Кариологическая и цитохимическая характеристика перевиваемых линий клеток пермиссивных и непермиссивных (резистентных) к вирусу классической чумы свиней Колбасова, Ольга Львовна

Введение к работе

Актуальность выбранной темы

Создание эффективных систем культивирования вирусов во многом определяется биологическими характеристиками и свойствами применяемых клеточных субстратов. В настоящее время недостаточно рекомендовать для проведения того или иного исследования клеточные культуры вообще: в каждом конкретном случае необходим обоснованный выбор клеточных культур определенных типов, наиболее отвечающим целям и задачам планируемого эксперимента.

В то же время не вызывает сомнения, что большая часть перевиваемых линий клеток состоит из неоднородных в генетическом и физиологическом отношениях клеточных элементов и даже соблюдение неизменного режима культивирования не гарантирует стандартности результатов при вирусологических исследованиях [Полянская Г.Г., Ефремова Т.Н., 1996; Мамаева С.Е., 1996].

При использовании перевиваемых культур клеток нельзя не учитывать изменчивость их морфофизиологических и генотипических свойств, которые отражаются на результатах вирусологических экспериментов и, в частности, на чувствительности культур к некоторым вирусам [Дьяконов Л.П., 2000; Миронова Л.Л., 1994, Подчерняева Р.Я., 1996].

Эта проблема возникла при изучении одной из опасных вирусных болезней животных - классической чумы свиней (КЧС). Высокая контагиозность и смертность среди заболевшего поголовья при данной инфекции диктуют необходимость совершенствования диагностических методов и профилактических препаратов, получение которых невозможно без подбора эффективных систем культивирования [Цыбанов С.Ж., Куриннов В.В., Вишняков И.Ф., Семенихин А.Л., 1995; Сергеев О.В. 1997].

Перевиваемая линия клеток почки поросенка РК-15 является общепризнанной культуральной системой, используемой при идентификации вируса КЧС, а так же для его накопления и титрования. Однако нестабильность чувст-

з вительности клеточных культур даже к адаптированному вирусу КЧС, широкая

вариабельность в вирусрепродуцирующих свойствах различных субпопуляций клеток РК-15, полученных из различных лабораторий мира, периодические потери чувствительности этими клетками к вирусу КЧС, отмеченные как в отечественных, так и в зарубежных исследованиях [ Liess, 1988; Floegel et al., 1998; Куриннов B.B., 2000; ], наряду с важностью совершенствования средств диагностики, профилактики, биотехнологического обеспечения производства вакцины против КЧС, высокопродуктивными клеточными субстратами требует детального изучения взаимоотношений клетки и вируса, выяснение механизмов пермиссивности и резистентности клеточных культур к данному возбудителю.

Цель и задачи исследований.

Целью настоящей работы является изучение факторов, определяющих пермиссивность и резистентность клеточных линий к вирусу КЧС. Для достижения данной цели необходимо решить следующие задачи:

1. Провести кариологический анализ всех сублиний клеточной культуры почки поросенка РК-15, имеющихся в коллекции ВНИИВВиМ;

2. Клонировать клетки РК-15 и получить популяции, отличающиеся по своим биологическим характеристикам;

3. Провести цитогенетический и рецепторный анализы полученных клонов с различной чувствительностью к вирусу КЧС;

4. Установить связь между кариологическими и цитохимическими характеристиками и их чувствительностью к вирусу КЧС;

5. Стабилизировать биотехнологические свойства высокочувствительных к вирусу КЧС клонов клеток.

Научная новизна результатов

Научная новизна проведенных исследований заключается в том, что:

6. Показана гетерогенность перевиваемой линии клеток почки поросенка РК-15 по цитоморфологическим, ростовым, кариотипическим характеристикам и фактору пермиссивности к вирусу КЧС;

7. Впервые получены клоны перевиваемой линии клеток РК-15, высокочувствительные к вирусу КЧС, содержащие 31 хромосому в клетках модального класса - РК-15/В5 и РК-15/А11, полученные кло-нальные сублинии клеток депонированы во ВСКК СХЖ;

8. Установлено, что ведущая роль в механизме пермиссивности и резистентности клеток клонов к вирусу КЧС принадлежит внутриклеточным факторам, подтверждением чему служит эквивалентность показателей уровня рецепторо-зависимой сорбции вируса клетками с различными вирусрепродуцирующими свойствами (от 2,5 до 7,5 lg ККИД₅₀/мл);

9. Установлена связь между уровнем пермиссивности клеточных культур к вирусу КЧС и активностью фермента неспецифических эсте-раз;

10. Определены оптимальные условия поддержания полученных клеточных культур, стабилизирующие биологические свойства клонов.

Практическая значимость результатов

На основе экспериментальных исследований рекомендованы для диагностических целей и экспертизы патологического материала на КЧС и производства вакцины против КЧС высокочувствительные и стабильные клональные сублинии клеток РК-15/В5 и РК-15/А11. Полученные сублинии депонированы во ВСКК СХЖ. Разработаны и утверждены:

11. Методические рекомендации по поддержанию и хранению культур клеток РК-15/В5 и РК-15/А11, полученных из перевиваемой линии клеток почки поросенка РК-15;

12. Методические рекомендации по определению активности неспецифических эстераз в культурах клеток;

5 3. Паспорта на клональные сублинии внесены в каталог клеточных культур ВНИИВВиМ

Апробация работы и публикации результатов исследований

Материалы диссертации доложены и обсуждены на научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» в ВНИТИБП (Щелково, Московской обл., 2000 г.), международной научно-практической конференции «Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными, экзотическими и зооантропонозными болезнями животных» (Покров, 2000г.) и на заседаниях Ученого Совета ВНИИВВиМ (1998-2000 гг.).

По материалам исследований опубликовано 7 научных работ.

В выполнении различных разделов диссертации принимали участие и оказывали консультативную и практическую помощь сотрудники института: д.б.н. Середа А.Д., к.в.н. Куриннов В.В., Дмитренко В.В., Кушнир С.Д., Бузун А.И., к.б.н. Чермашенцева Н.А., Смыслова Н.Ю., Лыска В.М., аспиранты Луговцев В.Ю., Степанов А.В. За что приносим им свою благодарность.

Основные положения, выносимые на защиту

13. Экспериментально-теоретическое обоснование клонального анализа ПЛК для изучения факторов пермиссивности и резистентности клеток к вирусу КЧС;

14. Получение клонов перевиваемой линии клеток РК-15 и изучение их культуральных, морфологических, кариологических, цитохимических характеристик и вирусрепродуцирующих свойств;

15. Данные экспериментов по определению факторов вирусной пермиссивности полученных клонов, выявивших взаимосвязь чувствительности клеток свиного происхождения с уровнем активности неспецифических эстераз клеток;

4. Стабилизация высокочувствительных к вирусу КЧС клонов клеток по культуральным, морфологическим, кариологическим, цитохимическим и вирусрепродуцирующим характеристикам и их использование в вирусологической практике.

Объем и структура работы