Введение к работе
..„,,., і
':'Ч!^Ц Актуальность тема. Лейкоз крупного рогатого скота является заболеванием опухолевого характера. Возбудитель - РНК-содержавши вирус лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) из семейства Retroviridae . В искоренении ВЛКРС-инфекция специфическая профилактика может быть важным звеном в системе мероприятий. В странах ЕЭС с высокшл уровнем инфицированности животных вирусом лейкоза в борьбе с инфекцией используют принцип "выявление-бойня", который экономически не оправдан по сравнению с методом вакцинации.
Применение специфического ишуногенного препарата (Miller J,, Tan der Maaten M., 1978; Kono J., et.al, 1986) снизит расходы на проведение работ по борьбе с лейкозом, ускорит оздоровление стада, его воспроизводство за счет собственного молодняка. Ос<ь-бенно необходим такой подход для племенных хозяйств с высоким уровнем инфицированности животных БЛКРС, когда требуется полная замена всех коров стада, и оздоровление с применением обычных методов растягивается на многие годы.
Попытки создания инактивпрованйнх или субъединичных вакцинных препаратов в предыдущие года предпринимались, однако у них были выявлены недостатки:
- низкий уровень накопления вируса в культуральной срчде и
трудоемкость выделения, очистки и концентрирования его антигенов;
;- трудность дифференциации поствакцинал.оных антител от вирус-пндуцированных при естественном заражении животных ВЛКРС;
- невысокий протэктивный эффект не позволяет использовать
эти препараты в качестве вакцин серийного производства (Шишков
В.П. с соавт., 1979, 1983; Кукайн Р.А. с соавт., I983;Miller J.,
Van der Maaten M. , 1978, 1983; Hoberts D., et.al. , 1982, 1984; Onuma M., et.al. ,1984; Kono J., et.al. , 1986).
С появлением методов генной инженерии стало возможным создание вакцин на основе рекомбинантнои технологии с иопользованием в качестве вектора бактерий E.Coli , вируса оспы, герпеса, ба-куловируса и т.д. (Хромых А.А. с соавт., 1990; Drillien е., et. ali. , 1989; Scott-Ram N. , 1989; Weber Е., et.al., I989;Vfeir J.» et.al. , 1989).
Одним из наиболее приемлемых для этой цели биологических объектов является вирус ооповакцины. Он безопасен при массовых прививках и имеет значительную емкость генома для встраивания чужеродной информации. Начало работы с этим вирусом в качестве вектора было положено Panically D., et.al.B 1983 году.
Применение рекомбинангных вакцин удобно в виду их высокой экономичности, возможности быстрого изготовления больших коли- . честв препарата, простоты применения (Альтштейн А.Д., 1987). Такой подход возможен при конструировании рекомбинангного вектора на основе вируса ословакцины, имеющего в составе своего генома ген env , кодирующий оболочечный глдкопротеид (бР51-ЙРЗР )ВДКРС. Однако остаются не изученными такие биологические свойства ре-комбинантного вируса, как репродуктивная способность штаммов рекомбинантного вакцинного вектора (РВВ) в различных клеточных культурах. Не отработаны оптимальные режимы культивирования РВВ, соответствующие максимальному синтезу гликопротеидных антигенов ВЛКРС и не изучены антигенные и шмуногенные свойства РВВ.
Цель и задачи работы. Цель» наших исследований было определение оптимального рекима культивирования РВВ, зкспрессирушцего ген env вируса лейкоза крупного.рогатого скота, выявление антигенных и ишуногешшх свойств РВВ и эксцросоируемого этим векто-
ром ассоциированного о цитоплазматичесними мембранами гл'икопро-тевдного антигена БЖРС.
Выполнение поставленной цели осуществляли решением следующих задач.
-
Выявят* рекомбинантный штамм вируса осповакдины, обладающий наибольшей репродуктивной активностью и синтезом гликопро-' твидов ВЛКРС в культуре клеток.
-
Провести сравнительное изучение различных клеточных систем для культивирования рекомбинантного штамма вируса осповакдины я определить культуру клеток с максимальной репродукцией РВЗ.
-
Изготовить в лабораторных условиях препараты из РБВ и продукта его синтеза в культуре клеток - ассоциированного с ци-топлазматическимз мембранами гликолротеида ВЛКРС, изучить их антигенные и иммуногенные свойства.
Научная новизна. Сравнительными исследованиями выявлена более высокая репродуктивная активность рекомбинантного вируса WR-BIKPC К4 tk , сконструированного на основе штамма '.7R осповакдины.
Показано, что культуры клеток cv-1 и Тего являются оптимальными клеточными линиями для культивирования рекомбинантного век-. тора, причем наиболее высокий титр вируса осповакцины и максимальное накопление gp5i антигена ВЛКРС происходит в культуре
клеток CV-1 .
Разработан реши культивирования рекомбинантного вектора
«н-ВЖРС К4 tk+, позволяющий получить максимальный выход экс-прессируемого ем антигена gp5i ВЛКРС.
В лабораторных условиях изготовлены и испытаны в качества иммуногенов два биопрепарата: собственно рекомбинантный вирус
7/R -ВЛКРС K4 u+ я ассоциированный с цитоплазматическими мембранами рекомбинантный gp5l.
На кроликах, овцах и телятах проведено испытание приготовленных препаратов и дана оценка юс антигенных и иммуногенных свойств.
Комбинированное применение рекомбинантного вируса wr-BJIKPC К4 tk+ и выделенных из кулътуральной жидкости гликопротеидных антигенов ВЛКРС вызывало у телят иммунитет, предохраняющий животных после контрольного заражения их вирусом лейкоза крупного рогатого скота.
Научно-практическая ценность. Разработана в лабораторных условиях технология культивирования рекомбинантшх штаммов на осново вирусов ословакцины с интегрированным в их геном гена env вируса лейкоза крупного рогатого скота, ответственного за синтез гликопротеидного антигена ВЖРС. Показана принципиальная возможность использования в комплексе двух препаратов для иммунизации крупного рогатого скота: живого рекомбинантного вируса и инактивкроваиного гликопротеидного антигейа ВЛКРС.
Апробация -работа. Результаты диссертации доложены на: Всесоюзной ваучно-производотвену.ой конференции "Проблема оздоровления хозяйств от лейкоза крупного рогатого скота", Новосибирск, 1990 г.; научной конференции молодых ученых (ВЙЭВ, 1991 г.) к заседаниях Ученого совета ВИЭВ.
Публикации» По теме диссертации опубликовано три научные работы.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов и выводов. Работа излоаена на 104 страницах машинописного текста, иллюстрирована 10 таблицами и 5 рисунками. Список лите-
ратуры включает 171 источник отечественных и зарубежных авторов.