Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 12
2.1 Роль регуляторов активности р53 в онкогенезе 12
2.1.1 Р53-ОСНОВНОЙ онкосупрессор человека 12
2.1.2 Set7/9 позитивный регулятор р53 15
2.1.3 Р53-независимые функции Set7/9 16
2.1.4 MDM2 - основной негативный регулятор р53 17
2.1.5 Структура MDM2 и его сплайс-изоформ 21
2.1.6 Р53-независимые онкогенные функции MDM2 23
2.1.7 MDM2 как онкосупрессор 25
2.1.8 Роль сплайс-изоформ MDM2 в онкогенезе 26
2.1.9 Ингибиторы взаимодействия р53 с MDM2 как потенциальные противоопухолевые препараты 28
2.2 Доксорубицин и цисплатин как широко применяемые генотоксические противоопухолевые агенты 30
2.2.1 Репарация ДНК как фактор эффективности генотоксической противоопухолевой терапии 30
2.2.2 Цисплатин 31
2.2.3 Доксорубицин 33
2.3 Одноуглеродный метаболизм и биосинтез нуклеотидов в раковых клетках как мишени для противоопухолевой терапии 34
2.3.1 Специфические изменения в метаболизме как характерная особенность раковых клеток 34
2.3.2 Одноуглеродный метаболизм 35
2.3.3 Нарушения одноуглеродного метаболизма и путей биосинтеза нуклеотидов в раковых клетках
2.3.4 Нарушение метаболизма серина и глицина в раковых клетках 41
2.3.5 Одноуглеродный метаболизм и биосинтез нуклеотидов как мишени противоопухолевой терапии 43
ГЛАВА II Материалы и методы
2.1 Клеточные культуры 45
2.1.1 Культивирование клеточных культур 45
2.1.2 Трансфекция клеток 45
2.1.3 Получение клеток с нокдауном SET7/9 и MDM2 46
2.1.4 Обработка клеток химиотерапевтическими препаратами
2.2 Выделение РНК и синтез кДНК 47
2.3 ПЦР в режиме «реального времени» 48
2.4 Получения ДНК-последовательностей основной, а так же сплайс-изоформ MDM2 49
2.5 Создание векторных конструкций, несущих делеционные варианты и изоформы MDM2 и Set7/9 для про- и эукариотической экспрессии 50
2.6 Создание векторных конструкций, кодирующих полноразмерную серингидроксиметилтрансферазу SHMT2 и отдельные её домены 52
2.7 Получение клеточного экстракта 53
2.8 Экспрессия и очистка рекомбинантных белков 53
2.9 Метод GST-pulldown 54
2.10. Масс-спектрометрия 54
2.11. Ко-иммуннопреципитация 2.12 Убиквитинилирование in vivo 55
2.13 Разделение белков в ПААГ и последующая окраска Кумасси 56
2.14 Вестерн-блоттинг 57
2.15 Оценка выживаемости клеток после обработки химиотерапевтическими препаратами 58
Глава III. Результаты 60
3.1 SET7/9 и MDM2 образуют петлю отрицательной обратной связи 60
3.1.1 Нокдаун Set7/9 повышает экспрессию MDM2 при генотоксическом стрессе 60
3.1.2 Экпрессия изоформ MDM2 по-разному влияет на восприимчивость клеток к генотоксическим агентам доксорубицину и цисплатину 62
3.1.3 MDM2 взаимодействует физически с SET7/9, а так же контролирует уровень его экспрессии 64
3.2 Определение интерактома MDM2 и SET7/9 66
3.2.1 Выявление спектра белков, ассоциированных с рекомбинантной метилтрансферазой Set7/9 66
3.2.2 Выявление спектра белков, ассоциированных с рекомбинантной ЕЗ-убиквитин лигазой MDM2
3.2.3 Анализ результатов GST pull down и отбор белков, играющих важную роль в онкогенезе 87
3.2.4 Верификация данных масс-спектрометрической идентификации ассоциированных с MDM2 белков с использованием иммунноблотинга 92
3.3 Влияние SET7/9 и MDM2 на ключевые факторы одноуглеродного метаболизма 94
3.3.1 Нокдаун Set7/9 повышает экспрессию MTHFD2 и SHMT2, а так же их транскрипционного регулятора с-Мус 94
3.3.2 Структурно-функциональной роль взаимодействия ЕЗ -убиквитин лигазы MDM2 с серингидроксиметилтрансферазой SHMT2 96
3.3.3 Set7/9 и MDM2 модулируют восприимчивость к ингибитору одноуглеродного метаболизма - метатрексату 100
ГЛАВА IV Обсуждение 103
4.1 MDM2 образует с Set7/9 петлю отрицательной обратной связи и контролирует восприимчивость клеток к генотоксическим химиопрепаратам.. 103
4.2 MDM2 и Set7/9 принимают участие в различных клеточных процессах и имеют общих интерактантов 107
4.3 MDM2 и Set7/9 контролируют экспрессию SHMT2 и MTHFD2 и влияют на устойчивость клеток к метатрексату 110
Основные выводы: 115
Список литературы 116
- Структура MDM2 и его сплайс-изоформ
- Обработка клеток химиотерапевтическими препаратами
- MDM2 взаимодействует физически с SET7/9, а так же контролирует уровень его экспрессии
- MDM2 и Set7/9 принимают участие в различных клеточных процессах и имеют общих интерактантов
Введение к работе
Актуальность исследования
Белок р53 является основным онкосупрессором человека. Нормальное функционирование р53-опосредуемых сигнальных путей несовместимо с жизнедеятельностью раковых клеток. Одним из позитивных регуляторов р53 является метилтрансфераза SET7/9, повышающая его транскрипционную активность (Chuikov et al. 2004). Помимо регуляции р53 SET7/9 играет важную роль при генотоксическом стрессе, модулируя пролиферативную активность транскрипционного фактора E2F1 (Lezina et al. 2014). Таким образом, SET7/9 обладает как про-, так и антипролиферативными свойствами.
Протоонкоген MDM2 является главным негативным регулятором важнейшего онкосупрессора человека — белка р53 (Xu et al. 2003). MDM2 является р53-специфичной ЕЗ убиквитин-лигазой, которая, убиквитинилируя р53, маркирует данный онкосупрессор для последующей его деградации в протеасоме (Fuchs, 1998). Данный биохимический процесс, предотвращающий р53-зависимую гибель нормальных клеток, часто служит раковым клеткам для защиты от р53-опосредованной регуляции (Jones et al. 1995). Ген, кодирующий MDM2, амплифицирован более чем в 19 типах раковых опухолей, что приводит к оверэкспрессии соответствующего белка. На сегодняшний день убедительно показана клиническая роль MDM2 в онкогенезе (Tovar et al. 2006), целый ряд ингибиторов MDM2-p53 взаимодействия проходят различные стадии клинических испытаний (Vassilev et al. 2004).
Помимо р53 MDM2 взаимодействует по меньшей мере с 200 различными белками (), являясь своеобразной точкой конвергенции различных сигнальных путей онкогенеза. Однако, помимо р53-зависимых и р53-независимых онкогенных функций, MDM2 обладает так же и онкосупрессорными свойствами (Manfredi, 2010). Например, MDM2 является негативным регулятором каталитической субъединицы фермента теломеразы (Zhao et al. 2005), препятствуя теломер-ассоциированному старению клеток, а так же транскрипционных факторов Snail (Lim et al., 2010) и Slug (Wang et al., 2009), ассоциированных с эпителиально-мезенхимальной транзицией и переходом к метастазированию. Кроме того, временная оверэкспрессия MDM2 приводит к остановке клеточного цикла при переходе из G1 в S фазу (Frum et al. 2014).
По-видимому, противоречивость в понимании функциональной значимости MDM2
4 привносит также наличие целого ряда сплайс-изоформ MDM2, обнаруживаемых исключительно в раковых клетках и негативно регулирующих основную изоформу. В отличие от амплификации гена MDM2, наблюдаемой в среднем в 7% опухолей, сплайс-изоформы MDM2 обнаружены в самых различных типах рака с частотой встречаемости от 30 до 90% (Okoro et al. 2012). При этом наличие сплайс-изоформ MDM2, как правило, ассоциируется с поздними стадиями развития опухолей (III и IV стадии), низкой степенью их дифференцировки и неблагоприятным прогнозом для пациентов (Rosso et al. 2014). Основными, помимо полноразмерного белка MDM2, являются изоформы MDM2-A, -В и -С. По большей части онкогенные свойства этих сплайс-изоформ MDM2 остаются неизученными.
В рамках данной работы впервые описано взаимодействие MDM2 и SET7/9 в структурно-функциональном контексте. Показано влияние MDM2 и SET7/9 на восприимчивость раковых клеток к действию ряда химиотерапевтических препаратов. С использованием протеомного подхода идентифицирован ряд интерактантов SET7/9 и сплайс-изоформ MDM2, принимающих участие в различных клеточных процессах, а так же продемонстрирована потенциальная вовлечённость MDM2 и SET7/9 в контроль одноуглеродного метаболизма за счет влияния на экспрессию ряда ключевых ферментов цикла превращений фолата. Выявлено, что, в отличие от основной изоформы MDM2, экспрессия сплайс-изоформ не оказывает никакого влияния на восприимчивость раковых клеток к химиотерапевтическим препаратам.
Учитывая растущий интерес исследователей к созданию ингибиторов MDM2 как к потенциальным противоопухолевым препаратам, необходимо как можно глубже понимать функциональную роль и молекулярные механизмы участия в онкогенезе как полноразмерного белка MDM2, так и его основных сплайс изоформ. Дальнейшее изучение структурно-функциональной роли ЕЗ убиквитин-лигазы MDM2 в модуляции устойчивости раковых клеток к важнейшим химиотерапевтическим препаратам, а так же в контроле одноуглеродного метаболизма и путей биосинтеза нуклеотидов, имеет важное практическое значение для разработки сочетанной терапии.
Цели и задачи исследования Цель:
Целью данной работы является изучение функциональной роли ЕЗ убиквитин-лигазы MDM2 и метилтрансферазы SET7/9 при генотоксическом и метаболическом стрессе. Задачи:
-
Оценить взаимовлияние регуляторов р53 - метилтрансферазы SET7/9 и ЕЗ убиквитин-лигазы MDM2 на экспрессию друг друга как на транскрипционном, так и на белковом уровнях;
-
Оценить влияние экспрессии метилтрансферазы SET7/9 и ЕЗ убиквитин-лигазы MDM2, а так же её сплайс-изоформ, на восприимчивость раковых клеток к химиотерапевтическим препаратам, вызывающим генотоксический и метаболический стресс;
-
Идентифицировать спектр белков, ассоциированных как с ЕЗ убиквитин-лигазой MDM2, так и метилтрансферазой SET7/9, используя протеомный подход;
-
Оценить влияние MDM2 и SET7/9 на экспрессию общих белков-интерактантов.
Основные положения, выносимые на защиту
1. В клетках существует петля отрицательной обратной связи метилтрансферазы SET7/9
и ЕЗ убиквитин-лигазы MDM2;
2. Экспрессия основной изоформы MDM2, в отличие от сплайс-изоформ, повышает
устойчивость клеток к генотоксическому химиопрепарату доке ору бицину, в то же
время повышает восприимчивость к другому генотоксическому препарату -
цисплатину, а так же ингибитору одноуглеродного метаболизма - метатрексату;
-
Идентифицирован целый ряд интерактантов метилтрансферазы SET7/9 и ЕЗ убиквитин-лигазы MDM2, а так же её сплайс-изоформ. Многие из них играют важное значение в онкогенезе и указывают на вовлечённость MDM2 и SET7/9 в различные клеточные процессы, в том числе в контроль одноуглеродного метаболизма;
-
MDM2 и SET7/9 вовлечены в контроль одноуглеродного метаболизма за счет влияния на экспрессию серингидроксиметилтрансферазы SHMT2 и метилентетрагидрофолатредуктазы MTHFD2 - ключевых ферментов цикла превращений фолата.
Научная новизна работы
В данной работе впервые показано существование в клетках потенциальной петли отрицательной обратной связи метилтрансферазы SET7/9 и ЕЗ убиквитин-лигазы MDM2. Так же продемонстрировано, что, в отличие от полноразмерной изоформы MDM2, экспрессия её основных сплайс-изоформ не модулирует устойчивость раковых клеток к важнейшим химиотерапевтическим препаратам. Идентифицирован целый ряд не известных ранее интерактантов метилтрансферазы SET7/9 и ЕЗ убиквитин-лигазы MDM2, а так же её основных сплайс-изоформ, участвующих в транскрипции, трансляции, процессинге РНК, метаболизме, образовании межклеточных контактов и играющих важную роль в онкогенезе. Кроме того, продемонстрирована потенциальная вовлечённость SET7/9 и MDM2 в контроль одноуглеродного метаболизма за счёт влияния на экспрессию ключевых ферментов цикла превращений фолата - серингидроксиметилтрансферазы SHMT2 и метилентетрагидрофолатредуктазы MTHFD2. Показано, что MDM2 является ЕЗ убиквитин-лигазой для серингидроксиметилтрансферазы SHMT2, приводя к её убиквитинилированию и последующей деградации.
Теоретическое и практическое значение работы Результаты данной работы вносят значительный вклад в фундаментальное понимание механизмов МБМ2-опосредованного онкогенеза. Исследование структурно-функциональной роли каждого конкретного, описанного в данной работе, взаимодействия MDM2 и SET7/9 с идентифицированными интерактантами представляет значительный интерес для понимания их роли в процессах злокачественного клеточного роста. Кроме того, данные о МБМ2-опосредованной негативной регуляции SHMT2 актуальны в практическом плане в контексте разработки и применения ингибиторов MDM2 и одноуглеродного метаболизма при разработке принципов сочетанной терапии.
Апробация работы По теме диссертации опубликовано 1 2 печатных работ, в том числе 4 статьи в рецензируемых международных и отечественных научных журналах из перечня изданий, рекомендованных ВАК РФ, а так же 8 тезисов докладов на международных и отечественных конференциях.
Объем и структура диссертации
Структура MDM2 и его сплайс-изоформ
Исследования, проводимые в течение более 30 лет, наглядно демонстрируют, что р53 является основным онкосупрессором человека. Белок р53, являясь транскрипционным фактором, предохраняет организм от развития раковых клеток за счет активации экспрессии различных генов, продукты которых участвуют в регуляции клеточного цикла, репарации ДНК, инициации старения и апоптоза (Чумаков, 2007).
При этом р53 не является необходимым для развития, дифференцировки и поддержания жизнедеятельности клеток. Так, нокаутные по р53 мыши успешно развиваются и имеют нормальный фенотип (Donehower et al. 1996). Однако они редко живут дольше восьми месяцев, так как погибают от образуемых опухолей. Белок р53 выступает одновременно в роли своеобразного сенсора «пороговых величин» различных клеточных процессов и в то же время инициирует клеточный ответ, пропорциональный этим «величинам», таким образом детерминируя судьбу клетки при протекании в ней процессов, отклоняющихся от нормы (Чумаков, 2007).
В нормальных условиях р53 является короткоживущим белком, который претерпевает убиквитин-зависимый протеолиз в протеасомах (Pant et al., 2003). При различных формах стресса, когда повреждается ДНК, активируются онкогены, возникает гипоксия и т.д. белок р53 претерпевает ряд ковалентных модификаций, включая метилирование и ацетилирование (Morgunkova, Barlev, 2006; Ivanov et al., 2007), что ведет к стабилизации и накоплению р53 в ядре клетки за счет потери взаимодействия р53 со своими негативными регуляторами (Marouco et al. 2013).
По своей природе белок р53 является транскрипционным фактором. Различные стрессы, вызывающие ряд пост-трансляционных модификаций р53, приводят к его стабилизации и повышению транскрипционной активности (Ваг-Ог et al. 2000). Интересно, что, по-видимому, различные стрессы приводят к различным модификациям р53 от которых зависит спектр активируемых р53 генов (Koumenis et al. 2001). Таким образом, под влиянием различных стрессовых сигналов в клетке формируются разные пулы р53, способные координировать внутриклеточные процессы в условиях специфичных стрессовых воздействий (Gu et al. 2012).
Основными мишенями р53 являются гены, кодирующие регуляторы клеточно цикла, белки-инициаторы апоптоза, участники репарации ДНК, регуляторы ангиогенеза, метаболизма и т.д. К регуляторам клеточного цикла относится p21(CIPl/WAFl) - ингибитор комплексов циклин-зависимых киназ CDK1 и CDK2 (Macleod et al. 1995), а так же GADD45 (Jin et al. 2002), приводящий к изменению внутриклеточной локализации циклина В1. Таким образом, за счёт активации экспрессии p21(CIPl/WAFl) и GADD45 стабилизация р53 вызывает арест клеточного цикла в G1/S и G2/M, соответственно.
Среди проапоптотических генов мишениями р53 являются участники как митохондриального (PUMA, В АХ, NOXA), так и внешнего (APAF-1) путей апоптоза (Brady, 2009).
Недавно так же было показано, что, например, при генотоксическом стрессе р53 регулирует клеточный ответ не только за счет активации экспрессии кодирующих генов-мишеней, но и за счет некодирующих малых РНК (Barlev et al., 2010; Lezina et al., 2013).
Однако, помимо трансактиватора, p53 может являться и репрессором, ингибируя экспрессию других своих мишений. Помимо этого, имеются данные о непосредственной роли р53 в репрессии ДНК-повторов. Так, например, р53 ингибирует экспрессию фофатазы CDC25A (Rother et al. 2007), которая является активатором CDK2 и, соответственно, способствует продвижению клеток из G1 в S фазу. Кроме того, р53 репрессирует анти-апоптотический ген Вс12 (Wu et al. 2001).
Показано, что р53 ингибирует экспрессию транспозонов и ретротраспозонов, чем предохраняет клетку от огромного количества «транскрипционного мусора» и сопутствующей геномной нестабильности, хотя конкретные механизмы данного процесса остаются пока неизученными (Leonova et al. 2013).
Помимо функционирования в качестве транскрипционного фактора р53 может играть роль онкосупрессора за счёт белок-белковых взаимодействий. Так, моноубиквитинилированный р53 локализуется в митохондриях, где вступает во взаимодействие с анти- и проапоптотическими белками, в следствии чего происходит нарушение проницаемости мембраны митохондрий и выход цитохрома С в цитоплазму (Чумаков, 2007). Таким образом, р53 участвует в митохондриальном пути апоптоза независимо от своих свойств как трансактиватора и репрессора.
По-видимому, нормальное функционирование р53-зависимых сигнальных путей не совместимо с жизнедеятельностью раковых клеток. Поэтому в раковых опухолях либо происходит потеря участка генома, несущего ген ТА53, либо белок р53 инактивирован. Это достигается за счёт двух механизмов.
Во-первых, примерно в половине раковых опухолей ген, кодирующий р53, содержит мутации, которые приводят к инактивации соответствующего белка (Brady, 2009). Больше всего мутаций приходится на ДНК-связывающий домен р53. Как правило, единичной аминокислотной замены в данном участке р53 достаточно, чтобы белок претерпевал неправильный фолдинг и терял способность взаимодействовать с промоторами своих генов-мишений. При этом важно заметить, что р53 выполняет свои функции в составе гомотетрамера. Поэтому гетерозиготной мутации достаточно для потери транскрипционной активности р53, так как даже одна мутантная копия р53 в составе тетрамера полностью нарушает его функцию. Кроме того, известен ряд конкретных мутаций р53, наиболее часто имеющих место при самых различных опухолях. Такие мутации, помимо инактивации онкосупрессорных функций р53, придают ему онкогенные свойства (Oren et al. 2010). Опухоли, экспрессирующие мутантный р53, как правило, более агрессивны, менее дифференцированы и обладают большим метастазирующим потенциалом. Кроме того, такие опухоли более устойчивы к различным химиотерапевтическим препаратам (Mello et al. 2013).
Другим механизмом инактивации р53 в опухолевых клетках является сверхэкспрессия специфичной к нему ЕЗ убиквитин лигазы MDM2, о чём будет подробнее написано в следующем разделе. Таким образом, биологическое значение р53 заключается в обеспечении стабильности генома и генетической однородности клеток в целостном организме (Чумаков, 2007).
Обработка клеток химиотерапевтическими препаратами
Непосредственным предшественником всех пуриновых нуклеотидов является инозинмонофосфат (Mathews, 2015). При его синтезе основные реакции нуждаются в 10-формилТГФ - доноре одноуглеродных групп. За счет деятельности ферментов метилентетрагидрофолатредуктаз - MTHFD1 и MTHFD2 (питоплазматического и митохондриального, соответственно) 5,10-метиленТТФ превращается в 10-формилТТФ, необходимый для синтеза пуринов. Кроме того, образующийся за счет деятельности ферментов SHMT1 и SHMT2 глицин является одним из предшественников в синтезе пуриновых нуклеотидов, давая С4-С5 и N7 атомы в молекуле инозина (Kolman and Rem, 2004). Одной из лимитирующих реакций биосинтеза пуринов является синтез ксантозин-5-монофосфата из инозин-5-монофосфата, катализируемый ферментом инозинмонофосфатдегидрогеназой (IMPDH2) (Hedstrom, 2009)
Метаболически фолатный цикл тесно взаимосвязан с циклом метионина (Рис. 6) за счет метилТГФ, образуемого под действием фермента метиле нтетрагидрофолатредуктазы (MTHFR) при восстановлении 5,10-метиленТТФ (Locasale, 2013). При деметилировании метилТГФ гомоцистеин превращается в метионин. Далее метионин превращается в S-аденозилметионин — основной источник метильных групп в клетке в реакциях метилирования ДНК (поддержания эпигенетического статуса) и белков. SAM в нескольких реакциях превращается в гомоцистеин, замыкая цикл (Amelio et al. 2014). Гомоцистеин является предшественником при синтезе глутатиона (поддержание окислительно-восстановительного статуса), а так же липида фосфотидилхолина, который может составлять до 50% состава цитоплазматической мембраны клетки.
В результате функционирования реакций одноуглеродного метаболизма в клетке функционирует мощнейший биосинтетический аппарат, который на основе серина, глицина, метионина и кофактора ТГФ катализирует ключевые стадии биосинтеза нуклеотидов, SAM, глутатиона, фосфотидилхолина (Рис. 6). Таким образом, одноуглеродный метаболизм дает клетке как «строительный материал» (нуклеотиды, аминокислоты, фосфотидилхолин), так и материалы для тонкого регулирования функционирования генетического аппараты и белок-белковых взаимодействий (SAM, глутатион) (Locasale, 2013). Поэтому неудивительно, что столь значимый для биосинтеза метаболический путь регулярно интенсифицирован в быстро пролиферирующих раковых клетках.
Имеется ряд экспериментальных свидетельств о том, что в опухолях различного генезиса регулярно детектируется сверхэкспрессия генов, кодирующих ключевые ферменты одноуглеродного метаболизма, а так же повышена активность данных ферментов.
Поскольку серингидроксиметилтрансферазы SHMT1 и SHMT2 являются основными «поставщиками» метильных фрагментов (5,10-метиленТГФ) для реакций одноуглеродного метаболизма, их повышенная экспрессия (в большей степени это относится к SHMT2) выявлена в различных раковых опухолях (Tedeschi et al. 2014, Antonov et al. 2014, Lee et al. 2014). Помимо этих ферментов, так же регулярно повышена экспрессия генов, кодирующих MTHFD2 и MTHFD1 (Tedeschi et al. 2014, Nicolson et al. 2014), отвечающих за биосинтез 10-формилТГФ и DHFR (регенерация ТГФ) (Tedeschi et al. 2014). Однако, несмотря на то, что в литературе представлены данные о корреляции с клеточной пролиферацией экспрессии как митохондиальных, так и цитоплазматических ферментов биосинтеза глицина, в ряде исследований сообщается о преимущественном использовании раковыми клетками митохондриальных путей (SHMT2, MTHFD2) (Vazquez et al. 2014). Было также показано, что экспрессия SHMT в иммортализованной мышиной линии NIH3T3 вызывала трансформацию этих клеток. А подавление экспрессии SHMT2 в раковых клеточных линиях человека вызывало остановку пролиферации за счет ареста клеточного цикла в Gl/S (Jain et al. 2012).
Кроме того, поскольку другим источником 5,10-метиленТГФ является система деградации глицина, то ферменты данного метаболического пути так же часто оверэкспрессированы в раковых клетках (Labuschange et al. 2014, Vazquez et al. 2014).
Поскольку одноуглеродный метаболизм тесно связан с биосинтезом
нуклеотидов, в раковых клетках различного генезиса регулярно нарушена экспрессия генов, кодирующих ферменты ключевых стадий синтеза как пиримидиновых, так и пуриновых нуклеотидов. Прежде всего, это тимидилатсинтаза TYMS (Burdelski et al. 2015), IMPDH2 (Не et al. 2010, Zhou et al. 2015), GART и ATIC (Vazquez et al. 2014). Кроме того, для генов, кодирующих ферменты, контролирующие ключевые стадии биосинтеза пиримидиновых нуклеотидов (TYMS) и пуриновых нуклеотидов (IMPDH2) описаны корреляции с устойчивостью к химиотерапевтическим препаратам (Shimizu et al. 2016, Li et al. 2014).
Важным является тот факт, что все вышеописанные гены являются транскрипционными мишенями транскрипционного фактора с-Мус — онкогена, часто экспрессируемого в различных раковых опухолях, прежде всего в лимфомах Ходжкина, В-клеточных лимфомах, а так же при хроническом миелобластном лейкозе (Nikiforov et al. 2002). Таким образом, онкоген с-Мус ассоциирован с репрограммированием клеточного метаболизма в сторону интенсификации одноуглеродного метаболизма, создавая необходимые условия для пролиферации раковых клеток (Amelio et al. 2014).
MDM2 взаимодействует физически с SET7/9, а так же контролирует уровень его экспрессии
С целью определения спектра белков, ассоциированных с рекомбинантной метилтрансферазой человека Set7/9, нами был применен метод GST-pull down (см. «Материалы и Методы»). Для этого векторы, кодирующие полноразмерный белок GST-Set7/9 (1-366 а.к.) и отдельные его домены GST-MORN (1-128 а.к.), GST-linker (128-214 а.к.), GST-SET (214-366 а.к.), а так же нативный белок GST (контроль), были экпрессированны в бактериальном продуцирующем штамме, афинно очищены за счет взаимодействия с глутатион-сефарозой и далее проинкубированы с клеточным экстрактом, полученным из клеточной линии НЕК293Т. Связавшиеся белки были элюированы нагреванием в денатурирующих условиях, разделены в градиентном ПААГ и проанализированы с помощью жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией (ЖК-ESI-MS/MS). Для идентификации ассоциированных с Set7/9 белков мы использовали программу Mascot49, а так же и базы данных UniProtKB/Swiss-Prot50. Полный список идентифицированных белков приведен в Табл. 6. Числовые значения в таблице (score) обозначают количество пептидов, идентифицированных для каждого конкретного белка.
Из приведенной выше таблицы видно, что по результатам GST-pull down мы идентифицировали 87 белков, ассоциированных с метилтрансферазой Set7/9. Их примерное распределение по функциям в клетке представлено на Рис. 15. Поскольку при проведении GST-pull down нами было использовано эквимолярное количество всех GST-вариантов Set7/9, то по значению «score» мы можем косвенно судить об интенсивности взаимодействия конкретных идентифицированных белков с определенным рекомбинантным доменом белка Set7/9. Интересно, что около 95% всех идентифицированных нами белков взаимодействуют именно с MORN-доменом Set7/9. Данный домен (MORN - англ. “Membrane Occupation and Recognition Nexus”) характерен для белков, вовлеченных в процесс разделения мембран (Im et al. 2007).
Распределение идентифицированных белков по функциям показало, что 31% интерактантов Set7/9 принимают участие в процессинге РНК и сплайсинге, в то время как 15% - в метаболизме (Рис. 15). Примерно равные доли ассоциированных с Set7/9 белков участвуют в транскрипции (10%) и трансляции (10%), а так же являются компонентами цитоскелета и участвуют в образовании межклеточных контактов (8%). По 4% идентифицированных белков являются шаперонами, а так же обеспечивают репарацию ДНК. Рис. 15 Процентное распределение по функциям белков клеточной линии НЕК293Т, ассоциированных с SET7/9
Известно, что помимо негативного контроля р53, убиквитин-лигаза MDM2 участвует в других клеточных процессах и физически взаимодействует с целым рядом белков (www.biogrid.de). Понимание функциональной роли MDM2 в данных процессах является важным как для представления о механизмах онкогенеза, так и в контексте потенциальной противоопухолевой терапии.
Для идентификации клеточных процессов, протекающих с участием MDM2, мы задались целью определенить спектр белков, ассоциированных с данной ЕЗ-убиквитин лигазой. Для выполнения этой задачи нами были использованы две раковые клеточные линии человека, различающиеся по генезису - U20S (остеосаркома) и MCF7 (карцинома молочной железы). С целью определения спектра белков, ассоциированных с MDM2, нами был так же применен GST pull-down метод (см. «Материалы и Методы»). При связывании с клеточным экстрактом, полученным из клеточной линии MCF7, помимо рекомбинантной полноразмерной изоформы MDM2, нами так же были использованы рекомбинантные сплайс-изоформы MDM2-A и MDM2-C. Во всех экспериментах мы использовали для связывания эквивалентное количество рекомбинантных белков (изоформ MDM2, слитых с GST, и контрольного белка GST). Это позволило нам идентифицировать белки, ассоциированные с различным изоформами MDM2, а так же количественно оценить эти взаимодействия относительно различных изоформ и контрольных белков.
Кроме того, поскольку известна вовлеченность MDM2 в ответ на генотоксический стресс, мы решили оценить спектр белков, ассоциированных с рекомбинантной ЕЗ-лигазой MDM2, при повреждении ДНК. Для этого мы использовали клеточный экстракт, полученный из линии остеосаркомы U20S после обработки генотоксическим агентом доксорубицином (см. «Материалы и Методы»).
Полные списки идентифицированных белков, ассоциированных с MDM2 из экстрактов клеточных линий MCF7, U20S и U20S после обработки доксорубицином, приведены в Табл. 9, 10 и 13. Числовые значения в таблицах (score) обозначают количество пептидов, идентифицированных для каждого конкретного белка.
При использовании клеточного экстракта линии U20S (остеосаркома) нами были идентифицированы 119 белков, ассоциированных с рекомбинантной основной изоформой MDM2 (Табл. 9). Их распределение по функциям в клетке представлено на Рис. 17 и в Табл. 7.
MDM2 и Set7/9 принимают участие в различных клеточных процессах и имеют общих интерактантов
На следующем этапе мы решили верифецировать даннные масс-спектрометрической идентификации белков, ассоциированных с MDM2, методом Вестрен-блоттинга, используя антитела, специфичные к нескольким идентифицированным белкам.
Двумя идентифицированными интерактантами MDM2, играющими важную роль в онкогенезе, являются белки IQGAPI (Ras GTPase-activating-like protein, идентификатор Uniprot Р46940) и CDC42 (Cell division control protein 42 homolog, идентификатор Uniprot P60953). IQGAPI и CDC42 взаимодействуют друг с другом в области фокальных контактов, модулируя состояние актинового цитоскелета (Kuroda et al. 1998). Показано участие данных белков в регуляции клеточного деления, поляризации и миграции клеток (Noritake et al. 2005). Дерегуляция IQGAPI и CDC42 является общим свойством раковых клеток в различных типах опухолей и приводит к усилению миграционного потенциала клеток за счет нарушения адгезии, опосредованной Е-кадгерином (Johnson et al. 2009).
Для Вестерн-блоттинга с антителами, специфичными к IQGAPI и CDC42, мы использовали пробы после пулл-дауна изоформ MDM2 с клеточным экстрактом линии MCF7 (карцинома молочной железы). Результаты данного эксперимента, приведенные на Рис. 23А и Б, подтверждают взаимодействие IQGAPI и CDC42 с MDM2, при этом только с основной (полноразмерной) изоформой.
Еще одним идентифицированным нами белком, играющим важную роль в онкогенезе, является уже описанный выше фермент метилентетрагидрофолатредуктаза MTHFD1. Данный фермент имеет цитоплазматическую локализацию и принимает важное участие в синтезе 5,10-мТГФ. При этом его митохондриальная изоформа - MTHFD2, которая вдобавок к этому имеет и ядерную локализацию, согласно ряду литературных данных (Vazquez et al. 2013, Nilson et al. 2014), совместно с серингидроксиметилтрансферазой SHMT2 играет ключевую роль в интенсификации одноуглеродного метаболизма, ассоциированной с онкогенезом. Рис. 23. IQGAPI, CDC42 и MTHFD2 взаимодействуют с рекомбинантной ЕЗ-лигазой MDM2 A. верх - IQGAPI взаимодействует с основной изоформой MDM2, низ эквивалентное количество IQGAPI в пробах, использованных для связывания с MDM2 Б. верх - CDC42 взаимодействует с основной изоформой MDM2, низ -эквивалентное количество CDC42 в пробах, использованных для связывания с MDM2 B. верх - MTHFD2 взаимодействует с основной изоформой MDM2, низ эквивалентное количество MTHFD2 в пробах, использованных для связывания с MDM2 К-контроль (GST), FL - полноразмерная (основная) изоформа MDM2, А изоформа MDM2-A, С - изоформа MDM2-C Гель, окрашенный кумасси, демонстрирующий эквивалентное количество изоформ MDM2, представлен на Рис. 20 Поэтому мы так же использовали пробы после пулл-дауна изоформ MDM2 с клеточным экстрактом линии MCF7 для Вестерн-блоттинга с антителами, специфичными к MTHFD2. На Рис. 23В видно, что среди изучаемых изоформ MDM2 только основная изоформа взаимодействует с MTHFD2.
Таким образом, результаты выборочной верификации с использование GST-pull down и последующим вестерн-блоттингом со специфичными антителами подтвердили данные масс-спектрометрической идентификации интерактантов MDM2. 3.3 Влияние SET7/9 и MDM2 на ключевые факторы одноуглеродного метаболизма
Как было отмечено выше, в качестве общих интерактантов MDM2 и Set7/9, идентифицированных нами посредством протеомного подхода, являются ключевые участники одноуглеродного метаболизма серингидроксиметилтрансфераза SHMT2 (идентификатор Uniprot Р34897) и метилентетрагидрофолатредуктаза MTHFD2 (идентификатор Uniprot Р13995). Нас особо заинтересовали данные ферменты, поскольку они напрямую вовлечены в контроль раково-ассоциированного метаболизма и являются перспективными мишенями онкофармакологии.
Известно, что SHMT2 и MTHFD2 являются ключевыми ферментами, регулирующими метаболизм серина и глицина, а так же пуриновых нуклеотидов. Нарушения метаболизма серина и глицина являются общим признаком, присущим подавляющему большинству раковых клеток (Amelio et al. 2014). Экспрессия SHMT2 и MTHFD2 регулярно нарушена в различных типах раковых опухолей (Antonov et al. 2014). Поэтому далее мы сосредоточились на исследовании влияния SET7/9 и MDM2 на экспрессию SHMT2 и MTHFD2.
В соответствии с нашими данными GST-pull down анализа, приведёнными в предыдущем разделе, MTHFD2 и SHMT2 являются интерактантами метилтрансферазы Set7/9. При этом MTHFD2 и SHMT2 взаимодействуют с MORN-доменом Set7/9.
Кроме того, согласно данным по микроарреям, полученным ранее в нашей лаборатории (Lezina et al. 2015), в клетках U20S с нокдауном Set7/9 (U20S H,Set7/9) экспрессия SHMT2 и MTHFD2 повышена по сравнению с контролем (U20SK) в 2-2,4 раза, соответственно. Поэтому мы решили верифецировать эти данные микроарреев с использованием ПЦР в реальном времени (РВ). Для этого мы так же использовали клеточные линии и208НД8ег7/9 и и208(КНД) с доксициклин-индуцируемым нокдауном (см. «Материалы и Методы»). Согласно полученным результатам ОТ-ПЦР в РВ, показанным на Рис. 24, при нокдауне Set7/9 экспрессия MTHFD2 и SHMT2 повышена в 2,2 и в 3 раз, соответственно. Таким образом, данные микроарреев совпали с данными ОТ-ПЦР в РВ.
Далее мы оценили влияние нокдауна Set7/9 на экспрессию MTHFD2 и SHMT2 посредством иммунноблотинга со специфичными антителами. Как видно из Рис. 25, экспрессия MTHFD2 и SHMT2 несколько повышена в U20Sbm,Set7/9 клетках, что, в целом, соответствует результатам ПЦР в РВ. Особенно четко повышена экспрессия SHMT2-alpha, представляющей ядерную изоформу SHMT2.