Содержание к диссертации
Введение
3. Обзор литературы 11
3.1. Вирус иммунодефицита человека первого типа 11
3.2. Феномен широкой нейтрализации 13
3.2.1. Регион связывания с CD4 16
3.2.2. MPER регион gp41 19
3.2.3. Вершина тримера gp120 20
3.2.4. Регион петли V3 23
3.2.5. Стык gp120/gp41 25
3.3. Разработка вакцин, индуцирующих широконейтрализующие антитела 30
3.3.1. Первые иммуногены и гуморальный иммунный ответ 30
3.3.2. В-клеточные иммуногены, вызывающие наработку широконейтрализующих антител 31
3.3.2.1. Пептидные иммуногены 32
3.3.2.2. Иммуногены-скафолды 33
3.3.2.3. Доменные иммуногены 34
3.3.2.4. Иммуногены на основе кора gp120 35
3.3.2.5. Мономерный gp 120 36
3.3.2.6. Ненативные env-тримеры 36
3.3.2.7. Нативно-подобные тримеры Env 38
3.3.2.8. Искуственные полиэпитопные иммуногены 39
3.4. Феномен псевдотипирования и системы оценки вируснейтрализации 42
3.4.1. Феномен псевдотипирования 43
3.4.2. Лентивирусные системы 44
3.4.3. Клетки, используемые для анализа нейтрализующей активности 46
3.4.4. Панели env-псевдовирусов как доминирующая система оценки гуморального анти-ВИЧ ответа 48
4. Материалы и методы 52
4.1. Материалы 52
4.2. Методы 55
5. Результаты и их обсуждение 71
5.1. Получение и характеристика полиэпитопных ВИЧ-иммуногенов, несущих имитаторы эпитопов нейтрализующих антител широкого спектра действия 71
5.1.1. Рекомбинантные белки, несущие пептид-имитатор эпитопа, узнаваемого антителом 2F5 71
5.1.2. Рекомбинантные белки, несущие пептид-имитатор эпитопа, узнаваемого антителом 2G12 78
5.2. Конструирование и характеристика панели env-псевдотипированных вирусов ВИЧ-1 84
5.2.1. Конструирование плазмиды pcDNA3.1-env 85
5.2.2. Получение env-псевдовирусов 88
5.2.3. Определение субтипа генов env, использованных при получении псевдовирусов 92
5.2.4. Определение тропизма псевдовирусов для их характеристики 95
5.2.6. Определение оптимальной концентрации клеток для инфицирования псевдовирусами 97
5.2.7. Определение оптимальной концентрации псевдовирусов для инфицирования
5.2.8. Определение оптимальной вносимой концентрации DEAE-декстрана для усиления сигнала люминисценции 99
5.2.9. Характеристика псевдовирусов при помощи МКА 100
5.3. Оценка вируснейтрализующей активности иммуногенов, несущих пептиды-имитаторы широконейтрализующих антител 103
6. Заключение 107
7. Выводы 108
8. Благодарности 109
9. Список цитируемой литературы 110
- Стык gp120/gp41
- Панели env-псевдовирусов как доминирующая система оценки гуморального анти-ВИЧ ответа
- Рекомбинантные белки, несущие пептид-имитатор эпитопа, узнаваемого антителом
- Оценка вируснейтрализующей активности иммуногенов, несущих пептиды-имитаторы широконейтрализующих антител
Введение к работе
Актуальность темы. В настоящее время в мире зарегистрировано более 36 миллионов ВИЧ-инфицированных. В России число людей с ВИЧ-инфекцией каждый год существенно увеличивается и только по официальной статистике составляет более 1 млн. Высокая опасность, которую несет ВИЧ, требует разработки новых способов профилактики и лечения этой инфекции. Современная высокоактивная антиретровирусная терапия позволяет увеличить продолжительность жизни, но не обеспечивает элиминацию патогена из организма ВИЧ-инфицированного. Поэтому создание вакцины, способной предотвратить заражение этим вирусом, является крайне необходимой мерой для остановки пандемии СПИДа.
Основная трудность в разработке вакцины против ВИЧ заключается в необычной биологии патогена: вирус размножается в клетках иммунной системы хозяина, постепенно разрушая ее; он чрезвычайно изменчив и существует в инфицированном организме в виде «квазивида» - набора вирусных вариантов, отличающихся друг от друга, что приводит к постоянному «ускользанию» вируса из-под давления иммунной системы.
Сравнительно недавно из сывороток ВИЧ-инфицированных были выделены антитела с поразительными вируснейтрализующими характеристиками, в том числе антитела 2F5 и 2G12. Некоторые из них способны нейтрализовать более 90% всех известных штаммов ВИЧ-1. Все известные антитела, обладающие нейтрализующей активностью в отношении множества различных изолятов вируса иммунодефицита, обеспечивают определенный уровень защиты от заражения на доступных моделях приматов. Возможность включения в состав рекомбинантной вакцины эпитопов, которые бы вызывали наработку подобных антител, выглядит весьма заманчиво. Считается, что создание иммуногена, способного индуцировать спектр таких антител, может обеспечить достаточную защиту против ВИЧ-1.
Однако на практике реализовать такую идею не так просто, поскольку большинство эпитопов, узнаваемых широконейтрализующими антителами, являются конформационными, структуру которых весьма сложно воспроизвести в составе искусственных иммуногенов. Решением проблемы может быть получение рекомбинантных молекул, которые содержат в своем составе имитаторы таких эпитопов в виде линейных аминокислотных последовательностей. Получить такие
имитаторы можно с помощью фаговых пептидных библиотек, путем проведения процедуры аффинной селекции с широконейтрализующими моноклональными антителами (МКА).
Весьма важной и необходимой процедурой на всех этапах разработки вакцины против ВИЧ является анализ вируснейтрализующей активности сывороток животных и человека после проведения иммунизации. На сегодняшний день одним из самых популярных методов анализа нейтрализующей активности антител, оценки антиретровирусной активности препаратов является технология псевдовирусов ВИЧ-1. Этот метод позволяет работать с вирусными частицами из множества вирусных субтипов, обеспечивать высокий уровень воспроизводимости и производительности, применять простые и безопасные реагенты.
В настоящее время существуют панели псевдовирусов разных субтипов: A, В, C, G, CRF01AE, CRF07BC (например, референс-панель ewv-клонов ВИЧ-1 различных субтипов, входящих в список NIH AIDS Reagent Program). Однако ни в одну существующую панель не входят ewv-псевдовирусы, полученные из изолятов, циркулирующих на территории Сибирского федерального округа.
Несомненно, что при разработке национальной вакцины для тестирования ее специфической активности необходимо использовать псевдовирусы как из международной панели, так и на основе циркулирующих на территории России субтипов ВИЧ-1.
Целью данной работы было конструирование полиэпитопных иммуногенов, содержащих пептиды-имитаторы эпитопов, узнаваемых МКА 2F5 и 2G12, и изучение их способности индуцировать наработку нейтрализующих антител.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
получить иммуногены, содержащие пептиды-имитаторы эпитопов ВИЧ-1, узнаваемых МКА 2F5 и 2G12;
иммунизировать лабораторных животных полученными конструкциями;
создать панель ewv-псевдовирусов;
изучить нейтрализующую активность сывороток крови иммунизированных
животных с использованием ewv-псевдовирусов.
Научная новизна и практическая ценность. В ходе исследования были получены иммуногены, несущие в своем составе пептиды-имитаторы 2F5- и 2G12-эпитопов.
Впервые получена коллекция env-псевдовирусов субтипов, распространенных на территории Западной Сибири.
Депонировано в международной базе данных GenBank
() 3 полных генома ВИЧ-1 (KJ197200.1-KJ197202.1), 22 фрагмента области генов pol и gag ВИЧ-1 (KJ197203.1-KJ197224.1), 15 фрагментов гена env ВИЧ-1 (KJ197185.1-KJ197199.1).
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Искусственный белок TBI способен служить в качестве каркаса для экспонирования пептидов-имитаторов эпитопов ВИЧ-1.
-
Пептиды-имитаторы в составе белка-носителя способны вызывать наработку нейтрализующих антител. Сыворотки крови мышей, иммунизированных рекомбинантными белками с включенными в состав пептидами-имитаторами, обладают нейтрализующей активностью в отношении env-псевдовирусов ВИЧ-1.
-
В состав полученной панели псевдовирусов, сконструированной на основе изолятов ВИЧ-1, циркулировавших на территории Сибирского федерального округа в 2015-2016 гг., входят 17 env-псевдовирусов, 15 из них относятся к рекомбинантной форме CRF63_02A1, а два – к субтипу А1. Созданную коллекцию env-псевдовирусов субтипов ВИЧ-1, распространенных в Сибирском Федеральном округе, можно использовать для проверки нейтрализующей активности иммуногенов против ВИЧ-1.
Апробация работы и публикации. Материалы работы были представлены на всероссийских и международных конференциях, в том числе: 5-й Конференции по патогенности, лечению и профилактике ВИЧ (г. Кейптаун, ЮАР, 2009 г); 9-й Конференции по вакцинам против СПИДа (г. Париж, Франция, 2009 г); XVIII Международной конференции по СПИДу (г. Вена, Австрия, 2010 г); 3-й и 5-й Международной Конференции по ВИЧ/СПИДу в Восточной Европе и Центральной Азии (г. Москва, Россия, 2009 г и 2016 г); II Международной конференции молодых ученых: биотехнологов, молекулярных биологов и вирусологов (п. Кольцово, Россия, 2015), по итогам которых опубликован 21 тезис.
По результатам работы опубликовано девять статей, из них пять - в журналах из списка ВАК Минобрнауки России.
Личный вклад автора. Большинство экспериментов и анализ полученных
данных выполнены лично автором. Конструирование иммуногена TBI-2G12
выполнено совместно с Чикаевым А.Н. Электронные микрофотографии
псевдовирусных частиц выполнены Зайцевым Б.Н., Тарановым О.С., отдел микроскопических исследований ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор». Секвенирование ДНК выполнено Бондарем А.А., ЦКП «Геномика» ИХБФМ СО РАН. Масс-спектрометрический анализ подготовленных образцов белков выполнен Дужак Т.Г., Институт цитологии и генетики СО РАН. Оценка вируснейтрализующей активности сывороток иммунизированных животных с использованием env-псевдовирусов ВИЧ-1 субтипа В проводилась Шаламовой Л.А., отдел зоонозных инфекций и гриппа ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор». Молекулярный докинг пептида-имитатора 2F5 эпитопа с МКА 2F5 проводился Бакулиной А.Ю., теоретический отдел ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор».
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 150 страницах, включает 34 рисунка, 11 таблиц. Список литературы включает 308 источников.
Стык gp120/gp41
В 2012 г при помощи технологии клеточного сортинга Кляйн Ф. (Klein F.) с соавторами получил широконейтрализующие антитела 3BC315 и 3BC176, для которых не удалось определить эпитопы [106]. Последующие попытки определить регион их связывания оказывались безуспешными. Настоящий прорыв произошел, когда для анализа их эпитопов использовали растворимые тримеры BG505 SOSIP.664 gp140. Технология стабилизированных тримеров gp140 в сочетании с криоэлектронной микроскопией высокого разрешения совершили революцию в анализе трехмерной структуры комплекса bNab-Env [3]. С использованием этого подхода эпитопы антител 3BC315 и 3BC176 были локализованы в районе gp41 [107]. Аналогична история изучения антитела 8ANC195. Первоначально это антитело было получено в рамках работы по поиску аналогов VRC01, однако в отличие от других антител, полученных в этом исследовании, оно проявляло аномальный профиль нейтрализации и значительно отличалось по аминокислотной последовательности вариабельных фрагментов [108]. Использование криоэлектронной микроскопии высокого разрешения позволило точно определить место контакта 8ANC195 c Env [109]. Эпитопы антител 3BC315, 3BC176 и 8ANC195 включают фрагмент как gp41, так и gp120. Стык gp41 и gp120 является пятым регионом уязвимости ВИЧ-1 [3]. Антитела, связывающиеся с этим регионом, более разнородны по строению, чем представители других групп. Антитело 8ANC195 для проникновения сквозь углеводы N234 и N276 вместо одиночной удлиненной CDR петли имеет удлиненный выступающий вариабельный домен тяжелой цепи, контактируя в большей степени с gp120 [109]. Антитела 3BC315/3BC176, наоборот, в большей степени взаимодействуют с gp41. За счет CDRH3 эти антитела контактируют с а.о. в регионе HR1-HR2, гликан gp120 в позиции N88 стабилизирует образовавшийся комплекс [107] (рисунок 3.5). Антитело 35О22 имеет схожий участок связывания, что и 3BC315, однако угол наклона Fab-фрагмента относительно оси Env отличается [110].
Группа антител, PGT151-158, взаимодействующих с gp120/gp41, была получена К. Блатнер (C. Blattner) с соавторами. Антитело PGT151 обладает удлиненными CDRH3 и CDRL1 петлями и способно взаимодействовать с Env в конформации, которую образует этот комплекс перед слиянием вирусной и клеточной мембран. Ключевую роль во взаимодействии играют гликаны gp41 в позициях N637 и N611. Интересной особенностью антител серии PGT151-158 является их способность опосредовать АЗКЦ [112, 113].
Результаты, полученные при изучении антител, нейтрализующих широкий спектр первичных изолятов ВИЧ-1, стали целой вехой не только в понимании особенностей гуморального иммунитета против оболочечных вирусов, но и позволили поднять на новый уровень методы получения эффективных антивирусных иммуноглобулинов.
Панели env-псевдовирусов как доминирующая система оценки гуморального анти-ВИЧ ответа
Клинические испытания вакцин против ВИЧ-1 требуют соблюдения стандартов GCLP при проведении анализов. Используемые методы должны быть валидированы. Валидация включается в себя определение специфичности, точности, линейности, ранжированности, аккуратности, пределов детекции, пределов количественных определений [275].
Плазмидные env-клоны стабильны, хорошо охарактеризованы, они могут быть легко и быстро переданы из лаборатории в лабораторию. Использование env экспрессирующих плазмид для производства env-псевдотипированных вирусов гарантирует, что в любое время в лаборатории может быть произведено достаточное количество псевдовирусов с определенным генотипом. Это, а также простота культивирования клеток TZM-bl, сделали эту систему чувствительной, воспроизводимой и удобной в применении.
Группой исследователей под руководством Д. Монтефиори (D. Montefiori) была проведена оптимизация, стандартизация и валидация нейтрализационного анализа с использованием псевдовирусов и клеток TZM-bl по стандартам GCLP для работы в различных международных лабораториях [276–278]. Кроме того, был оптимизирован и валидирован метод для проведения анализа в автоматизированном режиме в 384-луночных планшетах [278]. Данные стандарты продвигаются между лабораториями при поддержке CAVD и CA-VIMC (США) и в настоящее время оценка анти-ВИЧ- вакцин в клинических испытаниях по нейтрализации во многих лабораториях ведется согласно этим стандартам (табл. 3.3).
Для снижения различия в чувствительности метода и повышения воспроизводимости А. Шульц (А. Schultz) была предложена автоматизированная система по получению псведовирусов ВИЧ-1 [279]. Она состоит из роботизированной платформы, машины для подсчета клеток, СО2-инкубатора и холодильника со средой. Вся система находится в ламинарном шкафу 2-го класса безопасности. Процедуры пересева клеток, трансфекции и сбора вирус-содержащего супернатанта полностью автоматизированы. Такая система позволяет получать до литра вирус-содержащего супернатанта в неделю. Метод полностью валидирован по стандартам GCLP.
Практика показывает, что env-псевдовирусная система в сочетании с генно-инженерными клетками стали «золотым стандартом» в работах, связанных с нейтрализацией ВИЧ-1 [280, 281]. Созданы и создаются панели псевдовирусов разных субтипов, в такие панели включают генетически разнородные псевдовирусы, не обладающие необычной чувствительностью или устойчивости к нейтрализации. Получены и охарактеризованы панели псевдовирусов субтипов А [282], В [283, 284], С [285], D [282], F [280], G [280], CRF02_AG [284]. Кроме того, под руководством Д. Монтефиори (D. Montefiori) создана глобальная панель env-клонов ВИЧ-1 для стандартизации исследований нейтрализующих антител, нарабатываемых на введение вакцины [286]. Данная панель включает в себя 12 env-клонов субтипов, наиболее распространенных в мире и полученных в разных регионах: A, В, C, G, CRF01_AE, CRF07_BC [283, 286].
Необходимо отметить, что для исследования адекватной нейтрализующей активности не требуется использование большого разнообразия псевдовирусов. М. Симек (М. Simek) c соавторами показал, что широкая нейтрализующая активность сывороток крови против множества субтипов ВИЧ-1 может быть исследована на панели, включающей небольшое количество вирусов [7].
По чувствительности к нейтрализации моноклональными антителами и поликлональными сыворотками ВИЧ-инфицированных, изоляты ВИЧ-1 и соответствующие им псевдовирусы разделили на 3 группы [167]. Небольшое количество циркулирующих вариантов ВИЧ-1 и соответствующих им псевдовирусов, обладающих выраженной чувствительностью к нейтрализации, отнесли к группе 1. Варианты этой группы спонтанно демаскируют высоко иммуногенные эпитопы на поверхности вариабельных петель и корецептор-связывающий сайт на gp120 [287, 288]. У большинства вариантов ВИЧ-1 и псевдовирусов эти эпитопы спрятаны, и вирусы обладают средней чувствительностью к нейтрализации, они отнесены к группе 2. К группе 3 отнесена небольшая часть популяции вирусов и псевдовирусов, которые обладают низкой чувствительностью к нейтрализации МКА и поликлональными сыворотками. Так как большинство циркулирующих изолятов ВИЧ-1 относятся к группе 2, то создаваемые панели, как правило, содержат такие псевдовирусы.
Для оценки нейтрализующей активности антител, индуцируемых иммуногенами, Дж. Маскола (J. Mascola) с соавторами [245] предложил 3-х ярусный алгоритм проверки новых иммуногенов (рис.3.7).
В результате проверки на 1 уровне с использованием гомологичных и небольшого количества гетерологичных вирусных штаммов будут обнаружены иммуногены, которые вызывают наработку минимального уровня нейтрализующих антител. Иммуногены, прошедшие проверку на 1 уровне, могут проходить проверку на 2-м. Здесь они будут проверены на способность вызывать наработку нейтрализующих антител против панели из 12 гетерологичных штаммов ВИЧ-1, одинакового с вакциной субтипа. И, наконец, на 3 уровне вакцины будут проверены на способность вызывать наработку антител, нейтрализующих вирусы других субтипов.
Исследование в области антител, нейтрализующих первичные изоляты ВИЧ-1, начатые в конце прошлого века, привели к открытию феномена широконейтрализующих антител. С одной стороны, оказалось, что, несмотря на беспрецедентную аминокислотную изменчивость и мощный углеводный щит, поверхностный гликопротеин имеет регионы, обладающие высокой долей консерватизма, и являющиеся точками уязвимости для широконейтрализующих антител. С другой стороны, исследование ширко нейтрализующих антител позволило раскрыть механизмы, благодаря которым иммунной системе удается бороться с ВИЧ-1. Открытие широконейтрализующих антител также дает надежду на создание вакцины против этого вируса. К сожалению, несмотря на все попытки, вакцина против ВИЧ-1 так и не была создана. Разработка иммуногена, способного вызывать наработку широконейтрализующих антител – это путь, который может привести к созданию В-клеточной компоненты будущей вакцины. Попытки создания подобного иммуногена ведутся в нескольких направлениях и требуют использования простых и надежных методов оценки гуморального иммунного ответа. Один из таких методов – использование env-псевдовирусов ВИЧ-1. Этот метод позволяет вести оценку нейтрализующей активности поликлональных сывороток крови, моноклональных антител и ингибиторов слияния. Не будет преувеличением сказать, что этот метод занял доминирующую роль среди методов оценки поствакцинального иммунного ответа.
Рекомбинантные белки, несущие пептид-имитатор эпитопа, узнаваемого антителом
Особенностью широконейтрализующего антитела 2G12 является то, что оно узнает высокогликозилированный эпитоп в области V3-петли белка gp120 вируса иммунодефицита человека. Необходимо было получить пептид, имитирующий сахарные остатки эпитопа 2G12, чтобы затем включить его в искусственный иммуноген.
С использованием 2G12, была проведена аффинная селекция из фаговой пептидной библиотеки, содержащей пептиды длиной 15 а.о., экспонированные в составе минорного белка оболочки нитчатого бактериофага [296]. У всех 36 фаговых клонов, отобранных в результате аффинной селекции, была исследована специфичность связывания с МКА 2G12 при помощи ИФА. В дальнейшем был отобран клон, содержащий пептид VGAFGSFYRLSVLQS, дающий максимальный положительный сигнал в ИФА.
В качестве белка-носителя мы так же, как и в предыдущем случае, использовали белок TBI, поскольку накопленный опыт работы с данным белком позволяет эффективно оценивать иммунный ответ и сравнивать рекомбинантные иммуногены на его основе между собой.
Чтобы не нарушать конформацию TBI, мы решили заменить С-концевой фрагмент белка на пептид-имитатор VGAFGSFYRLSVLQS, который по вторичной структуре оказался наиболее близок этому фрагменту.
Было проведено клонирование синтезированных олигонуклеотидов, кодирующих отобранный пептид-имитатор, в составе плазмиды pTBI, с использованием сайтов рестрикции Bsp13I и ApaI. В результате была получена плазмида pTBI-2G12, включающая нуклеотидные последовательности, кодирующие пептид-имитатор, вместо последовательности, кодирующей концевой участок белка TBI.
Полученной рекомбинантной плазмидой были трансформированы клетки E.coli JM103. Продукцию химерного белка TBI-2G12 в бактериальных клетках оценивали с помощью электрофореза в 12 % ПААГ. Количество рекомбинантного белка оказалась низкой. Его удавалось обнаружить лишь с помощью иммуноблотинга (рисунок 5.7.).
Поэтому для увеличения выхода химерного белка TBI-2G12 было решено перенести ген TBI-2G12 в плазмиду pET21a, содержащую сильный промотор РНК-полимеразы фага Т7. Попутно была удалена избыточная последовательность длиной 20 а.о. белка recA, располагающаяся на N-конце исходного белка TBI и несущественная для индукции гуморального ответа против ВИЧ-1. С этой целью была получена ПЦР-копия гена TBI с использованием праймеров, содержащих сайты рестрикции NdeI и XhoI. Этот фрагмент встраивали по указанным сайтам в вектор pET21а. Полученной конструкцией трансформировали клетки E.coli BL21. Схема клонирования представлена на рис. 5.7.
Наличие целевого белка TBI-2G12 в Е.соli BL21 подтверждали при помощи электрофореза в 12 % ПААГ. С помощью иммуноблота с антисывороткой против RecA TBI было показано, что индуцированные ИПТГ трансформированные клетки содержат целевые белки молекулярной массой 16 кДа, которая соответствовала расчетной (рисунок 5.8).
Очистку рекомбинантного белка TBI-2G12 проводили аналогично белку TBI 2F5. В результате был получен электрофоретически гомогенный препарат рекомбинантного белка TBI-2G12, что было подтверждено при помощи MALDI-масс-спектрометрии (рисунок 5.9).
Для оценки гуморального иммунного ответа проводили иммунизацию мышей линии BALB/c рекомбинантными белками TBI (группа 1), TBI-2G12 (группа 2) и физиологическим раствором (группа 3 – контроль).
Сыворотки были проанализированы с помощью ИФА. В первую очередь проводилась оценка способности сывороток связываться с исходным белком TBI, который, соответственно, использовали в качестве антигена. Анализ показал, что сыворотки мышей, иммунизированных TBI-2G12, так же эффективно узнают TBI, как и положительный контроль: сыворотки к исходному белку TBI (рисунок 5.10).
Далее специфичность сывороток оценивали с помощью синтетического пептида-имитатора VGAFGSFYRLSVLQS, сорбированного на ИФА-планшеты (рисунок 5.11). Из графика видно, что сыворотки мышей, иммунизированных TBI-2G12, узнают пептид-имитатор эпитопа, в то время как сыворотки к исходному TBI его не узнают.
Более того, специфичность антител сыворотки иммунизированных животных была показана при помощи иммуноблота (New-Lav-Blot1, Bio-Rad) (рисунок 5.12). На рисунке видно, что антитела сывороток животных, иммунизированных как исходным белком TBI, так и новым TBI-2G12, узнают нативные белки ВИЧ-1, сорбированные на полоски тест-системы.
Таким образом, в результате проведенной работы были получены две генетические конструкции, кодирующие искусственные полиэпитопные белки, которые содержат линейные эпитопы и имитаторы конформационных эпитопов ВИЧ-1. Отработана процедура очистки рекомбинантных белков, оценены их иммуногенные свойства на модели лабораторных животных. Показано, что рекомбинантные белки TBI-2F5 и TBI-2G12 индуцируют образование антител, которые связываются с белками ВИЧ-1, с белком TBI и синтетическими пептидами-имитаторами эпитопов, узнаваемых МКА 2F5 и 2G12. Таким образом, можно предположить, что рекомбинантные белки TBI-2F5 и TBI-2G12 способны индуцировать антитела, подобные антителам широкого спектра действия 2F5 и 2G12. На следующем этапе была проведена оценка нейтрализующей активности сывороток мышей, иммунизированных белками TBI-2F5 и TBI-2G12, по методу, описанному в [292], и с использованием env-псевдовирусов ВИЧ-1, о чем подробнее будет описано в части 5.3. настоящей главы.
Оценка вируснейтрализующей активности иммуногенов, несущих пептиды-имитаторы широконейтрализующих антител
В настоящее время общепринятым считается, что успешная вакцина или ее компонент, если речь идет о многокомпонентной вакцине, должны вызывать наработку широконейтрализующих антител. Появление таких антител способно предотвратить проникновение ВИЧ-1 в организм, защитив от заражения [3]. Предпринято большое попыток количество попыток разработать иммуноген, способный вызвать наработку таких антител [396, 303, 304]. Распространенным методом анализа нейтрализующих антител, возникающих в ответ на иммунизацию, является использование панелей env-псевдовирусов [16].
Финальным этапом нашей работы стало исследование вируснейтрализующей активности сывороток с помощью стандартной и полученной нами панели псевдовирусов.
Полученные после иммунизации рекомбинантными белками TBI-2F5 и TBI-2G12 сыворотки мышей были проверены на способность нейтрализовать псевдовирусы ВИЧ-1.
В работе использовались 5 псевдовирусов: 3 полученных нами псевдовируса рекомбинантной формы CRF63_02A1: Nov_1, Nov-2, Nov-4 и 2 субтипа В: QH0692.42, PVO.4.
Сначала было определено значение разведения сывороток, обеспечивающее 50 % нейтрализации псевдовирусов (рисунок 5.25).
Как видно из рисунка 5.26, сыворотка мышей, иммунизированных белком TBI-2F5, показала лучшую способность нейтрализовать устойчивый к нейтрализации псевдовирус PVO.4 (уровень 3), по сравнению с белком TBI-2G12 и исходным белком TBI.
Таким образом, было показано, что сыворотки мышей, иммунизированных рекомбинантными белками, обладают нейтрализующей активностью против двух псевдовирусов субтипа В и трех - CRF6302A1.
Чтобы оценить способность встроенных пептидов-имитаторов (RDWSFDRWSLSEFWL для TBI-2F5 и VGAFGSFYRLSVLQS для TBI-2G12) индуцировать нейтрализующие антитела, мы определили, какой процент среди нейтрализующих антител нарабатываются на вставку пептида-имитатора. Была проведена конкуренция синтетических пептидов RDWSFDRWSLSEFWL и GAFGSFYRLSVLQS с псевдовирусами за связывание с антителами сывороток крови. Концентрация пептидов - 2 мкг/мл и 7 мкг/мл (табл. 5.6).
Как видно из таблицы 5.6, в случае иммуногена TBI-2F5 со всеми псевдовирусами наблюдалось снижение связывания псевдовирусов с антителами сывороток и, следовательно, уменьшение нейтрализующего действия антител. Это происходит вследствие связывания пептида со специфическими антителами на вставку, таким образом, можно говорить, что пептиды в процессе иммунизации вызывают индукцию специфических антител. В случае пептида-имитатора 2G12-эпитопа, только в реакции с псевдовирусом QH0692.42 наблюдалось ингибирование связывания с антителами сыворотки. При анализе сывороток мышей, иммунизированных белком TBI, конкуренции с пептидом RDWSFDRWSLSEFWL не наблюдалось.
Таким образом, иммунизация белком TBI-2F5 вызывает наработку нейтрализующих антител, специфически взаимодействующих с пептидом-имитатором RDWSFDRWSLSEFWL.
Для оценки суммарного действия нейтрализующих антител, нарабатываемых на пептиды-имитаторы обоих эпитопов, был проведен анализ нейтрализующей активности совокупности сывороток мышей, полученных после иммунизации иммуногенами TBI-2F5 и TBI-2G12. Реакцию нейтрализации проводили с использованием двух псевдовирусов субтипа В: QH0692.42 и PVO.4.
Оказалось, что при проведении нейтрализации смесью сывороток, для смесей наблюдается увеличение нейтрализующей активности, по сравнению с нейтрализующей активностью отдельных сывороток (табл. 5.7).
Как видно из таблицы 5.7, в случае псевдовируса QH0692.42, суммарная нейтрализующая активность достигла значения 46,5 %, в то время как по-отдельности значения нейтрализации были ниже. Интересно так же отметить, что сыворотка крови мышей, полученная после иммунизации TBI-2G12, была не способна нейтрализовать псевдовирус PVO.4, однако усиливала нейтрализующую активность сыворотки крови мышей, иммунизированных TBI-2F5: с 28 % до 42 %. Это может говорить о кооперативном действии антител, нарабатываемых в ответ на введение созданных нами иммуногенов. На это необходимо обращать внимание при создании и испытании B-клеточных иммуногенов.