Введение к работе
Актуальность проблемы. Взаимодействие вирусных частиц с
поверхностными клеточными рецепторами является начальной фазой проникновения вириона внутрь клетки. Этот процесс во многом определяет течение вирусной инфекции, как в отдельной группе клеток, так и в организме в целом. Именно эта фаза является одной из важнейших в определении тропизма вируса и его патогенности. Познание механизмов взаимодействия вируса и клеточного рецептора дает принципиально новые возможности в разработке препаратов для лечения и профилактики вирусных инфекций на основе блокирования ранних этапов проникновения вируса в клетку.
Ранние стадии взаимодействия альфавирусов и клетки изучены недостаточно хорошо. Работы, посвященные исследованию этого вопроса, не дают полного, единого и взаимосвязанного представления о проникновении представителей этого рода в клетку. В частности, нет окончательных данных свидетельствующих о том, какие именно вирусные и клеточные домены рецепторов принимают участие в этом процессе. Среди различных представителей альфавирусов наиболее полно исследованы только вирусы Синдбис и Леса Семлики.
Вирус Венесуэльского энцефаломиелита лошадей (ВЭЛ) является типичным представителем альфавирусов, имеет широкое распространение в странах Северной, Центральной и Южной Америки. Он вызывает острое трансмиссивное антропозоонозное нейроинфекционное заболевание с проявлениями лихорадки, которое, при сравнительно невысокой летальности, сопровождается развитием параличей, парезов, стойких головных болей. На сегодняшний день процесс рецепторного взаимодействия вируса ВЭЛ с клеткой остается недостаточно изученным. Можно предположить, что широкий тропизм вируса ВЭЛ, его способность реплицироваться в клетках различного видового происхождения, обусловлен
использованием либо одного единственного, но широко распространенного консервативного клеточного рецептора, либо использованием нескольких рецепторов и/или ко-рецепторов для проникновения в чувствительные клетки.
В начале 90-х годов была выдвинута гипотеза об использовании альфавирусами 67 кДа ламининсвязывающего белка (ЛСБ) в качестве клеточного рецептора для вируса Синдбис, которая была подтверждена результатами нескольких опубликованных работ. Позднее было установлено, что вирус ВЭЛ также способен взаимодействовать с мономерной формой ЛСБ на поверхности клеток комара. В связи с этим изучение механизма проникновения в клетки млекопитающих вируса ВЭЛ, так же как и других альфавирусов, является научно значимым и имеет прямое практическое значение. Данные, свидетельствующие о взаимодействии вируса клещевого энцефалита и вируса Денге с ламининсвязывающим белком, делают исследования этого клеточного рецептора еще более актуальными.
Цели и задачи исследования. Основная цель работы состояла в исследовании роли ламининсвязывающего белка в процессе прикрепления и проникновения вируса ВЭЛ в клетки млекопитающих.
Для достижения поставленной цели были намечены следующие этапы исследований:
изучение взаимодействия вирионов вируса ВЭЛ с рекомбинантным ламининсвязывающим белком человека;
установление вирусного белка-мишени для связывания с рЛСБ;
получение гипериммунных сывороток против рЛСБ;
блокирование поликлональными антителами против рЛСБ связывания вирионов вируса ВЭЛ с эукариотическими клетками;
формирование коллекции гибридом, секретирующих моноклональные антитела (МКА) к рЛСБ;
исследование антигенной структуры рЛСБ при помощи панели МКА;
отбор из полученных МКА против рЛСБ антител, обладающих способностью взаимодействовать с нативным ЛСБ на поверхности клеток;
блокирование при помощи МКА проникновения вируса ВЭЛ в клетки и оценка ингибирования репликации.
Научная новизна и практическая ценность. В результате проделанной
работы были получены экспериментальные данные свидетельствующие о том, что рЛСБ человека взаимодействует с вирионами вируса ВЭЛ. Результаты конкурентного ИФА подтвердили специфичность ингибирования кроличьими противовирусными антителами связывания рЛСБ с вирусными частицами. Впервые было установлено, что гликопротеин Е1 вируса ВЭЛ специфически взаимодействует с рЛСБ человека.
Впервые было обнаружено, что поликлональные антитела против рЛСБ способны блокировать связывание вируса ВЭЛ с клетками млекопитающих. Предварительная обработка клеток поликлональными кроличьими антителами против рЛСБ делала их практически полностью резистентными к вирусной инфекции. Бьшо обнаружено, что эффект ингибирования репликации вируса ВЭЛ на чувствительных клетках имеет доза-зависимый характер. Было показано, что поликлональные антитела к рЛСБ в концентрации 35 мкг/мл вызывали практически полное блокирование репликации вируса ВЭЛ.
В результате проделанной работы создана оригинальная коллекция мышиных гибридом, секретирующих МКА к рЛСБ человека, состоящая из 13 клеточных линий. Десять типов МКА были способны связываться с ЛСБ на поверхности клеток млекопитающих. Из них 4 типа МКА ингибировали репликацию вируса в клетках Vero. С помощью панели МКА к рекомбинантному ЛСБ изучена антигенная структура ЛСБ. Предложена карта антигенной структуры рЛСБ, включающая в себя 6 сайтов, объединяющих 10 эпитопов связывания МКА. Впервые бьшо показано, что
частично перекрывающиеся эпитопы сайтов ЗА, ЗВ, 4А и 4В рекомбинантного ЛСБ человека вовлечены в связывание с вирусом ВЭЛ.
Положения, выносимые на защиту.
-
Взаимодействие рекомбинантного 43 кДа ламининсвязывающего белка человека с вирионами вируса Венесуэльского энцефаломиелита лошадей.
-
Наличие конкуренции рЛСБ с поликлональными антивирусными антителами за взаимодействие с вирусными частицами ВЭЛ.
-
Связывание гликопротеина Е1 вируса ВЭЛ с рекомбинантным ЛСБ.
-
Ингибирование репликации вируса ВЭЛ путем предварительной обработки клеток млекопитающих очищенными поликлональными кроличьими антителами против рЛСБ.
-
Невосприимчивость клеток к инфекции вируса ВЭЛ в результате воздействия на них антителами к рЛСБ в концентрации 35 мкг/мл и выше.
-
Ингибирование синтеза вирусных белков после обработки антителами против рЛСБ монослоя клеток.
-
Коллекция гибридом, секретирующих моноклональные антитела к рекомбинантному ЛСБ.
-
Карта антигенной структуры рЛСБ, включающей в себя 6 сайтов, объединяющих 10 эпитопов связывания МКА
9. Ингибирование репликации вируса ВЭЛ при обработке клеток
четырьмя видами МКА МКА к эпитопам ЗА, ЗВ, 4А и 4В
рекомбинантного ЛСБ способны блокировать связывание с
вирионами вируса ВЭЛ.
Апробация работы и публикации. Материалы диссертации были
представлены на следующих конференциях:
Вторая научная конференция с международным участием "Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера", Новосибирск, 2002; Международная конференция "Рецепция и внутриклеточная сигнализация", Пушино, 2003; International conference "Chemical and Biological problems of Proteomics", Novosibirsk, Russia, 2004. Публикации. По результатам работы опубликовано 5 статей в отечественной печати.
Структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов, и указателя литературы (17 источников на русском языке и 276 — на английском). Работа изложена на 170 страницах машинописного текста, включая 4 таблицы и 23 рисунка.