Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор 18
1.1. Подходы к получению ПСК 18
1.2. Методы получения ИПСК 21
1.3. Практические подходы к подтверждению плюрипотентного статуса ИПСК 23
1.4. Молекулярные механизмы индукции плюрипотентности 25
1.5. Дифференцировка в нейральном направлении 31
1.6. Нейрогенез во взрослом организме 32
1.7. Дифференцировка ПСК в нейральном направлении в 2D-условиях 35
1.8. Получение нейральных 3D органоидов 37
1.9. Общие сведения о болезни Альцгеймера 41
1.10. Бета-амилоидная гипотеза возникновения БА 42
1.11. Роль тау-белка в развитии БА 45
1.12. Генетические факторы риска возникновения БА 47
1.13. Общие сведения о синдроме Дауна 49
1.14. Синдром Дауна и болезнь Альцгеймера 50
1.15. Существующие клеточные модели синдрома Дауна и болезни Альцгеймера 51
Глава 2. Материалы и методы 55
2.1. Реагенты и материалы исследования 55
2.2. Получение ИПСК 59
2.3. Дифференцировка ИПСК в нейральном направлении 60
2.4. Получение нейральных органоидов из ИПСК 61
2.5. Выделение тотальной РНК 62
2.6. Обратная транскрипция 63
2.7. ПЦР в реальном времени 65
2.8. Определение оптимального набора генов для нормировки результатов ПЦР в реальном времени 67
2.9. Иммуноферментный анализ 68
2.10. Окраска антителами 68
2.11. Определение апоптотирующих клеток методом TUNEL 70
2.12. Приготовление гистологических срезов органоидов 71
2.13. Измерение электрофизиологической активности нейронов методом «патч-кламп» 72
2.14. Вестерн-блот 73
2.15. Спонтанная дифференцировка ИПСК 74
Глава 3. Результаты 75
3.1. Получение ИПСК из клеток амниотической жидкости 75
3.2. Дифференцировка ИПСК в нейральном направлении в 2D условиях 85
3.3. Определение признаков патологических процессов БА в нейральных клетках 91
3.4. Определение генов, подходящих для нормировки результатов ПЦР в реальном времени 95
3.5. Получение нейральных 3D органоидов из ИПСК 102
3.6. Определение признаков патологических процессов БА в нейральных органоидах 106
Глава 4. Обсуждение результатов 110
Выводы 120
Список литературы 121
- Молекулярные механизмы индукции плюрипотентности
- Существующие клеточные модели синдрома Дауна и болезни Альцгеймера
- Дифференцировка ИПСК в нейральном направлении в 2D условиях
- Определение признаков патологических процессов БА в нейральных органоидах
Молекулярные механизмы индукции плюрипотентности
Экспериментальные работы по переносу ядра соматической клетки в оплодотворенную яйцеклетку позволили предположить, что в ядре соматической клетки содержится весь необходимый генетический материал для получения плюрипотентной клетки, а в цитоплазме яйцеклетки или ЭСК содержится достаточный набор факторов для репрограммирования соматического ядра до плюрипотентного состояния. После того, как необходимый набор факторов был определен, можно было предположить, что лимитирующим этапом в процессе репрограммирования является доставка репрограммирующих факторов в репрограммируемую клетку.
Однако, высокая эффективность доставки генетического материала с помощью вирусных векторов в купе с чрезвычайно низкой эффективностью репрограммирования указывает на более сложную природу процесса индукции плюрипотентности. Действительно, репрограммирование соматической клетки до плюрипотентного статуса требует серьезной реорганизации клеточного ядра, так как необходимо обеспечить экспрессию эпигенетически подавленных в соматической клетке генов, связанных с поддержанием плюрипотентности, и в то же время погасить экспрессию генов, связанных с дифференцировкой. Большой интерес вызывают молекулярные механизмы этого процесса.
Молекулярные механизмы индукции плюрипотентности напрямую связаны с набором факторов, используемым в процессе репрограммирования. Экспериментально было показано, что два набора репрограммирующих факторов OCT4, SOX2, c-MYC, KLF4 и OCT4, SOX2, NANOG, LIN28 обеспечивают успешное репрограммирование до плюрипотентного состояния [14,45]. Стоит подробней остановиться на каждом из этих генов. Начать следует с OCT4, SOX2 и NANOG, так как они, являясь транскрипционными факторами, совместно активируют промоторы и собственных генов, и генов друг друга, образуя тем самым авторегуляторные петли [56,57], что усиливает стабильность экспрессии генов плюрипотентности [57–59]. Экспрессия генов OCT4, SOX2, NANOG является основой транскрипционной сети, включающей в себя до нескольких сотен генов (как транскрипционно активных, так и неактивных), и обеспечивающей плюрипотентность ЭСК, усиливая транскрипцию генов плюрипотентности и подавляя активность генов, связанных с дифференцировкой и развитием [54,57].
OCT4 является членом семейства октамер-связывающих транскрипционных факторов, которые связываются с последовательностью нуклеотидов «…ATTTGCA…». OCT4 регулирует экспрессию связываемых с плюрипотентностью генов. Так же известно, что OCT4 играет важную роль в поддержании плюрипотентного статуса: изменение уровня экспрессии (как в большую, так и в меньшую сторону) хотя бы в два раза приводит к дифференцировке ПСК [60].
OCT4 экспрессируется в тотипотентных клетках мыши и человека на ранних стадиях эмбрионального развития. Экспрессия OCT4 необходима для формирования плюрипотентных стволовых клеток, таким образом OCT4 участвует в формировании внутренней клеточной массы зародыша. Известно, что зародыши нокаутных по OCT4 мышей не способны сформировать внутреннюю клеточную массу и погибают на стадии бластоцисты [33].
SOX2 является транскрипционным фактором, играющим существенную роль в поддержании плюрипотентности. Известно, что ген SOX2 экспрессируется во внутренней клеточной массе зародышей, эпибласте, а также неэмбриональной эктодерме и клетках нейральных предшественников. Эмбрионы мышей, нокаутных по SOX2 не способны сформировать эпибласт, и умирают на стадии прикрепления к маточной стенке [32]. SOX2 принадлежит к семейству SRY-ассоциированных транскрипционных факторов, несущих высококонсервативные ДНК-связывающие домены HMG, состоящие из приблизительно 80 аминокислотных остатков.
NANOG так же является транскрипционным фактором, необходимым для поддержания плюрипотентности. NANOG способен регулировать процессы поддержания плюрипотентности, участвуя в процессе самообновления ЭСК в отсутствии фактора STAT3 и фактора ингибирующего лейкемию (LIF) [34], а при подавлении экспрессии NANOG активируется экспрессия транскрипционных факторов, ассоциированных с тропоэктодермой, GATA4, GATA6, CDX2 [61].
Добавление гена LIN28 в набор репрограммирующих факторов значительно увеличивает эффективность репрограммирования [62], что связывают с участием LIN28 в процессинге микроРНК (миРНК). LIN28 несет РНК-связывающие сайты, позволяющие участвовать в процессах регулирования времени жизни мРНК и миРНК. Предполагается, что в ЭСК LIN28 ингибирует процессинг семейства миРНК let7 [63], супрессора опухолевого роста, участвующего в подавлении активности c-MYC.
KLF4 является Круппел-подобным членом семейства цинковых пальцев. Ген KLF4 экспрессируется в различных тканях и играет важную роль в таких клеточных процессах, как пролиферация, дифференцировка и апоптоз [64]. KLF4 может как активировать, так и подавлять транскрипцию регулируемых генов. Так же данный ген может играть роль онкосупрессора или онкогена в зависимости от процессов, протекающих в клетке. Известно, что KLF4 способен связываться с промотером гена NANOG и модулировать его транскрипцию [65].
c-MYC является мультидоменным транскрипционным фактором, который участвует в регуляции примерно 15% генов в широком наборе организмов от мухи до человека. Гены, регулируемые с-MYC принимают участие в широком круге клеточных процессов, таких как регулирование клеточного цикла, синтез рибосом, трансляция и работа митохондрий [66]. Некоторые авторы указывают на способность c-MYC регулировать экспрессию различных миРНК [67]. Посредством этого, c-MYC играет важную роль в процессах пролиферации и клеточной дифференцировки. Считается, что в процессе клеточного репрограммирования c-MYC усиливает пролиферацию соматических клеток, запуская масштабный процесс реорганизации хроматина в клеточном ядре [68]. Стоит так же отметить, что c-MYC является онкогеном, экспрессия которого повышена в примерно 70% типов злокачественных клеток [54].
Процесс репрограммирования до плюрипотентного состояния влечет за собой масштабное изменение профиля экспрессии репрограммируемой клетки. ДНК в клеточном ядре находится в сложноорганизованном ДНК-белковом комплексе (хроматине). При этом неактивным областям ДНК соответствует плотная конденсированная упаковка хроматина (гетерохроматин), а активным соответствует неспирализованное состояние с неплотной упаковкой (эухроматин). Очевидно, что процесс репрограммирования влечет за собой и масштабную реорганизацию хроматина. Базовой единицей хроматина является нуклеосома, представляющая собой белковый комплекс, состоящий из восьми гистонов (парный набор гистонов H2A, H2B, H3 и H4). Ферменты ДНК метилтрансфераза и гистон ацетилтрансфераза осуществляют посттрансляционные модификации гистонов. Такие модификации гистонов определяют, будет ли связанный с ними участок ДНК находиться в конденсированном или деконденсированном состоянии. Таким образом, наряду с метилированием ДНК, модификации гистонов (ацетилирование и метилирование) являются эпигенетическими регуляторами транскрипции.
Существуют разнообразные посттрансляционные модификации гистонов: ацетилирование, метилирование, сумоилирование, убиквитинирование, фосфорилирование. Ацетилирование и метилирование изучены в большей степени. Так, известно, что ацетилирование гистонов приводит к повышению транскрипционной активности. Метилирование в свою очередь может приводить как к повышению (гистон-3 лизин-4 триметилирование H3K4me3), так и к понижению (гистон-3 лизин-27 триметилирование (H3K27me3) и гистон-4 лизин-20 триметилирование (H4K20me3)) транскрипционной активности [54]. В данном разделе будет обсуждено влияние модификаций гистонов и метилирования ДНК на клеточное репрограммирование.
Было экспериментально показано, что эпигенетический профиль ПСК и дифференцированных клеток значительно отличаются. Так, Мешорер с соавт. показали, что в ПСК мыши в отличии от дифференцированных клеток нейральных предшественников гистоны H1, H2, H3 слабо прикреплены к хроматину и перемещаются внутри ядра. Так же авторы показали, что ЭСК мыши образуют ЭТ быстрее, если подавить экспрессию фактора сборки нуклеосом HirA [69]. В то же время ЭСК мыши, экспрессирующие модифицированный H1, демонстрирующий более сильное связывание с хроматином, оказались не способны к дифференцировке в нейральном направлении. На основании этого, авторы предполагают, что подвижность белков, свзывающихся с хроматином, является функциональной особенностью ПСК [69].
Существующие клеточные модели синдрома Дауна и болезни Альцгеймера
После открытия ИПСК были предприняты многочисленные попытки создания клеточных моделей БА и СД с использованием нейронов, полученных из ИПСК. К настоящему времени получены культуры нейронов, несущие некоторые мутации в генах APP, PSEN1 и PSEN2, приводящие к возникновению наследственной формой БА [191–193]. Удалось установить, что в таких нейронах повышается секреция бета-амилоида (изоформ A40 и A42), причем доля A42 в общем количестве бета-амилоида возрастает. При этом так же было проведено исследование нейральных предшественников, полученных из ИПСК, несущих мутацию в гене PSEN1. Оказалось, что наличие мутаций не влечет за собой существенного изменения в уровнях экспрессии генов, непосредственно участвующих в процессинге бета-амилоида [194]. Таким образом, изменение общего количества бета-амилоида и изоформы A42 скорее всего связано с нарушениями во взаимодействии каталитического центра гамма-секретазы и APP.
Еще одним генетическим нарушением, приводящим к наследственной форме БА, является дупликация гена APP [195]. Муратор с соавт. получил ИПСК с дуплицированным геном APP и дифференцировал их в нейральном направлении. Удалось показать, что дупликация APP приводит к повышению экспрессии белка MAPT в целом, а так же к увеличению доли фосфорилированного белка MAPT. Экспрессия APP так же повышается, и возрастает доля A42 в общем количестве бета-амилоида. Добавление в культуральную среду на ранних этапах дифференцировки специфических антител против бета-амилоида позволяет снизить уровень фосфорилирования MAPT и секреции A42 до уровня, не отличимого от здорового контроля [191]. Исраел с соавт. получили ИПСК из клеток доноров, страдающих от наследственной и спорадической форм БА, а так же пожилых доноров, не страдающих БА. Сравнение культур нейральных клеток, полученных из этих ИПСК, показало повышенный уровень киназы GSK3b, и как следствие, увеличение доли фосфорилированного тау-белка в клетках доноров, страдающих БА в сравнении со здоровым контролем. Так же в данной работе было показано, что клетки доноров с БА формируют больше RAB5 положительных эндосом. Увеличение количества таких эндосом является фенотипическим признаком спорадической формы БА [196]. В работе Кин с соавт. было показано снижение экспрессии белка SYN1 в нейральных клетках, полученных из ИПСК доноров с наследственной формой БА по сравнению со здоровым контролем [197].
Для создания модели спорадической формы БА Фламьер с соавт. использовали нокаут гена BIM1 в ИПСК здоровых доноров. Ген BIM1 является супрессором экспрессии MAPT, предотвращая таким образом активацию киназ DYRK1A и GSK3b. Полученные из таких ИПСК нейроны демонстрировали накопление бета-амилоида и формирование бляшек, содержащих A42, накопление фосфорилированного тау-белка и признаки нарушения работы синапсов [198].
Гонсалес с соавт. получили из ИПСК доноров с наследственной формой БА церебральные органоиды и показали образование в них к 90-му дню дифференцировки гранул бета-амилоида, увеличение доли A42 в общем количесвте бета-амилоида, а так же накопление фосфорилированного тау-белка [199]. Аналогичные результаты получены в работе Йан с соавт. [200].
Развитию клеточных моделей БА может послужить получение и размещение в клеточных банках ИПСК, несущих широкий набор мутаций, ассоциированных с наследственной формой БА [201,202], а так же получение из них генетически тождественных ИПСК, в которых эти мутации исправлены с помощью систем редактирования генома . Такой подход позволит создавать клеточные модели, свободные от влияния генетических и эпигенетических вариаций между различными линиями донорских ИПСК [202].
В работе Ши с соавт. были получены кортикальные холинергические нейроны из ИПСК доноров с СД. Удалось установить, что в нейронах от доноров с СД после восемнадцатого дня дифференцировки начинает повышаться секреция A40, и к 28-му дню дифференцировки количество секретируемого клетками доноров с СД A40 превосходит примерно в три раза секрецию A40 клетками здоровых доноров. Вместе с тем происходит повышение секреции A42. К 62-му дню дифференцировки в клетках доноров с СД наблюдается образование гранул, содержащих A42, увеличение общего количества тау-белка, а так же фосфорилированного тау-белка [122].
Мизуно с соавт. получили культуры астроцитов из ИПСК доноров с СД. С помощью кальциевого имаджинга удалось показать, что в астроцитах доноров с СД происходят с большей частотой спонтанные флуктуации концентрации Ca2+ по сравнению с здоровым контролем. Это приводит к снижению возбудимости совместно культивируемых с астроцитами нейронов. Возбудимость нейронов может быть восстановлена с помощью ингибирования аденазин-медиируемого сигналинга с помощью специфических ингибиторов или нокаута рецептора IP3. Нокаут находящегося на 21-ой хромосоме связывающего кальций белка S100B так же приводит к восстановлению возбудимости нейронов доноров с СД [203].
Развитием клеточных моделей СД может послужить получение трехмерных органоидов из ИПСК доноров с СД, а так же применение систем редактирования генома для получения органоидов, имеющих «дозированный» нокаут генов APP, RCAN1 и DYRK1A.
Дифференцировка ИПСК в нейральном направлении в 2D условиях
Далее мы провели нейральную дифференцировку полученных линий ИПСК. При помощи коммерчески доступных наборов, сначала из ИПСК были получены так называемые «нейральные розетки» состоящие из нейральных стволовых клеток, которые можно механически или ферментативно отделить и культивировать в виде адгезивных культур (или нейросфер) (далее — НП-АФС-СД1, НП-АФС-СД2, НП-АФС-СД3 и НП-АФС1, НП-АФС2, НП-АФС3). Нейральные розетки интенсивно окрашивались на белок NES — один из основных маркеров нейральных стволовых клеток (Рис. 11б). Из полученных нейральных прогениторов далее при помощи редкой рассадки и отмены факторов роста, были получены культуры зрелых нейрональных клеток (далее — Н-АФС-СД1, Н-АФС-СД2, Н-АФС-СД3 и Н-АФС1, Н-АФС2, Н-АФС3) (Рис. 2), культивируемых in vitro в 2D условиях, т.е. на дне культуральной посуды. В течение процесса терминальной дифференцировки, происходило значительное изменение морфологии клеток — появление длинных отростков (несколько сотен ммикрометров), формирование сети (Рис. 11а, 11в). С помощью иммуноцитохимического окрашивания, мы показали, что полученные таким образом клетки экспрессируют обширный набор маркеров нейрального ряда: маркера незрелых постмитотических нейронов TUBB3 (Рис. 11г); маркеров зрелых нейронов различных типов MAPT, SYN1, SYP1, NCAM (Рис. 11е,ж,з,и). Также стоит отметить, что в полученных культурах нейронов мы наблюдали небольшие островки клеток, положительно окрашиваемых на маркер астроцитов GFAP (Рис. 11д), что свидетельствует также и о глиальной дифференцировке в исследуемых культурах. Количество данных клеток варьировалось от культур к культуре и от эксперимента к эксперименту, однако никогда не превышало 3-5% от общего числа клеток. Достоверных значимых отличий между культурами с Т21 и НК в морфологии клеток и характере окрашивания на маркеры, мы не наблюдали, клетки окрашивались в целом одинаково (Рис. 13).
Методом ПЦР в реальном времени мы показали, что в процессе нейральной дифференцировки происходит затухание экспрессии генов маркеров плюрипотентности OCT4, NANOG, DPPA4, одновременно с индукцией и нарастанием экспрессии генов маркеров нейрального ряда NES, TUBB3, NSE, GFAP (Рис. 12). Экспрессия гена SOX2 который одновременно является и маркером плюрипотентных клеток, и маркером нейральных клеток, в ходе процесса дифференцировки увеличивалась. В конечном итоге, интегральным тестом доказательства нейронального статуса клеток является так называемый «патч-кламп» (Patch-clamp) анализ на способность мембраны клеток к проведению специфических нейрофизиологических импульсов, представляющих из себя периодическое изменение потенциала клеточной мембраны в ответ на ее стимуляцию. Во всех полученных нами культурах нейронов присутствовали клетки, обладающие способностью к циклическому изменению потенциала клеточной мембраны (Рис. 14). Стоит отметить, что в наших экспериментах способность к проведению импульса появляется в культурах нейронов, полученных из ИПСК подобным образом, только после 21-го дня дифференцировки на среде Neural Differentiation Medium. Несмотря на то, что морфологически клетки приобретают нейрональный фенотип достаточно быстро (в течение 3-5 дней со старта дифференцировки), и сохраняют его почти неизменным на протяжении всего эксперимента, по всей видимости в клетках идет медленный процесс созревания до состояния зрелых нейронов.
Таким образом, на основании морфологических изменений, появления экспрессии маркеров различных клеток нейрального ряда, затухания экспрессии генов-маркеров плюрипотентности, индукции и нарастания экспрессии генов– маркеров нейрального ряда, наличия специфической нейрофизиологической активности, можно утверждать об успешном прохождении терминальной дифференцировки Т21 и НК клеток в нейральном направлении.
Определение признаков патологических процессов БА в нейральных органоидах
Последним этапом работы в данном исследования стал поиск признаков патологических процессов характерных для болезни Альцгеймера (БА) в 3D-органоидах с Т21 по сравнению с орагноидами, имеющими НК.
Для определения качественных признаков БА мы измерили концентрации содержания секретированных изоформ бета-амилоида A40 и A42 в кондиционированной культуральной среде, после чего было вычислено отношение концентраций этих изоформ (Рис. 22). Согласно полученным результатам, органоиды с Т21 экспрессируют примерно в два раза больше A40 и примерно в три раза больше A42 по сравнению с органоидами из клеток с НК. Также, отношение изоформ A40 и A42 было повышено в случае органоидах с Т21 по сравнению с органоидами из клеток с НК.
Еще одним признаком БА можно считать повышение доли апоптотирующих клеток в органоидах Т21. С помощью метода TUNEL выполненного на крио-срезах и последующего анализа полученных изображений в программе «Image J» мы измерили долю апоптотирующих ядер. (Рис. 23). Выяснилось, что доля апоптотирующих ядер в органоидах с Т21 примерно в 2 раза выше по сравнению с органоидами с НК.
Также было проведено сравнение уровней экспрессии генов, ассоциированных с БА и СД в изучаемых органоидах, методом ПЦР в реальном времени (Рис. 24) Видно, что экспрессия DYRK1A и GFAP значительно повышена в органоидах Т21 (в 17 и 8 раз соответственно). Экспрессия генов APP, BACE2, RCAN1, TMED10 повышена в органоидах Т21 не так сильно (примерно в полтора раза), экспрессия генов PAX6, BACE1, PSEN1, PSEN2 и CREB1 в этих органоидах понижена (в два-три раза).
Таким образом, можно говорить о том, что полученные Т21 органоиды воспроизводят особенности тканей мозга людей с синдромом Дауна, поскольку демонстрируют повышенную секрецию бета-амилоида, в том числе изоформы A42, наиболее склонной к образованию агрегатов. Доля этой изоформы в органоидах с СД повышена по сравнению со здоровым контролем. Экспрессия генов, ассоциированных с БА и СД в органоидах Т21 отличается от органоидов с НК.
Отношение уровней экспрессии генов, связанных с БА и СД, в органоидах с СД и НК, ПЦР в реальном времени. Отношение больше 1 указывает на повышенную экспрессию в органоидах с СД, отношение меньше 1 указывает на повышенную экспрессию в органоидах из клеток с НК. Красные стрелки указывают на гены, расположенной на 21 хромосоме. Гены REEP5, C1ORF43 и HMBS использованы для вычисления нормировочного фактора. Проанализировано 3 образца РНК, выделенной из органоидов с НК (18 органоидов), 3 образца РНК, выделенной из органоидов с Т21 (18 органоидов). Для установления достоверности наблюдаемых различий применялся U-критерий Манна-Уитни. Для генов APP, BACE2, CREB1, DYRK1A, GFAP, PAX6, PSEN1, PSEN2 p-значение меньше 0,05.
Моделирование наследственных заболеваний человека с использованием индуцированных плюрипотентных стволовых клеток является современной и перспективной областью исследований в экспериментальной клеточной и молекулярной биологии. При помощи дифференцировки ИПСК in vitro можно получать различные типы клеток – аналоги клеток и тканей человека, которые практически невозможно выделить из взрослого живого организма, например, нейроны головного мозга или клетки сердца. Такой подход позволяет исследовать многие патологические процессы наследственных заболеваний, становясь при этом третьей опорой исследователя, наряду с моделями на лабораторных животных, изучением материалов биопсий и кадаверного биоматериала. Таким образом получение ИПСК человека с трисомными генными патологиями типа СД является важной и нужной задачей.
При изучении СД интересным является так же изучение изменений экспрессии генов, вовлеченных в генный дисбаланс при СД. Изменение экспрессии таких генов часто не велико, и составляет примерно 50 % [8]. В данной работе были подобраны нормировочные гены, позволяющие корректно интерпретировать результаты ПЦР в реальном времени и определять даже такие небольшие изменения в экспрессии генов при работе с ИПСК, НП и нейрональными культурами клеток. Компактность полученных наборов генов делает удобным их применение в повседневной работе. При нормировке результатов ПЦР в эксперименте с участием ИПСК, НП и нейронов требуется использовать наибольшее количество нормировочных генов (четыре). Для ИПСК требуется два или три нормировочных гена, для НП — два нормировочных гена, для нейронов — два или три гена. Полученный результат отражает природу исследуемых типов клеток. Репрограммирование до плюрипотентного статуса - стохастический, ступенчатый процесс, который требует кардинального изменения профиля экспрессии, эпигенетического статуса и структуры хроматина [54]. Такие изменения могут вызывать изменения клеточного метаболизма, а вслед за этим, нарушать стабильность экспрессии генов домашнего хозяйства. Поэтому для нормировки результатов ПЦР в реальном времени при работе с ИПСК требуется больше нормировочных генов.