Введение к работе
Актуальность проблемы. Для получения противовирусных вакцинных препаратов требуется большое количество живых клеток чувствительных к вирусам , которое можно было бы использовать в условиях производства. Такой запас клеток можно сохранять при сверхнизких температурах (-196С), что позволит иметь необходимое количество генетически однородного материала.
При хранении клеток и тканей при температурах + 20... -70С в них происходят многие физиологические процессы и фазовые физико-химические переходы, которые сопровождаются накоплением продуктов жизнедеятельности и морфоструктурными изменениями. Даже при температурах -120... -130С происходит рекристаллизация растворов, которая приводит к деформациям в биологических объектах (А. М. Воротилин и др., 1984). Эти процессы не позволяют длительно сохранять клеточные культуры и другие биологические объекты в вышеуказанных условиях. При криоконсервировании и хранении клеток в жидком азоте не наблюдается температурных перепадов, все биохимические и физические процессы сильно замедлены. Поэтому наиболее надёжным и перспективным способом сохранения биологических объектов на клеточном уровне является криоконсервирование до температуры сжиженных газов (азота, кислорода, гелия и др.).
Интенсивное развитие криобиологической науки в начале 50-60 годов нашего века привело к значительным успехам в области консервирования соматических и половых клеток растительного и животного происхождения. Криоконсервирование стало неотъемлемой частью технологии производства некоторых вакцин против бактериальных и вирусных инфекций, а также надёжным способом сохранения коллекционных культур микроорганизмов (Е.Е.Никитин, И.В.Звягин, 1971) и тканевых культур (В.Н.Опарин и др., 1970, Н.С.Юдина, 1970, Л.Н.Миронова и др., 1973, И.С.Кучмасов, 1974, Ю.В.Дьяченко и др. 1974, Д.М.Мэй, 1976, Б.Т.Стегний,1982, И.И.Малыгина и др., 1984).
В приготовлении культурапьной противоящурной вакцины важные этапом является получение матровой расплодкн клеточной культуры, имеющее одно происхождение, источником её в обычных производственных условиях как правило, служит партия однородных паспортизованных клеток, хранящихс? при сверхнизких тсмпературах(-196С) в ампулах ёмкостью 1-5 мл. Обычно и: такого объёма суспензии нарабатывают промышленную партию клеток і течение 2-3 пассажей в монослое, а затем клетки выращивают в суспензии і сосудах объёмом 3-5 литров. Полученную расплодку клеток культивируют і реакторах большей ёмкости. Проведение указанных этапов требует длительной: времени и усложняет технологический процесс производства вакцины. В связі с этим актуальной является разработка метода хранения перевиваемых культур клеток при низких температурах _в количествах, достаточных для начал, первичного культивирования в объёмах 5-10 литров, а затем в реактора? большого объёма. Однако остаются нерешёнными вопросы, связанные < оптимизацией режимов замораживания-оттаивания больших количесті клеточных культур, и не установлены допустимые концентрации клеток которые бы не влияли на последующую выживаемость клеток после оттаиванш и культивирования в больших объёмах. Несмотря на то, что в настоящее врем; используется большое количество криопротекторов при замораживании клеток нет единого мнения о возможности применения любого криопротектора прі замораживании большого количества клеток одновременно и влияши криопротекторов на жизнеспособность клеток после оттаивания. Не отработань оптимальные режимы замораживания больших количеств матровых клеточны: культур с криопротекторами, не изучены вопросы, связанные і чувствительностью клеточных культур после замораживания-оттаивания і вирусу ящура.
Все эти вопросы являются актуальными и необходимыми при разработю методов крупномасштабного культивирования клеток и вирусов при разработю производства противоящурных вакцин.
Цель исследования. Основной целью данных исследований была отработка оптимальных режимов замораживания-оттаивания больших объёмов матровы.х расплодок культур клеток с сохранением исходных биологических свойств для промышленного культивирования клеток и вируса ящура при производстве культуральных противоящурных вакцин.
Для достижения основной цели необходимо было решить следующие задачи:
-сконструировать, построить и апробировать в производственных условиях лабораторные установки для замораживания больших объёмов клеточной суспензии ВЫК-21/2;
-отработать оптимальные режимы замораживания клеточных суспензий в ёмкостях большого объёма;
-обосновать максимальную концентрацию клеток, которая в созданных условиях криоконсервирования не влияет на выживаемость клеток после оттаивания;
-подобрать криопротекторы, пригодные для замораживания перевиваемых клеток в больших объёмах;
-изучить влияние разработанных условий криоконсервирования на пролиферативную активность клеток и их чувствительность к вирусу яшура после оттаивания;
-разработать методы тестирования свойств клеточных культур после криоконсервирования.
Научная ношппа. В результате проведённых исследований:
-разработан метод криоконсервирования клеток ВНК-21/2 в объёмах 75-80 мл., который обеспечивает возможность после оттаивания клеток выращивать их в культиваторах, начиная с объёмов 5-10 литров, минуя монослойную стадию;
-сконструированы, построены и испытаны лабораторные установки для замораживания больших объёмов клеточной суспензии, которые оказались более экономичными по сравнению с программными замораживателямн;
-изучено защитное действие на клетки веществ разной химической природы, ряд из которых обладает хорошими криопротективными свойствами по отношению к клеточной культуре ВНК-21/2. Впервые в качестве криопротектора при замораживании клеточной суспензии в больших объёмах обоснован и предложен этиленгликоль, который обладал хорошими защитными свойствами по отношению к перевиваемой клеточной культуре ВНК-21/2 при замораживании до температуры -196СС;
-для тестирования и изучения физиологического состояния клеток после криоконсервирования предложен комплекс различных методов, включающих: цейтрафферпую киносъёмку, люминесцентную микроскопию, определение дзета-потенциала и др;
-изучены морфофункциональные криоповреждения в клетках ВНК-21 с использованием окраски акридиновым оранжевым;
-проведена оценка физиологического состояния клеток по их морфологии при криоконсервировании с помощью различных методов.
Практическая ценность. На основе проведённой работы:
-разработана методика криоконсервирования клеток, которая утверждена директором ВНИЯИ и рекомендована для использования в промышленных условиях при производстве культуральной противоящурной вакцины. Эта методика в настоящее время используется в качестве этапа(технологической стадии) при наработке промышленного количества клеточной культуры ВНК-21/2 при изготовлении противоящурных вакцин;
-предложены оптимальные условия замораживания-оттаивания и хранения перевиваемой культуры ВНК-21/2 в стеклянных ёмкостях с объёмом замораживаемой суспензии 75-80 мл., при концентрации клеток 25 млн/мл с применением в качестве криопротектора этиленгликоля в концентрации 5%. При этих условиях криоконсервирования клетки после оттаивания и культивирования сохраняют чувствительность к вирусу ящура;
-изготовлены и внедрены в лабораториях и производственных цехах две лабораторные установки на основе сосуда Дыоара СД-40 для замораживания клеточных культур;
-предложен метод цейтрафферной киносъёмки для изучения структуры и активности клеток ВНК-21, замороженных под защитой этиле игл и кол я.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены: на научных конференциях Всесоюзного научно-исследовательского ящурного института (ВНИЯИ, а затем -ВНИИЗЖ), посвященных проблеме ящура в 1980, 1983, 1986, 1987, 1988, 1995, 1997 годах; на второй Всесоюзной конференции по теоретическим и прикладным проблемам криобиологии и криомедишшы (Харьков, 9-11 октября 1984 г.);на рабочем совещании стран членов СЭВ по ящуру в ГДР (о. Риме, 1981г.); в ЧССР, (г. Терезин, 1984 г.); на первой Всесоюзной конференции по биотехнологии ( Москва, ВИЭВ, июнь 1986 г.); на втором Симпозиуме специалистов стран членов СЭВ по проблеме ящура (НРБ, 1987 г.); на Всесоюзной научно-технической конференции «Применение биотехнологий в животноводстве и ветеринарии» (Ленинград, октябрь, 1988г.); на второй Международной конференции «Успехи современной криобиологии» (Харьков, апрель, 1992 г.).
Положения, выносимые на защиту.
-
Оптимизация режимов криоконсервирования культур клеток при промышленном производстве культуральных вакцин.
-
Подбор и обоснование криопротекторов при криоконсервировании клеточных культур.
3. Изучение физиологического состояния культур клеток после
замораживания-оттаивания и определение чувствительности к вирусу ящура.
4. Создание лабораторной установки для замораживания больших
объёмов клеточной суспензии.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 21 печатная
работа.
Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 156
страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы,
собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и практических
предложений. Работа иллюстрирована 20 таблицами и 46 рисунками. Список
использованной литературы включает 210 источников, из них 65 на иностранных языках.