Содержание к диссертации
Введение
Инициация трансляции у архей 7
1. Сравнительная характеристика системы инициации трансляции у бактерий, эукариот и архей
2. Архейные факторы инициации трансляции
2.1. aIF1 15
2.2. aIF1A 18
2.3. aIF2 22
2.4. aIF5B 38
2.5. aIF6 46
Заключение 51
Материалы и методы 52
1. Материалы и приборы 52
1.1. Химические реактивы и ферменты 52
1.2. Буферы и среды 53
1.3. Бактериальные штаммы и плазмиды 53
1.4. Принадлежности 54
1.5. Приборы 54
2. Методы генной инженерии и микробиологии 55
2.1. Клонирование генов субъединиц e/aIF2 55
2.2. Метод сайт-направленного мутагенеза последовательности ДНК 57
2.3. Электрофорез ДНК в геле агарозы 58
2.4. Обработка ДНК сайт-специфическими эндонуклеазами рестрикции 58
2.5. Получение компетентных клеток E. coli с применением хлорида кальция 58
2.6. Трансформация клеток E. coli плазмидной ДНК методом теплового шока 59
2.7. Экспрессия генов субъединиц e/aIF2 в клетках E. coli 59
3. Биохимические методы при работе с белками 60
3.1. Препаративное выделение и очистка -субъединицы aIF2 S. solfataricus и ее мутантных форм из клеток штаммов-суперпродуцентов E. coli 60
3.2. Препаративное выделение и очистка aIF2, aIF2D3, aIF2D23, aIF2 S. solfataricus из клеток штаммов-суперпродуцентов E. coli 62
3.3. Препаративное выделение и очистка гетеротримера aIF2 S. solfataricus из клеток штаммов-суперпродуцентов E. coli 62
3.4. Препаративное выделение и очистка eIF2 и eIF2 S. cerevisiae из клеток штаммов-суперпродуцентов E. coli 63
3.5. Получение препаратов комплексов e/aIF2 64 3.6. Спектрофотометрическое определение концентраций белков 65
3.7. Электрофорез белков в ПААГ в присутствии ДСН 65
3.8. Электрофорез белков в ПААГ в неденатурирующих условиях в кислой среде 66
3.9. Кристаллизация aIF2 и ее мутантных форм в свободной и нуклеотид-связанных формах 66
4. Биохимические методы при работе с РНК и нуклеотидами 67
4.1. Получение и очистка фрагментов мРНК 67
4.2. Препаративное выделение и очистка инициаторной тРНК E. coli из клеток штамма-суперпродуцента 69
4.3. Аминоацилирование тРНК 70
4.4. Электрофорез РНК в ПААГ в денатурирующих условиях 71
4.5. Препаративная очистка нуклеотидов 71
4.6. Анализ чистоты препаратов нуклеотидов 71
4.7. Спектрофотометрическое определение концентраций нуклеиновых кислот и нуклеотидов 72
5. Биохимические методы при работе с РНК-белковыми комплексами 72
5.1. Получение мРНК-белковых комплексов 72
5.2. Электрофорез РНК-белковых комплексов в ПААГ 72
5.3. Электрофорез РНК-белковых комплексов в геле агарозы 73
5.4. Анализ РНК-белковых комплексов методом поверхностного плазмонного резонанса 73
5.5. Получение и препаративная очистка тройственных комплексов
aIF2GDPNPMet-тРНКf и e/aIF2GDPNPMet-тРНКf 75
5.6. Кристаллизация тройственных комплексов aIF2GDPNPMet-тРНКf и e/aIF2GDPNPMet-тРНКf 76
Результаты и обсуждение 77
1. Получение и кристаллизация архейного тройственного комплекса aIF2GDPNPMet-тРНКf 77
2. Выделение субъединиц eIF2 S. cerevisiae 87
3. Получение и кристаллизация химерных форм фактора e/aIF2 и их тройственных комплексов e/aIF2GDPNPMet-тРНКf 90
4. Исследование мРНК-связывающих свойств aIF2 S. solfataricus 92
5. «Рабочий» цикл aIF2 S. solfataricus 108
Выводы 117
Список литературы 118
- aIF1A
- Получение компетентных клеток E. coli с применением хлорида кальция
- Препаративное выделение и очистка гетеротримера aIF2 S. solfataricus из клеток штаммов-суперпродуцентов E. coli
- Препаративное выделение и очистка инициаторной тРНК E. coli из клеток штамма-суперпродуцента
Введение к работе
Актуальность проблемы. Одной из важнейших задач молекулярной биологии является изучение механизма биосинтеза белка. Инициация синтеза полипептидной цепи на рибосоме – сложный процесс, в котором немаловажную роль играют белковые факторы. Ключевую роль в процессе инициации биосинтеза белка выполняет гомологичный между эукариотами и археями гетеротримерный фактор инициации трансляции 2 (e/aIF2), который доставляет инициаторную метионил-тРНК (Met-тРНКi) в Р-участок малой субчастицы рибосомы. Интенсивные структурные исследования e/aIF2 ведутся в лабораториях ряда стран. Настоящая диссертационная работа является продолжением исследований структурной организации архейного фактора aIF2, ведущихся в Институте белка РАН. В данной работе описано получение кристаллов и определение структуры тройственного комплекса сердцевинной части aIF2 с метионилированной инициаторной тРНК и аналогом ГТФ. Эта работа делалась коллективом сотрудников лаборатории структурных исследований аппарата трансляции ИБ РАН при непосредственном участии автора диссертации. Автором работы проводились эксперименты по получению новых, более совершенных кристаллических форм комплекса полноразмерного aIF2 с Met-тРНКi и ГТФ, а также были начаты эксперименты по выделению и кристаллизации субъединиц эукариотического фактора eIF2, пространственная структура которого до сих пор неизвестна (определена структура только его -субъединицы). Несмотря на гомологию, архейный фактор aIF2 не является идеальной моделью для интерпретации данных по функционированию eIF2, и определение пространственной структуры eIF2 необходимо для понимания и корректного описания на молекулярном уровне механизма инициации трансляции у эукариот. Параллельно с кристаллизацией и исследованиями структуры e/aIF2 в данной работе проводилось изучение дополнительной функции -субъединицы архейного фактора aIF2. Помимо основной роли в связывании инициаторной метионил-тРНК в составе гетеротримерного фактора, -субъединица aIF2 как в составе фактора, так и в изолированном состоянии способна связывать и защищать мРНК от 5-3 направленной деградации, однако на сегодняшний день данная функция aIF2 мало изучена.
Цель работы: исследование структуры фактора инициации трансляции 2 из археи Sulfolobus solfataricus и дрожжей Saccharomyces cerevisiae; исследование механизма взаимодействия aIF2 с мРНК.
Основные задачи работы: Получение кристаллов и исследование структуры
архейного тройственного комплекса aIF2GDPNPMet-тРНКf. Получение штаммов-
продуцентов Escherichia coli для субъединиц eIF2 S. cerevisiae и разработка методов
выделения этих белков. Получение и кристаллизация гетеротримера eIF2 и/или его
химерных форм с субъединицами архейного фактора aIF2, а также получение
химерных тройственных комплексов e/aIF2GDPNPMet-тРНКf и их
кристаллизация. Сайт-направленный мутагенез предполагаемых участков узнавания 5-концевого нуклеозидтрифосфата мРНК на -субъединице aIF2 S. solfataricus. Кристаллизация aIF2 дикого типа и ее мутантных форм в различных функциональных состояниях (в свободной форме, в комплексе с ГДФ и негидролизуемыми аналогами ГТФ).
Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые получены
кристаллы сердцевинной части архейного тройственного комплекса
aIF2D3GDPNPMet-тРНКf, на основе которых была определена его
пространственная структура. Показано, что, несмотря на структурную гомологию
-субъединицы aIF2 с бактериальным фактором элонгации EF-Tu, способы
взаимодействия этих белков с тРНК принципиально отличаются. Разработаны
методики выделения - и -субъединиц eIF2 дрожжей. Впервые получены
кристаллы химерных тройственных комплексов e/aIF2GDPNPMet-тРНКf, что
открывает перспективы для определения структур субъединиц эукариотического
фактора eIF2. Впервые показано, что канонический нуклеотид-связывающий сайт
aIF2 является специфическим местом связывания 5-концевого
гуанозинтрифосфата мРНК. Определение кристаллических структур aIF2 в
различных функциональных состояниях позволило построить схему
конформационных переходов, происходящих в этом белке при связывании ГТФ, его гидролизе и освобождении ГДФ.
Результаты по структуре архейного тройственного комплекса aIF2 с ГТФ и инициаторной метионил-тРНК и структурам комплексов -субъединицы aIF2 с нуклеотидами имеют фундаментальный характер. Полученные в ходе работы генетические конструкции и штаммы-продуценты E. coli для субъединиц eIF2 S. cerevisiae используются в ИБ РАН. В методическом аспекте данная работа будет полезна для специалистов, работающих в области препаративной биохимии и кристаллизации макромолекул, как в нашей стране, так и за рубежом.
Апробация работы и публикации. По материалам диссертации
опубликовано 4 статьи. Результаты данной работы докладывались на российских и международных конференциях.
Личный вклад автора состоит в непосредственном участии на всех этапах работы, а именно: проведение генно-инженерных экспериментов, выделение белков и РНК, получение белок-белковых и РНК-белковых комплексов, кристаллизация, сбор дифракционных данных с полученных кристаллов и сравнительный анализ, проведение кинетических исследований.
Структура диссертации: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работу иллюстрируют 38 рисунков и 15 таблиц. Общий объем диссертации 135 страниц. Библиография включает 236 названий.
aIF1A
Малая рибосомная субчастица участвует в инициации трансляции, и именно на ней расположен участок связывания мРНК. В нуклеотидной последовательности мРНК содержится информация об аминокислотной последовательности белка, который необходимо синтезировать рибосоме. Помимо кодирующей последовательности, или цистрона, мРНК обычно содержит нетранслируемые области (НТО) на 5 - и 3 -концах. Эукариотические мРНК в большинстве случаев моноцистронны, тогда как мРНК прокариот в связи с оперонной организацией генов обычно полицистронны, т.е. содержат несколько кодирующих последовательностей. Предшествующая кодирующей последовательности 5 -НТО включает специфические последовательности или структуры, которые участвуют в связывании рибосомы. В случае полицистронных мРНК каждому индивидуальному цистрону обычно предшествует его элементы участка инициации трансляции, которые часто перекрываются с кодирующими последовательностями предыдущих цистронов (см. обзор Kozak, 1999). Каждая кодирующая последовательность начинается с инициаторного, или стартового кодона, в качестве которого у эукариот практически всегда используется AUG, у бактерий и архей этот кодон используется в 90 и 79% случаев, соответственно, а также возможен старт с кодонов GUG (8 и 11%, соответственно) или UUG (1 и 10%, соответственно) (Gualerzi and Pon, 1990; Tolstrup et al., 2000).
В процессе инициации трансляции происходит связывание мРНК малой рибосомной субчастицей, и за счет узнавания инициаторного кодона мРНК и его спаривания с инициаторной тРНК в P-участке (участке связывания пептидил-тРНК) рибосомы установливается правильная рамка считывания всей последующей кодирующей последовательности мРНК. В бактериальной мРНК на расстоянии 7-10 нуклеотидных остатков (н. о.) перед стартовым кодоном располагается полипуриновая нуклеотидная последовательность, так называемая последовательность Шайна-Дальгарно, которая в большей или меньшей степени комплементарна последовательности «анти-Шайна Дальгарно», расположенной на 3 -конце 16S рРНК малой рибосомной субчастицы (Shine and Dalgarno, 1974). Спаривание этих последовательностей способствует непосредственному связыванию мРНК с рибосомой таким образом, что стартовый кодон размещается вблизи P-участка. Кроме того, у бактерий дополнительное связывание мРНК и рибосомы может осуществляться благодаря взаимодействию рибосомного белка S1 (bS1 согласно номенклатуре рибосомных белков Ban et al., 2014) с A/U-богатыми участками мРНК, расположенными перед последовательностью Шайна-Дальгарно (Komarova et al., 2002).
Эукариотические мРНК не содержат последовательности Шайна-Дальгарно и, как правило, имеют специфические постранскрипционные модификации: 7-метилгуанозин (кэп-структура) на 5 -конце и поли(А)-хвост на 3 -конце, которые при участии факторов инициации трансляции и поли(А)-связывающего белка PABP способствуют узнаванию и связыванию мРНК с малой рибосомной субчастицей (см. обзор Gallie, 1998; Wells et al., 1998). У эукариот выбор инициаторного кодона главным образом осуществляется по механизму сканирования, при этом 40S рибосомная субчастица связывается с кэппированым 5 -концом мРНК и движется в 5 -3 направлении пока не достигнет инициаторного кодона, которым обычно является первый попавшийся AUG кодон (Kozak, 1989). Кроме того, возможны альтернативные механизмы инициации, связанные с наличием таких элементов мРНК, как короткие открытые рамки считывания (uORF), кэп-независимые трансляционные элементы (CITEs) или внутренние участки посадки рибосом (IRES структуры) (см. обзоры Shatsky et al., 2010, 2014; Martnez-Salas et al., 2012).
Архейные мРНК, подобно бактериальным, не кэппированы и не полиаденилированы, часто полицистронны (см. обзор Dennis, 1997; Kyrpides and Woese, 1998a), и имеют последовательность Шайна-Дальгарно, главным образом, перед внутренними цистронами (Tolstrup et al., 2000). У первых цистронов полицистронных мРНК и моноцистронных мРНК архей часто отсутствует последовательность Шайна-Дальгарно, либо они начинаются непосредственно с инициаторного AUG кодона, такие мРНК называют безлидерными (Slupska et al., 2001; Brenneis et al., 2007). На основании типов мРНК различают следующие способы реализации связывания мРНК с рибосомой у архей.
Один из механизмов основан на каноническом взаимодействии последовательности Шайна-Дальгарно мРНК с 16S рРНК, который реализуется на внутренних цистронах полицистронных мРНК (Cond et al., 1999; Tolstrup et al., 2000). Эксперименты по мутагенезу in vitro и in vivo в археях показали, что нарушение последовательности Шайна-Дальгарно имеет неблагоприятное воздействие, приводящее к ослаблению или полной остановке синтеза белка (Cond et al., 1999; Sartorius-Neef and Pfeifer, 2004). Однако в случае археи Haloferax volcanii нарушение последовательности Шайна-Дальгарно, расположенной в 5 -НТО мРНК, не влияло на эффективность трансляции (Kramer et al., 2014).
Следующий способ взаимодействия характерен для безлидерных мРНК. Для ассоциации 30S субчастицы с безлидерными мРНК строго необходимо присутствие инициаторной тРНК (Benelli et al., 2003). Полагают, что за счет кодон-антикодонового взаимодействия между мРНК и тРНК происходит посадка малой рибосомной субчастицы на иницииаторный AUG кодон, в результате чего стартовый кодон, расположенный на 5 -конце матрицы оказывается прямо в Р-участке рибосомной субчастицы. На сегодняшний день механизм трансляции безлидерных мРНК остается малоизученным. Безлидерные мРНК также имеются у бактерий и эукариот (Janssen, 1993) и могут транслироваться всеми типами рибосом, независимо от их происхождения (Grill et al., 2000). Это позволило предположить, что безлидерные мРНК предшествовали всем другим типам мРНК и широко использовались организмами, существовавшими до эволюционного расхождения трех доменов жизни. Стоит отметить, что в бактериях и эукариотах инициация трансляции на безлидерных мРНК может осуществляться недиссоциированными 70S или 80S рибосомами и в отсутствии факторов инициации трансляции (Balakin et al., 1992; O Donnell and Janssen, 2002; Udagawa et al., 2004; Moll et al., 2004; Andreev et al., 2006).
В 2009 году был экспериментально охарактеризован новый тип инициации трансляции у архей, который осуществляется на лидерсодержащих мРНК, не имеющих последовательность Шайна-Дальгарно (Hering et al., 2009). Эффективность трансляции таких мРНК сильно зависела от длины 5 -НТО (минимальный размер – 15 н. о.) и ее вторичной структуры (отсутствие стабильных шпилек непосредственно перед стартовым кодоном). Авторы предполагают, что при данном механизме инициации трансляции происходит внутренняя посадка малой рибосомной субчастицы на мРНК. Однако элементы, способствующие такому взаимодействию, остаются невыявленными. Например, у бактерий в связывании мРНК, не содержащих последовательность Шайно-Дальгарно, участвует рибосомный белок S1 (Boni et al., 2001). Тогда как у архей и ряда бактерий белок S1 отсутствует (см. обзор Benelli and Londei, 2011).
В инициации трансляции важную роль играют белковые факторы, которые существенно усиливают связывание мРНК с малой рибосомной субчастицей и делают это взаимодействие более избирательным. У бактерий в этом процессе участвуют три мономерных фактора: IF1, IF2 и IF3 (Табл. 1).
Получение компетентных клеток E. coli с применением хлорида кальция
В последние годы с помощью крио-электронной микроскопии были получены модели 43S преинициаторного комплекса млекопитающих (с разрешением 11.6 и содержащего 40S, eIF1, eIF1A, eIF2GTPMet-тРНКi и eIF3) (Hashem et al., 2013), и 48S преинициаторного комплекса дрожжей (с разрешением 4.0 и содержащего 40S, eIF1, eIF1A, eIF2GTPMet-тРНКi и мРНК) (Hussain et al., 2014), в которые авторы вписали структуру полноразмерного архейного тройственного комплекса aIF2GDPNPMet-тРНКf (Schmitt et al., 2012) (Рис. 9а). Анализ полученных моделей показал, что фактор инициации трансляции 2 связан с малой рибосомной субчастицей посредством -субъединицы, причем расположение 1 и 2 доменов этой субъединицы отличается от их расположения в структуре изолированного архейного тройственного комплекса (Schmitt et al., 2012). В составе преинициаторных комплексов эти домены повернуты на 45 градусов к «платформе» и смещены на 15 в направлении «шеи» 40S рибосомной субчастицы так, что 1 домен eIF2 располагается вблизи рибосомного белка S5. Было показано, что в такой ориентации eIF2 находится вблизи E-участка малой рибосомной субчастицы, а в присутствии мРНК – непосредственно в E-участке, где структурно имитирует молекулу тРНК. При этом 1 домен eIF2 контактирует с нуклеотидными остатками мРНК в положении -2 и -3, 2 домен взаимодействует с D- и T-петлями инициаторной тРНК, а 3 домен – с акцепторным черешком тРНКi и -субъединицей eIF2. Согласно модели 43S преинициаторного комплекса, eIF2 находится на расстоянии 34 от спирали h44 18S рРНК; однако авторам не удалось вписать -субъединицу eIF2 ввиду отсутствия соответствующей электронной плотности (Hashem et al., 2013). Структура 48S преинициаторного комплекса (Hussain et al., 2014) была определена с разрешением 4.0 , но разрешение ухудшалось с увеличением расстояния от малой рибосомной субчастицы, по-видимому, из-за увеличения подвижности элементов на периферии комплекса, в связи с чем построить модель для -субъединицы eIF2 в составе преинициаторного комплекса не удалось. Кроме того, в структуре отсутствовала интерпретируемая электронная плотность для eIF2 (Hussain et al., 2014).
Совсем недавно были опубликованы модели дрожжевого 48S преинициаторного комплекса, находящегося в «открытом» и «закрытом» состояниях (до и после узнавания инициаторного кодона антикодоном тРНКi, соответственно) и содержащего 40S, eIF1, eIF1A, eIF2GTPMet-тРНКi, eIF3 и мРНК (Llcer et al., 2015). В этой работе авторам удалось построить модель только части eIF2, за исключением неструктурированных N-концевых 1-125 а. о. и последних двадцати C-концевых остатков белка, т.е. только той части eIF2, которая соответствует -субъединице архейного фактора aIF2. Анализ полученных моделей показал, что eIF2 напрямую не контактирует с 40S субчастицей. N-концевая -спираль eIF2 прочно связана с eIF2, а центральный домен -субъединицы взаимодействует с eIF1, eIF1A и тРНКi (Рис. 9б). Необходимо отметить, что в полученных моделях структура тройственного комплекса была определена только с низким разрешением, 15 , и для интерпретации электронной плотности были использованы структуры субъединиц архейного фактора aIF2.
Таким образом, несмотря на значительные успехи в построении моделей эукариотического преинициаторного комплекса, их анализ не вносит ясность в структурную организацию e/aIF2ГТФMet-тРНКi.
Модель эукариотического 48S преинициаторного комплекса, полученная с помощью криоэлектронной микроскопии. Рисунок с небольшими изменениями взят из Hussain et al., 2014. (б) Взаимное расположение eIF1, eIF1A, eIF2, тРНКi и мРНК в 48S комплексе. Рисунок с небольшими изменениями взят из Llcer et al., 2015. 2.4. aIF5B
Универсальный фактор инициации трансляции e(a)IF5B/IF2 обнаружен во всех доменах жизни: у бактерий это IF2, а у эукариот и архей он обозначается как e/aIF5B.
Бактериальный фактор IF2 в процессе инициации трансляции выполняет две функции. Аналогично e/aIF2, фактор IF2 способствует связыванию инициаторной тРНК с малой рибосомной субчастицей, не влияя на связывание других тРНК. Согласно кинетическим исследованиям IF2 в комплексе с ГТФ сначала взаимодействует с малой рибосомной субчастицей, а затем связывает fMet-тРНКf, где ГТФ служит эффектором, придающим IF2 повышенное сродство к 30S субчастице (Dubnoff et al., 1972; Mazumder, 1972; Antoun et al., 2006; Milon et al., 2010). В отсутствии рибосомы комплекс IF2 с fMet-тРНКf является нестабильным (Miller and Wahba, 1973). Второй функцией IF2 является катализ присоединения 50S субчастицы к инициаторному 30S комплексу с образованием 70S комплекса. Связанный с ГТФ, fMet-тРНКf и с 30S рибосомной субчастицей фактор IF2 взаимодействует с 50S субчастицей, что приводит к активации гидролиза ГТФ, и комплекс IF2ГДФ покидает рибосому (Dubnoff et al., 1972; Godefroy-Colburn et al., 1975).
Фактор e/aIF5B был впервые обнаружен в дрожжах S. cerevisiae (Choi et al., 1998) и впоследствии найден у других эукариот (Lee et al., 1999; Wilson et al., 1999; Carrera et al., 2000) и архей (Lee et al., 1999). Первоначально считалось, что подобно IF2 в клетках эукариот и архей e/aIF5B стимулирует связывание инициаторной тРНК с малой рибосомной субчастицей и более того, катализирует образование первой пептидной связи (Choi et al., 1998). Было сделано предположение, что e/aIF5B связывается с А-участком рибосомы, имитируя тРНК частью своей молекулы, и таким образом, направляет инициаторную тРНК в вакантный Р-участок (Lee et al., 1999). Однако позднее было показано, что аналогично IF2 фактор e/aIF5B необходим только для быстрой ассоциации субчастиц в активную транслирующую рибосому (Pestova et al., 2000). Как и в случае IF2, взаимодействие e/aIF5B с рибосомными субчастицами происходит в ГТФ-связанной форме. Объединение субчастиц стимулирует ГТФазную активность фактора, в результате чего e/aIF5B теряет сродство к рибосоме. Считается, что дальнейший обмен ГДФ на ГТФ в комплексе e/aIF5ВГДФ происходит самопроизвольно (Pestova et al., 2000). Результаты исследований in vitro архейного фактора aIF5B S. solfataricus подтвердили, что aIF5B является рибосомо-зависимой ГТФазой, которая взаимодействует с 30S и 50S субчастицами, так и с целой рибосомой даже в отсутствии других факторов инициации трансляции и инициаторной тРНК. Кроме того было показано, что aIF5B усиливает трансляцию как лидерсодержащих, так и безлидерных мРНК в бесклеточной системе трансляции (Maone et al., 2007).
Универсальный фактор e(a)IF5B/IF2 – многодоменный мономерный белок. Бактериальный фактор IF2 имеет молекулярную массу 60-100 кДа. В его аминокислотной последовательности выделяют низкоконсервативную N-концевую область, которая у IF2 E. coli состоит из доменов I-III, и высококонсервативную C-концевую область, включающую IV-VI домены (Рис. 10) (Steffensen et al., 1997). IV(G) домен содержит ГТФ/ГДФ связывающий сайт. VI домен делят дополнительно на домены VI-1 (C1) и VI-2 (C2). Установлено, что изолированный VI-2 домен связывает инициаторную тРНК с тем же сродством (Kd 910–7 М), что и полноразмерный фактор IF2 (Spurio et al., 2000). В экспериментах с использованием модифицированных препаратов fMet-тРНКf, а также с помощью сайт-направленного мутагенеза IF2 и ЯМР спектроскопии было показано, что субстратом VI-2 домена IF2 является формилированная -NH2-группа fMet-тРНКf, благодаря узнаванию которой IF2 отличает fMet-тРНКf от неформилированной Met-тРНКf и деацилированной тРНКf (Sundari et al., 1976; Guenneugues et al., 2000). Среди различных видов бактерий N-концевая часть IF2 может содержать повторы (Simonetti et al., 2013a) и сильно варьировать по содержанию аминокислотной последовательности и длине. Кроме того, наблюдается внутривидовое разнообразие форм фактора. Так в клетках E. coli IF2 существует в виде трех функционально активных изоформ: полноразмерного белка и двух укороченных с N-конца форм (Nyengaard et al., 1991). Разнообразие в N-концевой части IF2, по-видимому, и привело к использованию в литературе различных вариантов обозначений доменов белка (Рис. 10).
Эукариотический фактор eIF5B имеет приблизительную молекулярную массу 140-175 кДа. Архейный фактор aIF5B (около 70 кДа) укорочен с N-конца на 400-600 а. о. по сравнению с его гомологами IF2 и eIF5B (Рис. 10). Несмотря на это различие, aIF5B может заменять eIF5B in vitro и in vivo (Choi et al., 1998; Lee et al., 1999), а удаление N-концевой части IF2 (Laalami et al., 1991) и eIF5B (Choi et al., 1998) не влияет на жизнеспособность клеток. Характерной особенностью архейного и эукариотического факторов e/aIF5B является наличие на C-конце дополнительного спирального субдомена, состоящего из двух -спиралей, который отсутствует у бактериального IF2 (Roll-Mecak et al., 2000).
Препаративное выделение и очистка гетеротримера aIF2 S. solfataricus из клеток штаммов-суперпродуцентов E. coli
Препарат мРНК прогревали при 65С в буфере «Н» в течение 5 мин, а затем охлаждали 1 мин во льду. -Субъединицу aIF2 смешивали с мРНК в эквимолярном соотношении и выдерживали при комнатной температуре (25C) 10-15 мин. Нуклеотид (ГТФ или ГДФ) добавляли либо к мРНК-белковому комплексу, либо к белку до того, как смешать его с мРНК. Объем препарата составлял 20 мкл. Концентрация РНК, белка и нуклеотида в смеси – 10 мкМ каждого, в экспериментах с ompAмРНК – 2 мкМ каждого. Образцы инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре. При необходимости готовили двойной объем смеси и после 10 мин инкубации при 25C делили смесь на две части: одну оставляли при 25C, а другую прогревали 5 мин при 65С. Анализ РНК-белковых комплексов проводили с помощью электрофореза в ПААГ в неденатурирующих условиях.
Для проведения гель-шифта РНК-белковые комплексы подвергали электрофорезу в вертикально расположенных пластинах геля размером 78 см и толщиной 0.75 мм в аппарате Mini Proteаn II. Состав геля: 8% ПААГ (С = 5%), 90 мМ Трис-ацетат, рН 7.8, 10 мМ MgCl2. Препарат комплекса смешивали с равным объемом буфера для образцов: 180 мМ Трис-ацетата, рН 7.8, 20 мМ MgCl2, 20% глицерина или сахарозы и 0.02% бромфенолового синего. Условия электрофореза: электродный буфер – 90 мМ Трис-ацетат, рН 7.8, 10 мМ MgCl2; напряжение – 90 В. Электрофорез прерывали после полного выхода бромфенолового синего из геля. Для визуализации РНК гель красили бромистым этидием (0.5 мкг/мл) и анализировали по ультрафиолетовому поглощению в трансиллюминаторе; либо гель окрашивали в растворе, содержавшем 0.25% толуидинового синего, 5% уксусной кислоты и 10% этанола в течение 15-20 мин при комнатной температуре и затем отмывали краску из геля в теплой воде.
Электрофорез в описанных условиях также проводили для определения связывания aIF2 с флуоресцентно-меченым нуклеотидом (MANT-GDP), при этом меняли полярность электродов. MANT-GDP в геле визуализировали в ультрафиолетовом свете, затем для визуализации белков гель окрашивали кипячением в растворе, содержавшем 0.1% кумасси G-250, 10% уксусной кислоты и 30% этанола, в течение 5 мин. Избыток красителя из геля вымывали теплой 7%-ной уксусной кислотой в течение 25-30 мин. РНК-белковые комплексы подвергали электрофорезу в горизонтально расположенных пластинах 3%-ного геля агарозы размером 7100.7 см в аппарате Mini-Sub Cell GT. Буфер геля – 90 мМ Трис-ацетат, рН 7.8, 5 мМ MgCl2. Бромистый этидий вводили непосредственно в гель до концентрации 1 мкг/мл. Препарат комплекса смешивали с равным объемом буфера 180 мМ Трис-ацета, рН 7.8, 20 мМ MgCl2, 20% глицерина или сахарозы, 0.02% бромфенолового синего. Образцы вносили в слоты, расположенные на середине геля и начинали электрофорез. Условия электрофореза: электродный буфер – 90 мМ Трис-ацетат, рН 7.8, 5 мМ MgCl2; напряжение – 90 В. Электрофорез прерывали в тот момент, когда до выхода бромфенолового синего из геля оставался 1 см. РНК в комплексе анализировали по ультрафиолетовому поглощению в трансиллюминаторе. Для оценки присутствия белка в комплексе гель окрашивали в растворе, содержавшем 0.1% кумасси G-250, 10% уксусной кислоты и 30% этанола, в течение ночи при комнатной температуре. Избыток красителя из геля вымывали диффузией в 7%-ной уксусной кислоте.
Биотинилирование фрагмента РНК Фрагменты мРНК, полученные транскрипцией in vitro с использованием Т7 РНК-полимеразы, были очищены согласно методике, описанной в пункте 4.1. Олигонуклеотид с фосфатной группой на 5 -конце и с молекулой биотина на 3 -конце 5 -GCGCAGCGAG-биотин-3 (Синтол) присоединялся к фрагменту РНК с помощью фермента T4 РНК-лигазы. Реакционная смесь (50 мкл) содержала по 60 мкМ фрагмента мРНК и биотинилированного олигонуклеотида, 1 мМ гексамин хлорид кобальта (III), 4% диметилсульфоксида, 0.1 мг/мл БСА, 5 мкл соответствующего буфера 10-ти кратной концентрации, 25 ед. активности РНК-лигазы. Перед добавлением фермента смесь прогревали в течение 5 мин при 60С. Реакцию лигирования проводили в течение 3 часов при 37С, после чего РНК высаживали тремя объемами этанола и 1/10-той объема 3 М ацетата натрия, рН 5.5 в течение ночи при -20С. Затем РНК собирали центрифугированием (30 мин, 12 500 g, 4С) и очищали с помощью электрофореза в ПААГ в денатурирующих условиях (пункт 4.4). Нужную полосу вырезали, гель измельчали растиранием между двумя листами парафильма. Элюцию РНК проводили в 500 мкл буфера 100 мМ Трис-HCl, рН 7.5, 500 мМ NaCl, 0.5% ДСН, 10 мМ ЭДТА, рН 8.0 в течение 2 часов при 22С на шейкере. Затем суспензию геля центрифугировали 10 мин при 12 500 g и 4С, раствор РНК смешивали с равным объемом смеси фенола и хлороформа (1:1) и тщательно встряхивали до образования однородной эмульсии. Для разделения фаз эмульсию центрифугировали (14 000 g, 3-5 мин, 4С). Депротеинизацию проводили 1-2 раза до полного исчезновения интерфазы. Затем водную фазу отбирали и осаждали из нее РНК тремя объемами этанола и 1/10-той объема 3 М ацетата натрия, рН5.5, в течение ночи при -20С. Далее РНК собирали центрифугированием (14 000 g, 30 мин, 4С) и растворяли в 50 мкл (до концентрации 0.3 мг/мл) буфера «П», используемого в экспериментах по связыванию на приборе ProteOn XPR36 (Bio-Rad, США). Препарат биотинилированной РНК расфасовывали по 3 мкл и замораживали при -20С.
Для проверки эффективности присоединения биотинилированного олигонуклеотида к фрагменту мРНК полученный препарат смешивали со стрептавидином в эквимолярных количествах и анализировали методом электрофореза в ПААГ в денатурирующих условиях (пункт 4.4).
Модификация поверхности чипа Чип NLS промывали в соответствии с рекомендациями фирмы-изготовителя трехкратными инъекциями раствора 1 M NaCl, 50 мМ NaOH со скоростью протока 30 мкл/мин. Биотинилированную РНК прогревали 5 мин при 60C, охлаждали до комнатной температуры. Все дальнейшие эксперименты проводились при 25С. Препарат РНК разводили в 500 раз буфером «П» и впрыскивали по одному из каналов чипа со скоростью протока 30 мкл/мин до достижения единиц ответа 400-500 RU. Несвязанную с поверхностью чипа РНК отмывали 0.05% раствором ДСН.
Препаративное выделение и очистка инициаторной тРНК E. coli из клеток штамма-суперпродуцента
Несмотря на структурную гомологию -субъединицы aIF2 с бактериальным фактором элонгации EFu, связывание Met-тРНКi с aIF2 происходит иначе, чем связывание элонгаторных аминоацил-тРНК с фактором EFu: взаимодействие элонгаторной тРНК с фактором элонгации EFu идет через Т-шпильку (Nissen et al., 1995, 1999), тогда как инициаторная тРНК взаимодействует с фактором инициации aIF2 D-шпилькой (Рис. 20а, б). Таким образом, различия в нуклеотидной последовательности T-шпильки инициаторной и элонгаторных тРНК могут предотвращать связывание инициаторной тРНК с EFu, а различия в D-шпильке могут предотвращать связывание элонгаторных тРНК с aIF2.
Одновременно с нами французской группой была определена структура тройственного комплекса, содержащего полноразмерный гетеротример aIF2, в котором однако отсутствовала электронная плотность для большей части -субъединицы (Schmitt et al., 2012). Данная структура была определена с более низким разрешением (5 ), и принципиально отличается от полученной нами структуры. Несмотря на то, что в обеих структурах архейного тройственного комплекса тРНК обращена к белку со стороны D-петли, в этих двух моделях она взаимодействует с разными участками - и -субъединиц aIF2 (Рис. 20б, в). В нашей структуре наиболее существенный контакт образуется между доменом III aIF2 и D-шпилькой тРНК, что соответствует биохимическим данным и данным химического пробинга (Yatime et al., 2004; Shin et al., 2011a), тогда как в предложенной французской группой модели домен III -субъединицы не участвует в связывании тРНК, а самые обширные контакты образуются между тРНК и 1 и 2 доменами -субъединицы, которые по биохимическим данным и по данным пробинга с гидроксильными радикалами не должны взаимодействовать с тРНК.
Схематическое изображение пространственных структур комплексов (а) EFuGDPNPPhe-тРНКphe Т. aquaticus (PDB код 1TTT), (б) aIF2D3GDPNPMet-тРНКf S. solfataricus (PDB код 3QSY) и (в) aIF2GDPNPMet-тРНКf S. solfataricus (PDB код 3V11). Римскими цифрами 1(G), II, III обозначены домены EFu и аШ2; домены -субъединицы aIF2 обозначены Dl, D2 и D3. В молекуле тРНК синим цветом обозначен акцепторный черешок, красным - D-шпилька, голубым - антикодоновая шпилька, оранжевым - вариабельная петля, зеленым - Т-шпилька; черным отмечен ССА-конец тРНК. NtH - -концевая -спираль aIF2.
Анализ взаимодействий между соседними молекулами в кристалле комплекса aIF2GDPNPMet-тРНКf показывает, что -концевые домены -субъединиц соседних молекул комплекса занимают положение между тРНК и III доменом -субъединицы, мешая их сближению (Рис. 21). В кристалле эти два домена -субъединицы контактируют с тРНК разными участками, что коррелирует с их способностью неспецифически взаимодействовать с РНК, которая была ранее показана в биохимических экспериментах (Yatime et ah, 2004). Можно предположить, что короткоживущие варианты комплекса, которые могут образовываться в растворе, могли в условиях кристаллизации оказаться более подходящими для упаковки в кристалле. Для кристаллизации тройственного комплекса французской группой был использован ПЭГ в качестве осаждающего агента: 5% (w/v) ПЭГ 20 000, 200 мМ KCl, 50 мМ MES, pH 5.7, 10 мМ MgCl2. Возможно, невысокая ионная сила в условиях кристаллизации способствовала сохранению неспецифических контактов между aIF2 и тРНК.
Кристаллическая упаковка комплекса aIF2GDPNPMet-тРНКf. Домены - и -субъединиц aIF2 обозначены римскими и арабскими цифрами, соответственно. Положение между акцепторным черешком тРНКf и III доменом -субъединицы занимают 1 и 2 домены -субъединицы ( sym) соседней молекулы комплекса. NtH – N-концевая -спираль aIF2.
Несмотря на существующие противоречия структурных и биохимических данных, структура aIF2GDPNPMet-тРНКf, определенная французской группой, была использована для интерпретации электронной плотности тройственного комплекса в составе структур эукариотического преинициаторного комплекса, полученных с помощью криоэлектронной микроскопии. Так с разрешением 11.6 была построена модель 43S комплекса млекопитающих, который содержал 40S рибосомную субчастицу, eIF3, тройственный комплекс eIF2ГТФMet-тРНКi и РНК хеликазу Dhx29 (Hashem et al., 2013). Кроме этого в группе В. Рамакришнана с помощью криоэлектронной микроскопии были получены структуры дрожжевого 48S комплекса, включающего 40S субчастицу, eIF1, eIF1A, eIF2ГТФMet-тРНКi и мРНК (Hussain et al., 2014) и дополнительно eIF3 (Llcer et al., 2015) (см. Рис. 9 в разделе «Обзор литературы»). В определенной с разрешением 4.0 структуре 48S комплекса (Hussain et al., 2014) обнаружены обширные контакты между тРНКi и -субъединицей eIF2, однако авторам не удалось построить модель для -субъединицы (видна только ее N-концевая -спираль) и -субъединицы eIF2. В полученных совсем недавно моделях 48S комплекса (Llcer et al., 2015) была дополнительно построена модель eIF2, но только той ее части, которая соответствует -субъединице архейного фактора aIF2. Однако в этой работе структура тройственного комплекса была определена с более низким разрешением, 15 . Таким образом анализ полученных на сегодняшний день моделей эукариотических 43S и 48S преинициаторных комплексов не вносит ясность в структурную организацию e/aIF2ГТФMet-тРНКi.
Хотя наша структура тройственного комплекса хорошо согласуется и с биохимическими данными и с результатами прямого пробинга комплекса гидроксильными радикалами, нельзя исключать, что отсутствие 1 и 2 доменов -субъединицы aIF2 привело к изменению взаимной ориентации тРНК и белка, что, в свою очередь, обусловило более выгодные условия для связывания ССА конца тРНК в щели между I и III доменами -субъединицы. Чтобы устранить существующие противоречия и установить истинную структуру комплекса, мы приступили к кристаллизации различных вариантов тройственного комплекса в новых условиях.
Для образования тройственных комплексов мы получили два варианта архейного гетеротримера aIF2, отличающиеся размером -субъединицы: была использована как полноразмерная aIF2, так и укороченная с N-конца на один домен форма белка (aIF2D23). Для удаления подвижного 1 домена aIF2 с помощью генно-инженерных методов была проведена замена кодона Asp88 на ATG кодон. Выделение aIF2D23, а также -субъединицы aIF2 осуществляли с использованием двух последовательных гидрофобных хроматографий. Гомогенный препарат комплекса aIF2 получали путем смешивания -субъединицы aIF2 с небольшим избытком aIF2 в молярном соотношении 1 : 1.2 и проводили гель-фильтрацию на смоле супердекс-75, после чего центральные фракции пика комплекса анализировали с помощью электрофореза в денатурирующих условиях. Аналогично путем добавления небольшого избытка aIF2D23 к препарату гетеродимера получали гетеротример aIF2D23.
Полноразмерный гетеротример aIF2 был выделен и очищен по ранее разработанной схеме (Stolboushkina et al., 2008). Согласно этой методике образование комплекса происходит при смешивании прогретых клеточных лизатов для каждой из субъединиц aIF2 с последующей очисткой гетеротримера с помощью ионообменной и аффинной хроматографий на S- и гепарин-сефарозе, соответственно.
В дальнейшем препараты гетеротримеров aIF2D23 и aIF2 использовали для образования тройственных комплексов аналогично получению комплекса aIF2D3GDPNPMet-тРНКf. Поиск условий кристаллизации был проведен с использованием наборов растворов Natrix (Hampton Research, США), Nucleix, AmSO4 (QIAGEN, Германия) и NucPro (Jena Bioscience, Германия) для кристаллизации РНК-85 белковых комплексов. Кристаллы комплексов были получены в условиях №29 Natrix, в которых осаждающим реагентом был хлорид лития (Табл. 11). Тонкие гексагональные пластинки появлялись при 4C через 3-5 дней и легко таяли при повышении температуры. Для оптимизации условий были использованы наборы растворов Additive Screen и Silver Bullets (Hampton Research, США). Такие добавки, как NDSB, 1,8-диаминооктан и 1,6-диаминогексан растворяли образующийся в капле осадок и способствовали росту кристаллов в толщину (до 70 мкм). Использование натриевой соли полиакриловой кислоты (ПАК) способствовало появлению округлых, но мелких (20-30 мкм) кристаллов. С наиболее крупных кристаллов комплекса aIF2GDPNPMet-тРНКf на синхротроне в Берлине (линия BL14.1 станции BESSY II, Германия) нам удалось собрать набор дифракционных данных, но только с низким разрешением (4.8 ). В настоящее время мы продолжаем оптимизировать условия кристаллизации.