Введение к работе
Актуальность темы. Культуры клеток представляют удобный объект для решения ряда теоретических проблем, связанных с изучением метаболизма клеток, с исследованием патофизиологических и цитогенетических характеристик, малигнизацин клеток, разработки методов клеточной биотехнологии (Сергеев В.А., 1976; Дьяконов Л.П., 1978, 1983, 1985, 1990; Мамаева СЕ. и др., 1983, 1984; Пина-еа Г.П. и др., 1983; Еахарев В.Н. и др., 1990; Hull H.N. et.al., 1976; Anbeai-IinpLobato ot.al., . 1967 И другие).
Развитие современной вирусологии в значительной мере определяется наличием эффективных клеточных систем, позволяющих проводить эксперименты и осуществлять диагностику и биопроизводство с максимальным выходом продукции (вирусные антигены, биологически активные вещества). Поэтому остается актуальной задача выведения новых клеточных культур, чувствительных к вирусам - возбудителям болезней сельскохозяйственных животных.
Применительно к вирусам, выделяемым от свиней, нажно получить новые культуры клеток, использование которых позволило бы наряду с накоплением достаточного количества биомассы вирусов создать условия для максимального сохранения их антигенных и им-иуногенных свойств. Это в частности относится к коронавирусу -возбудителю трансмиссивного гастроэнтерита свиней (ТГС), который по данным ряда авторов (Притулин II.И. с соавт., 1977; Непоклонов Е.А. с с<~авт., 1084; ї/і11га к.11., 1967). при культивировании на первичных культурах и субкультурах почки плода свиньи, перевиваемой линии клеток СПЭВ, сохраняя антигенные свойства, в значительной мере теряот иммуногенность.
Литературные данные свидетельствуют о чувствительности пер-
вичных культур клеток щитовидной железы поросят к коронавирусу (ТГС), парво- и энтеровирусам свиней (Лабутинс с соавт., 1976;. Dulac G.C. et.al., Ї975; Mengel'ing W.I., 1978).
. Для изучения энтеропатогенных вирусов сельскохозяйственных
животных лучшие результаты можно ожидать при использовании куль
тур клеток, полученных из ткани наиболее поражаемой при инфекци
онном процессе, такой, например, как ткань кишечника. Несмотря
на это культуры клеток из ткани кишечника недостаточно широко
применяются в вирусологической практике, что связано главным об
разом с трудностями, которые возникают при получении и культиви
ровании клеток кишечника ин витро и обусловлено особенностями
строения и физиологии энтероцитов (Жданова Л.Г., Грубер К.М., -
1965; Daues B.S., Sutanto і!., ' 1982; Wilson M.K.,Hohman A.W.,
1974). .
Представляет научный и практический интерес получение культур клеток (первичных, диплоидных, перевиваемых) из ткани щитовидной железы и ткани кишечника и изучение их культурально-мор-фологических свойств и чувствительности к вирусам - возбудителям болезьей свиней.
Цель работы. Разработать методы получения Первичных культур, субкультур, диплоидных штаммов и постоянных линий клеток, обладающих высокой чувствительностью из ткани щитовидной железы свиньи и кишечника плода ^виньи.
В связи с этим в задачи исследований входило:
отработать методы получения первичных культур и субкультур клеток из ткани щитовидной железы и кишечника плода свиньи, а так же взрослого животного и изучить их культурально-морфологические свойства;
получить диплоидный'штамм клеток и постоянную клеточную
линий из ткани щитовидной гелезы свиньи, изучить их биологические свойства;
определить возможность культивирования клеток щитовидной железы и кишечника на питательных средах, приготовленных на осно-ве гидролизатов мышечных белков (ФГМ-С) и сывороточных белков молока (ГСЕМ);
изучить чувствительность новых культур клеток к возбудителям вирусных заболеваний свиней и других видов сельскохозяйственных животных;
изучить продукцию клетками щитовидной железы свиньи гор- . монов тироксина и трийодтиронина.
Научная новизна. Разработаны методы получения первичных культур и субкультур клеток из ткани щитовидной железы плода свиньи и взрослого животного с преобладанием клеток эпителиоподоб-ного типа. Получены диплоидный штамм (ШС-ВИЭВ) и постоянная линия клеток щитовидной железы свиньи (ЩС), изучены их культурально- -морфологические свойства, кариотип, ультраструктура. Разработаны методы получения первичных культур и субкультур клеток из ткани кишечника эмбриона .свиньи (КХ) и поросят гнотобиотов. Установлена высокая чувствительность первично-трипсинизированных культур клеток и субкультур КХ, ЩЖС, диплоидного штамма (ШС-ВИЭВ) и постоянной линии клеток щитовидной железы свиньи (ЩС) к корснавиру-су - возбудителю трансмиссивного гастроэнтерита свиней, парвови-русу свиней и вирусу герпеса лошадей I типа. Клетки щитовидной железы свиньи ин витро продуцируют тиреоидина гормоны - тироксин и трийодтиронин.
Практическая значимость работы. Новые культуры клеток щитовидной железы сшньи (первичные, субкультуры, диплоидный штамм ЩС-ВИЭВ и постоянная клеточная линия), а также первичные культуры
"і
и субкультур» из ткани кишечника эмбриона свиньи и поросят гно-тобиотов рекомендованы и широко используются в научных и диагностических лабораториях страны для проведения вирусологических исследований, диагностики вирусных инфекций животных и получения вирусных антигенов;
Разработаны методические рекомендации по использойанию указанных клеточных культур. Рекомендации утверждены отделением ветеринарии ВАСХНИЛ.
Культура клеток щитовидной железы рекомендуется для использования в биотехнологии.
. Получено авторское свидетельство на изобретение "Диплоидный штамм эпителиопоДобных клеток щитовидной железы свиньи, используемый для культивирования вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней" № 1347446, І9Б7 г.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на:
Всесоюзной научной конференции "Культуры клеток в ветеринарии", Москва, 1983 г.;
Всесоюзной конференции, посвященной "Теоретическим и практическим проблемам гнотобиологии", Москва, 1984 г.;
Третьем Всесоюзном совещании "Культивирование клеток живот ных и человека", Пущино, 1990 г.;
Ученом совете ВИЭВ 30 ноября 1990 г.;
- Межлабораторном совещании F>H3B 30 октября 1991 г.
Публикации. Материалы диссертации опубликованы в б рабо
тах.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на /Г( стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора-литературы,