Культивирование клеток млекопитающих с различными видами сывороток и заменителями сывороток Гасанова, Барият Саидовна

Введение к работе

Актуальность проблемы. Возрастающие масштабы использования разнообразных клеточных культур в качестве субстратов для создания и производства биологически активных препаратов требуют эффективных и экономически выгодных питательных сред широкого ассортимента. Как известно, сыворотка до сих пор остается необходимым компонентом для культивирования клеток. В практике культивирования широко используется эффективная, но дорогостоящая эмбриональная телячья сыворотка /ЭТС/ и сыворотка крупного рогатого скота /КРС/. Свойства других видов сывороток изучены сравнительно мало . / Мусаев, Сафонов, 1987; Слесарева, Щебанова, 1991; Костина, 1991 / и их применение для биотехнологических работ пока ограничено. В связи с - этим представлялось актуальным исследование возможности применения сывороток крови различных видов животных / телят, северных, оленей, суягных овец и плодов овцы,-тюленей, морских " котиков / и изучение их 'ростстимулирующих свойств на ряде клеток млекопитающих.

Сыворотка, оставаясь необходимым компонентом питательной среды для культивирования клеток, все же обладает рядом существенных недостатков.' Основными недостатками использования сыворотки являются: ее возможная цитотоксичность, нестандартность / состав сывороток варьирует- от серии к серии /, контаминация посторонними агентами / вирусами, микоплазмами и т.п. /. За рубежом, и в последнее время в нашей стране, ведутся активные исследования по использованию комплекса ростовых факторов, 'выделяемых из сывороток и способных заменить ее .в качестве компонента питательной среды /flUuu., 1964,. 1966; Дроздова, 1980/, или конструированию полностью синтетических бессывороточных сред на основе подбора идентифицированных ростовых факторов сывороточной и несывороточной

¹ природы / fixurt. ., 1983; b(U/tS 0,,Уол# УІСМОЦ, 1987 /. В связи с вышеизложенным представлялось весьма. актуальным провести исследования по использованию ростового протеина, представляющего собой комплекс росгстимулирующих белков, и выделяемого из сывороток крови различных видов животных, и по применению синтетической бессывороточной среды на основе идентифицированных импортных и отечественных ростовых ингредиентов.

Пель и задачи исслаттования. Целью настоящей работы являлось культивирование клеток млекопитающих при использовании :

сывороток крови различных видов животных / телят, северных оленей, суягных овец и плодов овцы, тюяеней, морских котиков / ;

ростовых протеинов, выделенных из сывороток крупного рогатого скота, суягных овец, свиней, северных оленей ; синтетической бессывороточной среды на основе идентифицированных ростовых инградиентов / инсулина, трансферрина, селенита натрия, этаноламина, бычьего сывороточного альбумина, гидрокортизона, фактора роста эпидермиса /.

Исходя иа этого были поставлены задачи: " .' "

1. Изучение . ростстимулирующей активности сывороток крови различных видов животных, при культивировании клеток млеко-питакздих. Определение возможности замены дорогостоящей эмбриональной телячьей сыворотки на более дешевые отечественные виды сывороток.

2. Исследование ростстилулирупщей активности ростовых протеинов, вцделяег.гых из сывороток различных видов глвотных, и возмслп'осгп ::х использования б качеств компонента питатель-

¹ ной среды.

3. Изучение возможности использования ростовых протеинов

в качестве заменителей сыворотки при крупномасштабном культивировании с использованием отечественных микроносителей /МН/.

4. Исследование возможности культивирования клеток млекопи
тающих на бессывороточных средах с использованием отечествен
ных инградиентов / инсулина, трансферрина и ростового протеина,
выделенного из сыворотки свиней, взамен альбумина /.

Научная новизна работы.

Изучена ростстимулирующая активность нативных сывороток
крови различных видов животных / телят, суягных овец и пло
дов овцы:, северных оленей, тгатеней, морских котиков / на ря
де клеток млекопитающих и выявлена наибольшая ростовая ак
тивность телячьих сывороток, которые могут быть использованы
для большого _числа . кчеток взамен дорогостощэй ЭТС. Прове
дено сравнительное изучение пролиферативной активности росто
вых протеинов, выделенных из сыворотки двумя различными
способами: с помощью сульфата аммония и поли-

этиленгликоля /ПЭГ/. Показано, что ростовой протеин, выделенный из сыворотки КРС /РП КРС/ с использованием менее трудоемкого метода с помощью ПЭГа не уступает по своей ростовой активности РП, выделенному из телячьей сыворотки с помощью сульфата аммония. Впервые установлено, что РП 1СРС могут применяться для культивирования кдеток МТ-4 и

чувствительных к ВИЧ-инфекции. Впервые проведено исследование ростстимулирующей активности РП, выделение . из сывороток свиней и северных- оченей. Показана возможность использования РП свиней и РП оленей взамен эмбриональных телячьих оывороток. Впервые показана возможность использования РП при/ крупномасштабном культивировании клеток на

'отечественных микроносителях Цитолар-2 и Цитогель. Впервые проведены исследования по культивированию перевиваемой клеточной линии V 2-t-O на бес сывороточной среде, содержащей основные ростовые факторы. Показана возможность замены до-рогостощего импортного альбумина ростовым протеином, выделенным из сыворотки свиней. Практическая ценность,

3. В результате проведенных исследований показана_г возможность использования более дешевых видов сывороток / телят, северных оленей, тюленей, морских котиков / взамен ЭТО при культивировании перевиваемых, диплоидных и суспензионных культур.

4. Определена возможность замены нативных сывороток на ростовой протеин, выделяемый из сывороток КРС, свиней, северных оленей, в качестве более стандартизированного компонента питательной среды.

5. Показана возможность использования ростовых протеинов КРС, свиней, северных оленей в качестве. компонента среды, взамен сывороток, при крупномасштабном культивировании клеток на отечественных микроносителях.

6. Исследована возможность культивирования клеток на синтетической бессывороточной среде, состоящей из отечественных и импортных . идентифицированных ростовых факторов.

Основные положения, выносимые на зашитт.

7. Применение сывороток телят, овец:, северных оленей, тюленей взамен ЭТС экономически более выгодно и способствует увеличению объема бйотехнологических исследований.

8. Ростовой протеин, выделяемый из сывороток крови различных видов животных, как более стандартизированный компо-

-7.-

нент питательной среды, может быть использован при культивировании широкого спектра клеток млекопитающих, взамен нативных сывороток КРС и ЭТС.

3. Ростовой протеин может быть использован в качестве компонента питательной срецы при крупномасштабном культивировании клеток на отечественных микроносителях.

4. Возможность культивирования клеток млекопитающих в бессывороточной среде с использованием как ишортных, так и отечественных инградиентов.

Апробация таботні

Основные материалы диссертации были доложены и обсуждены:

на Всесоюзной конференции "Питательные среды и сыворотки для культивирования клеток", 1991 г. / г. Новосибирск /;

на конференции "Разработка и производство медицинской био- _v технологии", 1992 г. /г. Махачкала /;

на конференции "Актуальные проблемы инфекционной патологии. Иммунология и биотехнология", 1993 г. / г. Санкт-Петербург /;

на конференции молодых ученых в НИИ вирусологии им.Д.И.Ивановского, 1993 г. / г. Москва /;

на заседании Экспертного Совета предварительной вксперти-зы диссертационных, работ по медицинской вирусологии при НИИ вирусологии им.Д.И.Ивановского 21 октября 1993 г.

/ г. Москва /.

Публикации. По ' теме диссертации опубликовано 4 печатных-работы и выпущены Методические рекомендации.

Объем и структура диссвртагтии. Диссертация изложена на страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 4'.глав собственных исследований,

'обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 196 работ, из которых 32 отечественных авторов, 114 зарубежных. Экспериментальные данные иллюстрированы 6 рисунками и 29 таблицами.