Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. В связи с обострением зкологичесіюй обстановки в регионах о интенсивным применением химических инсектицидов для борьбы с вредителями сельскохозяйственных культур, начинается интенсивный процесс внедрения биологических средотв. Среди этих препаратов используются, в частности, и полученные на основе бакуловирусов. Вирусные препараты существенно отличаются от химических или основанных на действии токсинов (например. Bacillus thuringiensls) инсектицидов тем. что во-первых, бакуловируоы специфичны, то есть действие их избирательно, поэтому применение этих препаратов безопасно для нецелевой энтомофауны. теплокровных и человека, окружающей среды в целом, и. во-вторых, вируо является естественным природным регулятором численности вредителей в биоценозе, вызывая в популяции вредителей эпизоотии, устойчивые в течение ряда лет о передачей инфекции горизонтальным путем. В силу этого вирусные днтомопатогенные препараты были предложены ведущими специалистами ряда стран как надежные перспективные средства управления численностью вредителей [Ignoffо. 1968. Вожко. 1980. Kelly. 1982. Oberlander. 19861.. К несомненным технологическим достоинствам бакуловирусов можно отнести также сочетаемость практически о любыми биологическими и химическими средствами, действие которых они усиливают, тем самым значительно уменьшая их концентрацию и удешевляя обработки.
До сих пор технология производства вирусных препаратов в нашей стране опирается на культивирование насекомых. При всей своей.очевидной проототе данная технология обладает рядом существенных недостатков, к которым следует отнести сезонность и неравномерность наработок, трудность получения препаратов с однородными свойствами, нетехнологичность и относительная ал-лергенность производства. На данном этапе в нашей стране указанная технология при всех ее недостатках является пока единственной, позволяющей решать практические задачи. В связи с этим весьма актуальной является разработка более современной технологии производства вирусных препаратов - в культуре клеток. Преимущества клеточной технологии заключаются в чистоте и
- 2 -стабильности свойств используемой культуры клеток, однородности получаемого продукта, уменьшении количества балластных белков, отсутствии внешних покровов насекомых, являющихся аллергенами для человека и. главное, в мобильности и технологичности производства. Качество и однородность полученной в культуре клеток вирусной биомассы определяет ее многоцелевое использование как для технологических, так и для исследовательских целей.
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью настоящего исследования является выбор системы культура клеток насекомых: вирус, превосходящей по технологическим характеристикам существовавшие ранее, способной продуцировать инфекционный вирусный материал и потенциально пригодной для последующего производства биопрепаратов, а также определение условий культивирования выбранной системы. В соответствии о целью поставлены следующие задачи:
-
Охарактеризовать имеющиеся линии клеток насекомых по продуктивности, в случае необходимости получить новые, выбрать из них наиболее эффективные.
-
Определить рациональные условия репродукции ВЯЛ в клетках насекомых и изучить размножение вирусов в отобранных линиях клеток.
-
Удешевить питательную среду для культивирования клеток насекомых и, по возможности, перевести ее на отечественное сырье.
-
Разработать технологичный способ суспензионного получения вирусной биомассы в культуре клеток насекомых.
-
Оценить биологическую активность вирусов, полученных 1 n vl tro.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые получена в нашей стране собственная система вакуловирус: клетка, продуцирующая инфекционный ВЯЛ и перспективная для наработки вирусной биомассы в суспензии.
Впервые получена новая культура клеток капустной совки линии МБ-К023-987. удовлетворяющая требованиям технологии.
Впервые получены перевиваемые линии клеток МБ-ХО-685 и МБ -0304-788. способные продуцировать вирусы ядерного полиэдроэа хлопковой и озимой совок соответственно. Все новые линии депонированы в ВОКК(Б). в ЙОГ (Москва) за NN А-26.А-27 и А-28.
Вцделен новый высокоэффективный бакуловирус - ВЯЛ КО-3 -поражающий не менее 8 видов значимых вредителей сельского-хо-
зяйства. способний инфицировать большинство иослелуемих линий клеток насекомых. Депонирован во Всесоюзной коллекции вирусов института вирусологии им. Ивановского АМН России за І) ГКБ Й15Ь.
Описан инфекционный процесс ВЯЛ КО-3 в клетках МБ-КСйЗ-987. Показана высокая стабильность этого процесса
Оптимизирована наработка инфекционных полиэдров ВЯЛ в клетках насекомых. Выявлены условия рационального выращивания (подготовка клеток и вирусного инокулята. температурный режим, режим внесения вируса, сорбции и др.) бакуловируоов в клетках как в монослое, так и в суспензии. Для каждой стадии инфекционного процесса разработаны лабораторные методики. Впервые предложено использовать для культивирования клеток насекомых и наработки в них бакуловируоов сыворотки плодов овец - отечественного сырья и отходов проиэводотва.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Разработан лабораторный регламент получения биомасон ВЯЛ капустной совки штамма ВЯЛ КО-3 в гомологичных клетках линии МБ-КСЙЗ-987.
Разработаны методы получения первичных культур клеток и получена серия новых, имеющих практическое значение, перевиваемых линий клеток насекомых.
' Полученный штамм ВЯЛ КС-3 обладает широким спектром действия и может служить основой для создания препарата.
' Замена импортной фатальной бычьей сыворотки на сыворотку крови плодов овец позволит перейти на отечественное сырье -отходы производства каракульчи, что существенно сократит затраты на культивирование клеток и наработку в них бакуловируоов.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты исследования докладывались на Всесоюзной конференции "Пути совершенствования микробиологической борьбы о вредными насекомыми и болезнями растений" (Ве-легож. 1986 ). Всесоюзной научной конференции "Энтомопатоген-ные вирусы и их роль в зашите растений" (Новосибирск. 1988). I -ом болгаро-советском симпозиуме по микробным пестицидам (Пловдив. Болгария, 1988). II-ом Всесоюзном симпозиуме по проблемам интеграции в зашите хлопчатника от вредителей (Ашхабад. 1988), отраслевом совещании по биологическим и технологическим проблемам создания вирусных препаратов для интегрированной защиты растений (п. Кольцове Новосибирской обл.. 1989). II-ом и III-ем Всесоюзном рабочем совещании "молекулярная биология ДНК-содержащих вирусов, имеющих практическое значение
- 4 -для сельского хозяйства и в медицине" (Киев. 198V и 1990 ). Ш-ем Всесоюзном совещании по культивированию клеток животных и человека (Пущино. 1990). Всесоюзной конференции "Питательные среды и сыворотки для культивирования клеток" (Кольцове Новосибирской обл.. 1991).
ПУБЛИКАЦИИ. Основные положения диссертации изложены в 12 научных работах, защищены 2 патентами и 4 рационализаторскими предложениями.
СТРУКТУРА И' ОБ' ЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, шести глав, обсуждения полученных результатов, выводов, списка литературы из 138 источников, в том числе 104 иностранных авторов и книги приложений состоящей из 16 приложений. Работа изложена на 186 страницах машинописного текста, иллюстрирована 33 таблицами и 42 рисунками, в том числе 18 фотографиями.