Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 17
1.1 Вирус гепатита С и организация его генома 17
1.2 Строение и функции core-белка 24
1.3 Эпидемический процесс гепатита С у детей в РФ 28
1.4 Особенности клинического течения гепатита С у детей 32
1.5 Лабораторная диагностика HCV-инфекции 36
1.6 Соге-Ag как новый маркер HCV-инфекции 38
1.7 Заключение по обзору литературы 41
Глава 2. Материалы и методы исследования 43
2.1 Объём исследования и характеристика пациентов 43
2.2 Дизайн исследования 47
2.3 Методы обследования 49
2.4 Статистическая обработка данных 55
Глава 3. Результаты исследования 57
3.1 Результаты качественного и количественного определения core-Ag у детей 57
3.2 Зависимость концентрации core g от вирусных факторов у детей с ХГС 61
3.2.1 Зависимость содержания core g от концентрации РНК HCV 61
3.2.2 Зависимость концентрации core g от субтипа вируса 64
3.3 Зависимость содержания core g от специфических антител у детей с ХГС..74
3.3.1 Взаимосвязь core g и anti-core IgM 74
3.3.2 Взаимосвязь core g и anti-core IgG 79
3.4 Клиническое и прогностическое значение core g при ХГС у детей 86
3.4.1 Клинико-анамнестические характеристики детей с ХГС 87
3.4.2 Анализ потенциальной связи core-Ag и клинико-анамнестических данных детей с ХГС у детей 92
3.4.3 Изучение связи core-Ag и биохимических данных у детей с ХГС 95
3.4.4 Связь core-Ag и фиброза печени у детей с ХГС 100
Глава 4. Обсуждение и заключение 104
Выводы 118
Практические рекомендации 119
Перспективы дальнейшей разработки темы
- Строение и функции core-белка
- Методы обследования
- Зависимость концентрации core g от субтипа вируса
- Анализ потенциальной связи core-Ag и клинико-анамнестических данных детей с ХГС у детей
Введение к работе
Актуальность темы исследования и степень ее разработанности
В Российской Федерации (РФ) отмечается неблагоприятная
эпидемиологическая ситуация по вирусному гепатиту С, доля серопозитивных лиц составляет около 4% [Daw M.A. et al., 2016; Petruzziello A. et al., 2016]. Анализируя особенности современной эпидемиологической ситуации по гепатиту С в РФ, специалисты указывают на значительное снижение заболеваемости острым гепатитом С [Mukomolov S.L. et al., 2011; Pimenov N.N. et al., 2012]. Вместе с тем, общий показатель хронически инфицированных лиц очень высокий – 335,8 на 100 тысяч [Mukomolov S. et al., 2016]. Надо учесть, что хронический гепатит С у некоторых взрослых имеет истоки в детском или подростковом возрасте. Проблема гепатита С у детей остается злободневной в связи с ростом количества женщин детородного возраста, инфицированных вирусом гепатита С (HCV), и риском вертикальной передачи вируса [Кистенева Л.Б. и др., 2012]. Развитие хронической HCV-инфекции в детском возрасте может привести к развитию цирроза печени, гепатоклеточной карциномы и тяжелым внепеченочным проявлениям в молодом возрасте.
Современный этап диагностики вирусного гепатита С отмечается разработкой и внедрением в клиническую практику тест-систем для определения core-антигена (core-Ag). Более 15 лет проводились работы по созданию тест-систем для определения core-Ag с высокой аналитической чувствительностью [Takahashi K еt аl., 1992; Tanaka T.еt аl., 1995; Masolova O.V. et al., 1998; Aoyagi K. et. al., 1999; Icardi G. et. al., 2003; Morota K. et. al., 2009; Ross R.S. et. al., 2010].
Параллельно изучались структура, свойства и функции core-белка. Стало известно, что core-белок вызывает в инфицированной клетке окислительный стресс [Korenaga M. еt аl., 2005; Ivanov A.V. еt аl., 2016], нарушение метаболизма липидов [Perlemuter G. et al., 2002; Tsutsumi T. et al., 2002; Hourioux C. et al., 2007; Tanaka N. еt аl., 2008], нарушение защитных антивирусных механизмов [Lukens J.R. et al., 2008; Stone A.E. et al., 2014], индуцирует канцерогенез [Yamanaka T. et al., 2002; Fujinaga H. et al., 2011] и фиброгенез [Sansonno D. еt аl., 1995; Benzoubir N. et al., 2013].
Диагностическая значимость обнаружения core-Ag у взрослых пациентов рассматривалось в работах ряда исследователей [Morota K. еt аl., 1995; Icardi G. еt аl., 2003; Ross R.S. еt аl. 2010; Ergnay K. еt аl., 2011; Park Y. еt аl., 2010; Tedder S. еt аl., 2013]. Но, несмотря на имеющиеся успехи в области изучения этого антигена и разработки новых диагностических тест-систем для его выявления, многие клинико-диагностические и прогностические аспекты оставались неясными к моменту начала диссертационной работы. В первую очередь это относится к пониманию значения обнаружения core-Ag у детей с хроническим гепатитом С (ХГС). Лишь в одной статье, посвященной изучению диагностической значимости этого антигена, были включены дети: из 272 анализируемых сывороток только 11 были детскими [Ergnay K. еt аl., 2011]. Не отражены в научной литературе данные, касающиеся взаимосвязи core-Ag и РНК HCV у инфицированных детей, зависимости количественных значений этого
антигена от субтипа вируса, связи его содержания с клинической картиной заболевания, биохимической активностью гепатита и развитием фиброза печени, а также связи anti-core IgM и IgG с количественными значениями антигена.
Из всего вышесказанного следует актуальность проведения настоящего исследования.
Цель исследования – изучить клинико-диагностическое и прогностическое значение core-Ag вируса гепатита С у детей с хронической HCV-инфекцией.
Задачи
-
Установить диагностическую значимость core-Ag как маркера HCV-инфекции у детей и количественные значения его определения.
-
Оценить взаимосвязь содержания core-Ag и концентрации РНК HCV в крови с учетом субтипа вируса.
-
Проанализировать зависимость концентрации core-Ag от наличия и содержания специфических антител к данному антигену.
-
Изучить клиническое и прогностическое значение выявления core-Ag в сыворотке крови детей с ХГС.
Научная новизна
Впервые у детей изучена диагностическая значимость определения core-антиген при ХГС. Учитывая, что содержание core-антигена у детей колебалось в широком диапазоне значений, впервые были установлены пограничные значения для концентрационных диапазонов: до 200 фмоль/л, 200–2500 фмоль/л и более 2500 фмоль/л.
Впервые оценена взаимосвязь выявления вирусной РНК и core-антигена в сыворотке крови детей с ХГС. Установлено, что корреляционная зависимость между содержанием core-антигена и РНК HCV оценивается как сильная и прямая. Полученные данные свидетельствуют о том, что core-антиген является маркером репликативной активности вируса гепатита С.
Впервые при изучении структуры генотипов HCV у детей выявлен
межгенотипный рекомбинантный вариант RF_2k/1b. Установлено, что
доминирующими субтипами HCV в исследуемой группе детей с ХГС являются 1b и 3а.
Впервые для детей с ХГС уточнены показатели соотношений концентраций
core-антигена и РНК HCV при различных субтипах. Впервые установлено, что
более высокие значения core-антигенемии характерны для детей,
инфицированных HCV субтипа 3а, чем при субтипе 1b.
Впервые установлена возможность отсутствия антител к core-Ag на фоне его высокого содержания у детей с ХГС.
Впервые проведена комплексная оценка взаимосвязи core-антигена с клинико-лабораторными и инструментальными данными для детей с ХГС. Впервые установлено, что низкие значения концентрации core-антигена (ниже 200 фмоль/л) характерны для стадии клинико-биохимической ремиссии и связаны с низким риском развития фиброза печени, в то время как высокие значения core-Ag в крови ассоциированы с активностью патологического процесса и фиброзом печени у детей с ХГС.
Теоретическая и практическая значимость работы
Учитывая ограниченное количество маркеров HCV-инфекции (anti-HCV и РНК HCV) и наличие сложных в диагностике клинических случаев, надо отметить практическое значение core-антигена в качестве дополнительного маркера этой инфекции. Показано, что core-Ag может быть определен в крови детей с высокой чувствительностью и специфичностью сравнимой с данными заявленными производителем тест-системы «ARCHITECT HCV Ag» (Abbott; США). Установленная прямая взаимосвязь между концентрацией core-Ag и РНК НСV в крови детей с ХГС, что позволяет оценивать репликативную активность вируса гепатита С по концентрации этого антигена.
Практическое значение имеют установленные в данном исследовании соотношения РНК HCV и core-антигена при различных субтипах вируса, влияние которых необходимо учитывать при оценке вирусной нагрузки по содержанию core-Ag. Найденные различия в соотношениях РНК HCV и core-антигена в зависимости от субтипов вируса имеют и теоретическое значение, связанное с недостаточной изученностью наличия дефектных частиц HCV в крови пациентов и ролью этих частиц в патогенезе заболевания.
Существенный теоретический и практический интерес представляет факт обнаружения у детей с ХГС межгенотипного рекомбинантного варианта HCV RF_2k/1b, особенности распространения и патогенеза которого требуют дальнейшего изучения. Для эпидемиологического контроля за HCV-инфекцией у детей, для планирования и разработки схем терапии, значимыми являются сведения о высокой доли HCV субтипов 3а и 1b среди инфицированных.
Теоретический и практический интерес представляет информация о возможности обнаружения в сыворотке крови пациентов с ХГС core-антигена при отсутствии anti-core IgG и anti-core IgM. Данный факт требует дальнейшего изучения для установления возможных причин этого явления и его влияния на течение болезни.
Найденная связь содержания core-антигена c биохимической активностью гепатита и частотой выявления фиброза печени у детей имеет практическое и теоретическое значение. Так, с одной стороны, эта связь позволяет использовать значения core-антигена как один из критериев прогноза течения ХГС у детей и, с другой стороны – подтверждает данные о значительной патогенетической роли core-антигена в течение гепатита С.
Методология и методы исследования
Методологическая основа диссертационной работы спланирована согласно
поставленной цели исследования и включает последовательное применение
методов научного познания с целью решения поставленных задач. Исследование
клинико-диагностического и прогностического значения core-Ag у детей
выполнено по принципу проспективного когортного исследования с
использованием метода гнездного исследования «случай – контроль». Был произведен забор образцов крови у всех пациентов с наличием или неоднозначными результатами анализа на anti-HCV в крови, затем сделан анализ крови тех пациентов, у которых был установлен ХГС и у подобранной в рамках
той же выборки контрольной группы, у которых гепатит С не подтвердился.
Дизайн клинических исследований носит сравнительный открытый характер с
использованием эпидемиологических, клинических, биохимических,
вирусологических, серологических, молекулярно-генетических, аналитических и статистических методов исследования.
Личный вклад автора состоит в самостоятельном сборе анамнестических
данных пациентов, клиническом осмотре, катамнестическом наблюдении,
планировании схем обследования, определении РНК HCV, anti-сore IgG и anti-сore
IgМ. Инструментальные исследования пациента проводились совместно с к.м.н.
А.Г. Писаревым, к.м.н. Г.В. Сапроновым. Отдельные этапы молекулярно-
биологических экспериментов проводились совместно с к.б.н. Е.И.
Самохваловым, д.б.н. С.В. Альховским, науч. сотр. А.А. Гришечкиным, д.б.н. К.К.
Кюрегяном и к.б.н. О.В. Исаевой. Диссертантом были подготовлены и написаны
материалы для публикаций, в том числе в англоязычной литературе. Проведены
обобщение, анализ и статистическая обработка полученных данных,
сформулированы научные положения работы, выводы, практические
рекомендации.
Внедрение результатов исследования
Результаты данного исследования внедрены в ГБУЗ «ДГКБ № 9 им. Г.Н. Сперанского ДЗМ» и ФГБУ «РДКБ» Минздрава России. Также результаты диссертационной работы используются в учебном процессе на кафедре детских инфекционных болезней педиатрического факультета ФГБОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.
Апробация работы
Результаты работы были доложены на IV-ой межрегиональной научно-практической конференции «Инфекционные болезни взрослых и детей: актуальные вопросы диагностики, лечения и профилактики» (26–27 сентября 2013, Саратов); на VI Ежегодном Всероссийском конгрессе по инфекционным болезням (24–26 марта 2014 г, Москва); на научно-практической конференции «Современная детская гастроэнтерология: от фундаментальных исследований к практическому применению» (19–21 июня 2014 г., Н. Новгород); на XIII Конгрессе детских инфекционистов России (11–13 декабря 2014 г., Москва); на VII Ежегодном Всероссийском конгрессе по инфекционным болезням (30 марта–1 апреля 2015 г., Москва); на ХI конгрессе «Вирусные гепатиты – эпидемиология, диагностика, лечение и профилактика» (29 сентября–2 октября 2015 г., Москва); на XIV Конгрессе детских инфекционистов России (11–13 декабря 2015 г., Москва); секции инфекционистов Московского Городского отделения союза педиатров России (27 сентября 2016 г., Москва).
В завершенном виде диссертационная работа была апробирована и
рекомендована к защите на совместном заседании Совета по предварительной
экспертизе диссертационных работ ФГБУ «Федеральный научно-
исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. почетного
академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России по проблеме «Общая вирусология и
инфекционные болезни» и кафедры инфекционных болезней у детей
педиатрического факультета ФГБОУ ВО «Российский национальный
исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздрава России 15 марта 2017 г.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 14 работ, в том числе 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК и 2 последовательности core-области HCV задепонированы в GenBank. По темам близким к диссертационной работе опубликовано еще 13 работ.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения; 4-х глав, включающих обзор литературы, материалы и методы, результаты исследования, обсуждения полученных результатов и заключения; выводов; практических рекомендаций; перспектив дальнейшей разработки темы и списка литературы, состоящего из 35 отечественных и 223 зарубежных источников. Работа изложена на 147 страницах текста, иллюстрирована 29 таблицами и 23 рисунками, документирована 10 выписками из историй болезни.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Сore-антиген – дополнительный чувствительный и специфичный антигенный маркер HCV-инфекции, который определяется у детей с хроническим гепатитом С в широком диапазоне количественных значений. Впервые установлена градация концентрационных значений сore-антигена: до 200 фмоль/л, 200–2500 фмоль/л и более 2500 фмоль/л.
-
Между концентрацией core-антигена и РНК НСV в сыворотке крови установлена прямая сильная корреляция (r=0,89; p<0,0001). Установлены значимые различия в соотношении РНК HCV и core-антигена при инфицировании вирусом субтипов 1b и 3а. Для HCV субтипа 3а медиана значений соотношений РНК HCV к сore-антигену составила 482,17 и для 1b – 269,54.
-
Сore-антиген может выявляться в сыворотке крови детей с ХГС при отсутствии anti-сore IgG и anti-сore IgМ. Группа детей, имеющих core-антиген в диапазоне от 200 до 2500 фмоль/л, достоверно чаще имеет anti-core IgM, чем группы с иным содержанием антигена. Существенного влияния anti-core IgG на содержание core-антигена не обнаружено.
-
Низкие значения концентрации core-антигена (ниже 200 фмоль/л) характерны для стадии клинико-биохимической ремиссии и связаны с низким риском развития фиброза печени. Высокие концентрации core-антигена в сыворотке крови больных ХГС детей ассоциируются с более частым обнаружением фиброза печени и биохимической активностью гепатита (p<0,05).
Строение и функции core-белка
Высокое разнообразие и дивергенция вируса гепатита С свидетельствуют о длительной циркуляции HCV в человеческой популяции - от 1300 до 2000 лет [Markov P.V. еі аі., 2009; Li C. еі аі., 2014]. На основании современных молекулярно-эпидемиологических данных многие ученые считают, что HCV возник в Африке, вероятнее всего в центральной части [Markov P.V. еі аі., 2009; Li C. еі аі., 2014; Thong V.D., еі аі., 2014; Iles J.C. еі аі., 2014]. Постепенно вирус распространился на другие континенты, чему способствовали миграция людей, работорговля, колониальные войны и ряд других социально-экономических событий [Simmonds P. 2001; Houghton M. еі аі., 1991; MarteH M. еі аі., 1992; Okura
Первые публикации о гепатите С, называемом в то время «посттрансфузионным гепатитом ни А, ни В», относятся к 1970-1980 гг. [Aher H.J. еі аі.,1975; Tabor E. еі аі.,1978; Prince A., 1982]. До 1989 г. этиологический агент этого заболевания оставался неустановленным. Однако, в исследовании Bradtoy D.W. и соавт. (1979) было показано развитие острого гепатита (гистопатологические данные, повышение уровня аланинаминотрасферазы (АЛТ) в крови и обнаружение вирусных частиц методом электронной микроскопии) в среднем через 7,5 недель после введения 4-м шимпанзе антигемофильного VIII фактора, с которым было связано развитие посттрансфузионного гепатита «ни А, ни В» у двух людей-реципиентов [Bradtoy D.W. еі аі.,1979]. В 1989 г., благодаря развитию молекулярно-генетических методов анализа нуклеиновых кислот, удалось обнаружить геном HCV в сыворотках людей больных гепатитом «ни А, ни В» [Choo Q. еі аі.,1989].
Анализ вирусных частиц в биологическом материале показал, что HCV имеет сферическую форму [He L.F. еі аі., 1987]. Вирусные частицы в сыворотке крови больных людей представлены гетерогенной по размерам популяцией, основную часть представляют частицы диаметром около 40-80 нм [Yuasa T. et al.,1991; Prince A.M. et аі.,1996; Gastaminza P. et а1.,2010]. В крови инфицированных людей HCV присутствует как в виде частиц, связанных с липопротеинами, так и в свободный форме [Prince A.M. et а1,1996; Feneant L. et al., 2014]. Установлено, что вирионы, связанные с аполипопротеинами (рисунок 1), обладают наибольшей инфекционностью [Kapadia S.B. et al., 2007; Aizaki H. et al., 2008; Suzuki T., 2012]. Большинство ученых сходятся во мнении, что в жизненном цикле вируса важными являются аполипопротеины Е и В poE и apoB) [Huang H. et al., 2007; Chang K.S. et al., 2007; Icard V. et al., 2009; Hishiki T. et al., 2010; Gondar V. et al., 2015].
Схематическое изображение вируса гепатита С приведена с изменениями по Ergunay K., 2011. Как представлено на рисунке 1, в структуре вирусной частицы выделяют оболочку, под которой находится нуклеокапсид, сформированный core-белком и РНК HCV. Оболочка вируса сформирована липидами клетки хозяина и двумя оболочечными гликопротеинами вируса - E1 и E2. Эти гликопротеины отвечают за связывание с рецептором и корецепторами, проникновение вируса и высвобождение РНК HCV в цитоплазму клетки [Moriishi K. et al., 2012; Feneant L. et al., 2014]. Сорбция HCV на поверхности клетки скорее всего происходит за счет взаимодействий вирионассоциированного аполипопротеина Е с рецептором липопротеинов низкой плотности (LDL) [Agnello V. et al., 1999; Owen D.M. et al., 2009] и с рецепторами гепарансульфат протеогликанов (HSPGs) [Barth H. et al., 2006; Jiang J. et al., 2013]. Для проникновения в клетку HCV взаимодействует с несколькими клеточными молекулами: сапрофитными рецептором (SR-BI) [Scarselli E. et al., 2002]; тетраспанином (CD81) [Pileri P. et al., 1998]; белками клаудин-1 [Evans M.J. et al., 2007] и окклюдин [Ploss A. et al., 2009] и некоторыми другими ко-факторами [Zona L. et al., 2013; Sainz B J.R. et al., 2012]. Взаимодействие вирусных частиц с клеткой приводит к их проникновению через клатрин-опосредованный эндоцитоз [Blanchard E. et al., 2006; Meertens L. et al., 2006] и слиянию при низком значении рН [Tscherne D.M. et al., 2006].
Размеры нуклеокапсида, как установлено методом электронномикроскопического анализа, составляют 33-45 нм [Maillard M. еt а, 2001]. Core- белок кроме формирования капсулы для хранения генома выполняет ряд других функций, что будет разобрано в подглаве 1.2 (строение и функции core-белка).
Г еном HCV представлен однонитевой линейной молекулой РНК позитивной полярности, состоящей из 9,4-9,6 тысяч нуклеотидных остатков (н.о.) [Houghton M. еt а!, 1991; Dubuisson J. 2014]. Для РНК HCV характерна гетерогенность (различие) не только в количестве н.о., но и в их последовательности, что приводит к наличию множества вариабельных зон в РНК. Схема организации генома HCV представлена на рисунке 2. )
На 5 - и 3 - концах геномной РНК HCV имеются высокоструктурированные нетранслируемые области (НТО). Между 5 - и 3 - НТО генома вируса располагается один ген, кодирующий полипротеин, содержащий 3008 - 3037 аминокислотных остатков (ако). В зоне РНК HCV, кодирующей полипротеин, выделяют участки, с которых транслируются структурные (ближе к 5 - НТО) и неструктурные белки (остальная часть, продолжающаяся до 3 - НТО). Структурные белки (Е1, Е2, core) входят в состав вирусной частицы, в то время как неструктурные полипептиды (NS) являются в основном ферментами, участвующими в жизненном цикле вируса: р7 (виропорин), NS2 (Zn-содержащая протеаза), NS3 (сериновая протеаза-хеликаза), NS4a (кофактор сериновой протеазы), NS4b и NS5a (компоненты репликативного комплекса) и NS5b (РНК- зависимая РНК-полимераза).
Методы обследования
Малосимптомность как острых, так и хронических форм гепатита С у детей приводит к тому, что большинству пациентов диагноз ставится при случайном обследовании в стадии хронического гепатита [Каганов Б.С. и др., 2005; Мартынова Г.П. и др., 2013]. Это подчеркивает важность скрининговых обследований детей на наличие anti-HCV и core-Ag.
Первый этап диагностики HCV-инфекции основан на обнаружении суммарных антител к антигенам HCV путем иммуноферментного анализа или хемилюминесцентного иммуноанализа (ХЛИА) образцов сыворотки крови. Обычно после обнаружения anti-HCV проводят дополнитеный подтверждающий тест, как правило, методом иммуноблоттинга [СП 3.1.3112-13].
В настоящий момент в лабораторной диагностике обычно используются тест-системы 3-го и 4-го поколения для выявления anti-HCV. Тест-системы этих поколений широко используются для скрининга донорской крови, являются более чувствительными и специфичными по сравнению с тест-системами предыдущих поколений и дают возможность детектировать антитела, начиная с 7-8 недели после инфицирования [Barrera J.M. et al., 1995; Huber K.R. et al., 1996]. Диагностикумы 4-го поколения отличаются от предыдущих тем, что при их создании использованы кроме рекомбинантных белков и синтетические пептиды, благодаря чему дополнительно повысилась специфичность тестирования.
Установлено, что применение диагностикумов 3-го и 4-го поколения для выявления anti-HCV среди доноров крови обладает чувствительностью 98,8-100% [Апросина З.Г., 1997]. В то же время отрицательные результаты на anti-HCV характерны для людей с заболеваниями системы крови, в особенности с лимфомой Ходжкина и талассемией [Helaly G.F. et al., 2017], а также для пациентов с иммунодефицитными состояниями (пациенты, находящиеся на лечении иммунодепрессантами, пациенты центров гемодиализа, ВИЧ инфицированные) [Lok A.S. et al., 1993]. Некоторыми исследователями показана возможность получения ложноотрицательных и неопределенных результатов в подтверждающих тестах [Евплова И.А. и др., 2011] при заражении HCV генотипами 3 и 4 [Маянский А.Н. и др., 2003].
Существует и другая проблема при проведении скрининговых исследований на наличие anti-HCV - ложноположительный результат [Schroter M. et al., 1999; Richter S.S., 2002]. Это может быть обусловлено неспецифическим реагированием с примесными белками, загрязняющими тестовый слой, и с гипергаммаглобулинемией [Hernandez-Aguado I. et al., 1998]. Однако, даже достоверный позитивный результат, полученный при определении anti-HCV, информирует врачей только о наличии антител к вирусу гепатита С. Для оценки течения инфекции требуется более сложный алгоритм обследования больных, который включает в себя использование подтверждающего теста для выявления специфических антител и определение РНК HCV.
При определении anti-HCV возможны такие недостатки: получение ложнопозитивных результатов, отсутствие специфических антител у пациентов с иммуносупрессией и в период «серонегативного окна», получение ложноотрицательных результатов. Поэтому согласно санитарноэпидемиологическим правилам [СП 3.1.3112-13] выделены контингенты, подлежащие обязательному обследованию не только на anti-HCV, но и РНК HCV в сыворотке (плазме) крови. К ним относятся: доноры крови, ее компонентов, органов, тканей, спермы; дети в возрасте до 12 месяцев, рожденные от инфицированных вирусом гепатита C матерей и от ВИЧ-инфицированных матерей (в возрасте 2, 6 и 12 месяцев); лица с иммунодефицитом; лица, имеющие заболевание печени неясной этиологии; пациенты отделений гемодиализа, гематологии и трансплантации, пребывающие в медицинской организации более 1 месяца; контактные с больными острым и хроническим гепатитом С [СП 3.1.3112-13].
Выявление вирусной РНК в лабораторной диагностике состоит из двух этапов: первый - выделение общего пула нуклеиновых кислот; второй 38 накопление специфической вирусной РНК в виде комплементарной дезоксирибонуклеиновой кислоты (кДНК) при помощи метода полимеразной цепной реакцией с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР) в режиме реального времени. Чувствительность обнаружения РНК HCV зависит в основном от первого этапа - выделения РНК.
Таким образом, определение РНК HCV является необходимым исследованием в установлении текущей HCV-инфекции, позволяющим контролировать эффективность лечения и устанавливать инфицирование у особых контингентов людей. Однако, это трудоемкое и дорогостоящее исследование, сопряженное с риском контаминации образцов сыворотки крови и необходимостью строгого соблюдения правил забора, хранения и доставки образцов крови в лабораторию. Очевидно, что внедрение новых маркеров HCV- инфекции позволит расширить возможности диагностики гепатита С.
Долгое время единственным применяемым в клинической практике методом прямого определения вируса в организме больного была детекция РНК HCV. Однако вскоре после открытия вируса проводились работы по поиску надежных и низкозатратных тестов для оценки вирусной активности кроме РНК HCV [Takahashi K. et al., 1992]. В 1995 г. исследователи разработали ИФА для определения core-Ag и показали, что этот антиген может быть обнаружен в сыворотке крови больных ХГС и его количество коррелирует с уровнем РНК HCV в крови [Tanaka T. et al., 1995]. Отечественными исследователями также показана возможность определения core-Ag в крови инфицированных людей [Masalova O.V. et al., 1998]. При инкубации сыворотки при различных температурах было показано, что core-Ag имеет более высокую стабильность, чем РНК HCV [Nakamuta M. et al., 2001; Tanaka Y. et al., 2003]. Ряд исследований в этой области [Tanaka T. et al., 1995; Aoyagi K. et al., 1999; Komatsu F., Takasaki K., 1999] способствовали появлению в 1999-2000 гг. первых диагностических наборов для качественного определения core-Ag методом ИФА, и в 2003 году - для количественного определения core-Ag [Icardi G. et al., 2003].
После появления коммерческих тест-систем многими исследователями была показана возможность обнаружения core-Ag в период «серонегативного окна» острой фазы инфекции [Peterson J. еt al., 2000; Courouce A.M. et al., 2000]. Core- антиген стал вторым по времени обнаружения вирусным маркером при остром гепатите С. Его удается обнаружить в крови на неделю позже вирусной РНК и значительно раньше антител, поэтому определение core-Ag служит хорошим дополнением при диагностике гепатита С в периоде «серонегативного окна» [Peterson J. et al., 2000].
Хорошая корреляция выявления core-Ag с РНК HCV у пациентов с ХГС позволила исследователям предложить тест-системы для контроля эффективности терапии. Практическое использование этого подхода не нашло широкого применения из-за недостаточной чувствительности первых тест-систем для определения core-Ag [Komatsu F., Takasaki K., 1999; Veillon P. et al., 2003; Soffredini R. et al., 2004]. Нижний предел чувствительности количественного теста составил 3 пг/мл [Icardi G. et al., 2003], качественного - 1,5 пг/мл [Krajden M. et al., 2004]. В 2009 году появилась коммерческая тест-система «ARCHITECT HCV Ag» (Abbott, США), имеющая высокую чувствительность (нижний предел определения равен 3 фмоль/л, что соответствует 0,06 пг/мл) и сильную корреляцию между содержанием антигена и HCV РНК в сыворотке крови [Morota
K. et al., 2009; Ross R.S. et al., 2010; Murayama A. et al., 2012; Tedder R.S. et al., 2013; Park Y. et al., 2010].
Зависимость концентрации core g от субтипа вируса
Первой задачей исследования было изучение диагностической значимости core-Ag в качестве маркера HCV-инфекции у детей. Для решения этой задачи определяли anti-HCV, core-Ag и РНК HCV в сыворотках крови 101 пациента с ХГС и 24-х пациентов из группы контроля. От 101 больного ХГС было взято 123 образца сыворотки крови, так как 22 ребенка поступали повторно на катамнестическое обследование. Группу контроля составили 24 ребенка, от которых было получено 38 образцов сывороток крови в ходе катамнестического обследования. Группу контроля составили дети, которые поступали в 5-ое инфекционное отделение ГБУЗ «ДГКБ №9 им. Г.Н. Сперанского ДЗМ» с подозрением на инфицирование вирусом гепатита С, которое не подтвердилось в ходе детального обследования. Это позволило изучать специфичность теста в образцах крови пациентов, содержащих потенциально интерферирующие вещества. В образцах из группы контроля core-Ag не был выявлен ни у одного пациента. Данные представлены в таблице 4.
Результаты определения core-Ag в образцах крови от детей с ХГС и от участников группы контроля Результат анализа на core-Ag Заболевание Количество образцов сывороток Есть (n=123) Нет (n=38) Обнаружен, n 119 0 119 Не обнаружен, n 4 38 42 На основании данных таблицы 4 была рассчитана специфичность определения методом ХЛИА core-Ag в сыворотке крови детей. Специфичность теста - это его способность достоверно определять отсутствие данного заболевания у пациента. Расчет специфичности теста производился по формуле Специфичность= d/(b+d), (1) где d - число истинноотрицательных результатов; b - число ложноположительных результатов. С учетом ошибки, связанной с количеством образцов сывороток крови в выборке (n=38), специфичность составила 98,36% (95% ДИ 96,72-100%) Были оценены особенности выявления HCV РНК и core-Ag в образцах сывороток крови (n=123), взятых от 101 пациента с ХГС. Данные представлены в таблице 5. Таблица 5 Результаты определения HCV РНК и core-Ag в образцах крови пациентов с ХГС. Результат анализа на core-Ag HCV РНК «+» Anti HCV«+» (n=119) HCV РНК «-» Anti HCV«+»(n=4) Количествообразцовсывороток(n=123) Обнаружен 118 1 119 Не обнаружен 1 3 4
Как следует из таблицы 5, шге-Ag выявлялся в 119 образцах сывороток крови из 123, причем в 118 образцах сывороток крови совместно с РНК HCV. В 3х образцах сывороток крови одномоментно не удалось обнаружить ни core-Ag, ни РНК HCV на момент исследования, что позволило надежно детектировать стадию вирусологической ремиссии ХГС. Однако динамическое наблюдение за детьми не позволили установить элиминацию вируса: РНК HCV была выявлена у одного ребенка через 6 месяцев, у двух детей через один год. В одном случае удалось выявить core-Ag в низких значениях 3 фмоль/л, но 10 фмоль/л дважды у ребенка с положительными anti-HCV и отрицательным значением РНК HCV (аналитическая чувствительность теста, которым в данном образце исследовалась РНК HCV, составила 300 МЕ/мл). Определить РНК HCV в тест-системах с чувствительностью 15 МЕ/мл не было возможности из-за отказа матери провести забор крови у ребенка. У 1-го пациента не обнаружен core-Ag при наличии РНК вируса в концентрации 790 МЕ/мл.
На основании данных таблицы 5 была рассчитана чувствительность теста. Чувствительность теста - его способность достоверно определять наличие данного заболевания у лица, имеющего его в действительности. Расчет чувствительности теста производился по формуле где a - число истинноположительных результатов; с - число ложноотрицательных результатов. Таким образом, чувствительность соге-Ag как маркера гепатита С в образцах сывороток крови, взятых у детей с ХГС, составила 96,75% (95% ДИ 95,14-98,36%).
Определена прогностическая ценность теста. ППЦ определяет вероятность получения положительного результата у больного человека. ОПЦ определяет вероятность получения ошибочного отрицательного результата.
Расчет ППЦ и ОПЦ производился по формулам: где d - число истинноотрицательных результатов; b - число ложноположительных результатов; a - число истинноположительных результатов; с - число ложноотрицательных результатов. ППЦ и ОПЦ составили 100% и 84,61%, соответственно У детей с ХГС core-Ag определялся в крови в широком диапазоне значений - от 0 до величин выше 20000 фмоль/л. Путем анализа данных генеральной выборки (n=101) впервые установлены три диапазона значений концентрации core-Ag. Значения core-Ag, превышающие 2500 фмоль/л, оценены как высокие; значения ниже 200 фмоль/л - как низкие; диапазон значений более 200 фмоль/л, но менее 2500 фмоль/л - как средние. Медианы значений re-Ag в группе с низким его содержанием (n=24) составила 89,0 фмоль/л (Q1-Q3: 23,0-148,0); со
Анализ потенциальной связи core-Ag и клинико-анамнестических данных детей с ХГС у детей
Больная К, 19 лет, страдает гепатитом около 5 лет. С 16 лет наблюдается с в 5-ом инфекционном отделении ДГКБ № 9 им. Г.Н. Сперанского Путь инфицирования неизвестен. При осмотре: состояние удовлетворительное, не выявлены ни астенический, ни диспепсические синдромы. Кожные покровы и видимые слизистые физиологической окраски. Вненеченочных знаков нет. Печень увеличена на 1см из-под края реберной дуги, эластичной консистенции. Размеры селезенки по данным пальпации и перкуссии в пределах нормы. Исключены гепатиты А, Ви ВИЧ - инфекция. Стадии фиброза установленная методом фиброэластометрии соответствует F0-1 по шкале METAVIR. В сыворотке крови обнаружена РНК HCV в концентрации 4,8 х 106МЕ/мл. Установлен субтип вируса - 3а. Установлено содержание соге-Ag - 8980,3 фмоль/л.Также отмечен необычный антительный спектр к антигенам вируса гепатита С у данного ребенка: отсутствие anti-core IgM, anti-core IgG, anti-NS4 IgG; anti-NS5a IgG . Выявлены только anti-NS3 IgG в титре 1/64 (низкое значение).
Таким образом, при высокой core-антигенемии могут не выявляться иммуноглобулины M и G к core-Ag.
Среди 16-ти детей, имевших core-антигенемию выше 8000 фмоль/л, только у 3-х отсутствовали антитела к core-Ag. Выписка ребенка с высоким содержанием core-Ag и наличием к нему антител представлена ниже.
Больная Ф., 7 лет. Из анамнеза известно, что ребенок от наркозависимой матери с ХГС, от 2-й физиологически протекавшей беременности, 2-х родов. Наблюдается с 3-х лет в поликлинике по месту жительства по поводу ХГС. Госпитализация в 5-ом инфекционном отделении ДГКБ № 9 им. Г.Н. Сперанского в ноябре 2013 года. При поступлении астеновегетативный и диспепсический синдромы не выражены, кожные покровы и видимые слизистые физиологической окраски. Вненеченочных знаков нет. Печень увеличена на 1,0 см из-под края реберной дуги, плотно-эластичной консистенции. Размеры селезенки по данным пальпации и перкуссии в пределах нормы. Лабораторные данные: АЛТ -18 Ед/л, АСТ - 33 Ед/л. В сыворотке крови обнаружена РНК HCV в концентрации 1,1 х 10 МЕ/мл. Установлен субтип вируса - 3а. Установлено содержание mre-Ag 20000,00 фмоль/л. Исключены гепатиты А, В и ВИЧ-инфекция. По данным УЗИ печени выявлены признаки фиброза печени. В сыворотки крови выявлены аШ-core IgG в титре 1/4096, аШ- 3 IgG в титре 1/512; аШ-Ш4 IgG - 1/64; аШ- 5а IgG - 1/8. В сыворотки крови отсутствуют аШ-т IgM.
Очевидно, причину отсутсвия антител к core-Ag объяснить высокой продукцией этого антигена, нельзя, так как среди 16-ти детей, имевших core- антигенемию выше 8000 фмоль/л, только у 3-х отсутсвовали антитела.
Впервые сыворотки с отсутсвием антител к core-Ag при его наличии были обнаружены у пациентов из Камбоджи [Budkowska А. et al., 2011]. Авторы этой публикации обнаружили замены в core-белке в области 99-124 (в 106 позиции - остаток аспарагина) аминокислотных остатков и предположили, что эти замены приводят к недооценке уровня антител к core-белку . В настоящем исследовании были секвенированы core-области генома HCV от 2-х пациентов, у которых не определялись антитела к core-Ag при его высоком содержании. Единственное отличие аминокислотных последовательностей в core-белке (в области 99-124) у пациентов, представленных в настоящем исследовании, в том, что в 106 позиции - остаток серина, а у пациентов из Камбоджи - остаток аспарагина. Вероятно, это были незначимые замены, так как во всех случаях отсутсвовали антитела к core- белку.
Подводя итог данной главы, посвященной особенностям специфического иммунного ответа на core-Ag, надо отметить, что апіі-core IgM чаще выявляются при средних значениях концентрации core-Ag, чем при низких и высоких. Anticore IgG циркулируют у подавляющего большинства больных; зависимость их содержания от концентрации core-Ag не установлена. Зависимость концентрации core-Ag от наличия аШ-core IgM/IgG не выявлена. Поскольку существуют образцы сывороток крови больных ХГС с низким содержанием специфических антител и они могут давать сомнительные и ложноотрицательные ответы при определении anti-HCV, то определение core-Ag как прямого маркера инфекции может быть рекомендовано для включения в скрининговые программы и как подтверждающий тест на наличие HCV-инфекции. Особенно значимым этот тест может быть, когда в исходе проведения подтверждающего иммуноблотингового исследования получен положительный результат только к одному антигену HCV.
Целью данного этапа работы было изучение влияния содержания core-Ag на клиническое течение и прогноз ХГС у детей. Поэтому были изучены анамнестические, клинико-лабораторные и инструментальные данные у 101 -го больного ХГС. До начала проведения настоящего исследования пациенты уже наблюдались по поводу HCV-инфекции в течение различного времени: 31 ребенок - от 1 года до 3 лет, 44 - от 3 до 9 лет, 26 пациентов с HCV-инфекцией - более 10 лет.
В результате проведенного анализа анамнестических данных установлено, что среди 101-го пациента с ХГС лишь у 3-х детей HCV-инфекция была впервые диагностирована после появления симптомов острого гепатита. Были проанализированы наиболее вероятные пути инфицирования. Среди всех обследованных детей с ХГС у 58-ми (57,43%) пациентов установлен вертикальный путь инфицирования; у 19-ти (18,81%) пациентов путь инфицирования связан с оперативным лечением и переливаниями препаратов крови; у 8-ми (7,92%) - с употреблением внутривенных наркотических препаратов; у 16 (15,84%) детей достоверно путь инфицирования установить не удалось (у большинства были указания на однократные медицинские манипуляции: посещение стоматолога, гинеколога, сдача анализов, проведение гастроскопии). Вертикальный путь инфицирования выявлялся достоверно чаще, чем другие пути инфицирования (р 0,05). Показатели частоты выявления путей инфицирования пациентов представлены в таблице 18.