размножения ВНО у известных модельных видов животных (аутбредная мышь ICR и Macaca cynomolgus) в макрофагах [58, 215, 354], ряд ученых [215] также отмечал репродукцию этого патогена и в их клетках-предшественниках (моноцитах крови Macaca cynomolgus), но только при заражении этих животных внутривенно огромной дозой ВОО (9 lg БОЕ). Возможно, такое размножение этого патогена в моноцитах человека может тоже происходить, но только при геморрагическом клиническом типе натуральной оспы. Об этом свидетельствует факт регулярного обнаружения у людей в этом случае вируса в этой ткани в существенных концентрациях [239, 450, 456]. В противоположность этому, при обычном типе заболевания данный патоген в крови практически не обнаруживается [303, 362, 387]. В этой связи, скорее всего, у людей и двух известных видах модельных для натуральной оспы животных чувствительность макрофагов к ВНО выше, чем таковая их предшественника (моноцита), на это указывает также и то, что при менее высоких дозах заражения мышей и приматов исследователи не отмечали репродукции вируса в моноцитах крови [58, 243, 354].

Таким образом, репродукция ВНО наблюдалась в моноцитах-макрофагах и моно-нуклеарах крови человека, а также в мышиных селезеночных макрофагах, зараженных дозами вируса 0,002–0,017 БОЕ/кл. Данный процесс также регистрировался в клеточной культуре легких сурка, мыши и цыпленка, зараженной дозой ВНО 0,00001 БОЕ/кл. В то же время не было отмечено положительной динамики накопления данного патогена в монослое привлеченных мышиных перитонеальных макрофагов, инфицированных дозами 0,003 и 0,028 БОЕ/кл. ВВ при испытанной дозе 0,002 или 0,017 БОЕ/кл. не демонстрировал способности к репродукции в моноцитах-макрофагах крови человека. Определены величины CID50 ВНО в отношении моноцитов-макрофагов крови людей - 0,0 (-0,1…0,1) lg БОЕ, мышиных селезеночных макрофагов - 1,0 (0,7…1,3) lg БОЕ, а также в отношении клеточных культур легких сурков - 2,3 (1,8…2,8) lg БОЕ и мышей - 1,3 (0,8…1,8) lg БОЕ.

В своих экспериментах in vivo с использованием ВОО мы акцентировали внимание не только на внешней клинической картине болезни, но и на исследовании инфекционного процесса в легких (первичный орган-мишень для этого патогена) некоторых подопытных видов животных после респираторного заражения. При этом кроме традиционных видов лабораторных животных (разнополые 10–14-суточные аутбредные мыши ICR; 1,5-месячных кролики породы шиншилла), исследованию были подвергнуты и мини-свиньи породы Сибирская мини-свинья массой (4–8) кг, а также 1,5-месячные и 12–24-месячные сурки породы Байбак.

Применение мышей и кроликов раннего возраста для изучения чувствительности к ВОО обосновывалось тем, что первичные культуры клеток легких первого вида животных демонстрировали размножение этого вируса (п. 4.1.1.1), и оба этих вида могли быть экспериментально инфицированы данным возбудителем заболевания и/н и другими способами с последующим проявлением у них некоторых внешних клинических признаков заболевания, включая летальный исход [73, 100, 301], а так же то, что описано ранее (п. 4.1.1.1) в отношении мышей.

Использование мини-свиней для данных исследований было обусловлено (по сравнению со многими другими лабораторными видами животных) выраженным их сходством с людьми по анатомии, строению кожи и физиологии пищеварительной и сердечнососудистой систем [68]. Основанием для включения в исследования сурков явился обнаруженный нами факт размножения ВОО в первичных культурах клеток (п. 4.1.1.1) и то, что описано ранее (п. 4.1.1.1) в отношении этого вида животных.

В этой связи были проведены исследования по определению чувствительности кроликов, мини-свиней, мышей и сурков к ВОО в прямых экспериментах по респираторному (и/н) их заражению, в том числе и с целью сравнения величин этого показателя с таковыми, полученным в экспериментах in vitro. Применение именно этого метода инфицирования животных было связано с необходимостью имитации основных механизмов передачи оспы обезьян среди людей (аэрозольный и контактный), реализуемых в основном через дыхательный тракт во время эпидемических вспышек этого заболевания [122, 150, 333]. Результаты данных экспериментов представлены в таблицах 4.2 и 4.3. Отмечено, что и/н введение ВОО в дозах -1,0; 1,0; 3,0; 5,0; 5,5 lg БОЕ не вызывало летальности у мышей. Тем не менее, с 7-х суток п.и. у них отмечали внешние клинические признаки болезни (взъерошенность шерсти, блефарит и гнойный конъюнктивит), которые исчезали спустя 11–13 суток п.и. В этой связи для мышей был оценен параметр чувствительности к ВОО (таблица 4.2), который был рассчитан по наличию внешних клинических признаков инфекции у этих животных (ID50 = 4,8 lg БОЕ при заражении и/н способом). У сурков, и/н инфицированных ВОО, наблюдали целый комплекс клинических проявлений: подчелюстной лимфаденит (одно- или двусторонний), гипертермия тела, оспоподобная дискретная сыпь на слизистых оболочках и видимой части кожи на всей поверхности тела, серозно-гнойные ринит, блефарит и конъюнктивит, нарушение координации движения, повышенная агрессивность, тремор конечностей и взъерошен-ность шерсти. Данную симптоматику регистрировали через 7–9 суток п.и., а спустя 13– 22 суток п.и. лишь 5 из 12 заболевших сурков погибло. Причем у выживших животных клинические симптомы заболевания исчезали спустя 12–18 суток после появления, а на месте, где располагались оспоподобные сыпозные элементы были образованы рубцы. Важно отметить, что в проведенных нами экспериментах не удалось определить LD50 ВОО для заболевших животных, по той причине, что процент их гибели не зависел от значения заражающей дозы в интервале от 2,2 до 6,6 lg БОЕ (таблица 4.3). Тогда как процент инфицированности животных, регистрируемый по наличию симптоматики заболевания, имел выраженную зависимость «доза-эффект». Данное обстоятельство позволило нам оценить ID50 ВОО для этих животных по наличию внешних проявлений инфекции, которая составила 2,2 lg БОЕ (таблица 4.2).