Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1. Терагерцовое излучение, его свойства и особенности 13
1.2. Сферы применения терагерцового излучения 17
1.3. Влияние терагерцового излучения на живые организмы 26
1.3.1. Общие замечания 26
1.3.2. Биоэффекты на разных уровнях организации живой материи: миниобзор 33
1.3.2.1. Молекулярный уровень: исследования на препаратах белков и нуклеиновых кислот 33
1.3.2.2. Молекулярный уровень: исследования на клеточных системах с применением молекулярно-генетических подходов к анализу 37
1.3.2.3. Клеточно-тканевый уровень: исследования на клеточных системах с применением цитологических и цитогенетических подходов к анализу 47
1.3.2.4. Организменный уровень: исследования на многоклеточных организмах с анализом системных организменных признаков 52
1.4. Биосенсорный подход к изучению воздействия терагерцового излучения на живые организмы 55
1.4.1. Флуоресцентные бактериальные биосенсоры: общая информация 56
1.4.2. Флуоресцентные биосенсоры на основе клеток Escherichia coli в молекулярно-генетических исследованиях воздействия терагерцового излучения на бактериальные клетки 60
1.5. Заключение по обзору литературы 65
Глава 2. Материалы и методы 66
2.1. Материалы 66
2.1.1. Реактивы 66
2.1.2. Питательные среды 67
2.1.3. Бактериальные штаммы 68
2.1.4. Плазмиды 68
2.1.4.1. Флуоресцентные белки TurboGFP и TurboYFP, кодируемые плазмидами 69
2.2. Методы 70
2.2.1. Получение геносенсорных плазмидных конструкций: pMatAurboGFP, pSafAurboGFP, pChbBurboYFP и pTdcRurboYFP 71
2.2.1.1. Подбор сенсорных промоторов: PmatA, PsafA, PchbB и PtdcR — по данным РНК-секвенирования транскриптома 71
2.2.1.2. Выделение хромосомной ДНК на спин-колонках 71
2.2.1.3. Наработка исходных ДНК-фрагментов с хромосомы Escherichia coli и с плазмидных векторов pTurboGFP-B и pTurboYFP-B методом полимеразной цепной реакции 72
2.2.1.4. Аналитический электрофорез ДНК-фрагментов в агарозном геле 75
2.2.1.5. Сшивка ДНК-фрагментов по методу Гибсона 75
2.2.2. Получение биосенсорных клеток: E. coli/pMatAurboGFP, E. coli/pSafA TurboGFP, E. coli/pChbBurboYFP и E. coli/pTdcRurboYFP 76
2.2.2.1. Приготовление электрокомпетентных клеток Escherichia coli 76
2.2.2.2. Трансформация электрокомпетентных клеток геносенсорными плазмидными конструкциями методом электропорации 77
2.2.2.3. Отбор целевых трансформантов 77
2.2.2.3.1. Выделение плазмидной ДНК на спин-колонках 78
2.2.2.3.2. Амплификация ДНК области встройки в гибридных плазмидах методом полимеразной цепной реакции 79
2.2.2.3.3. Секвенирование ДНК по Сэнгеру 80
2.2.2.4. Приготовление препаратов биосенсорных клеток 81
2.2.3. Исследование биосенсоров в различных условиях 81
2.2.3.1. Терагерцовое облучение 81
2.2.3.1.1. Подготовка клеток 81
2.2.3.1.2. Ёмкости для облучения образцов 82
2.2.3.1.3. Воздействие высокоинтенсивным импульсным излучением 83
2.2.3.1.4. Воздействие низкоинтенсивным непрерывным излучением 86
2.2.3.2. Тепловой шок 87
2.2.3.3. Химический стресс 88
2.2.3.4. Анализ индукции биосенсоров методом флуориметрии 88
2.2.3.5. Анализ копийности геносенсорных плазмид в биосенсорах методом количественной полимеразной цепной реакции 88
2.2.3.6. Анализ динамики роста биосенсоров методом спектрофотометрии 91
2.2.3.7. Обработка данных 91
Глава 3. Результаты 93
3.1. Получение биосенсоров: E. coli/pMatAurboGFP, E. coli/pSafAurboGFP, E. coli/pChbBurboYFP и E. coli/pTdcRurboYFP 93
3.2. Индукция биосенсоров при терагерцовом облучении 95
3.2.1. Воздействие высокоинтенсивным импульсным излучением 95
3.2.2. Воздействие низкоинтенсивным непрерывным излучением 97
3.2.3. Сравнение воздействия разным терагерцовым излучением 100
3.2.4. Влияние состава питательной среды и формы облучаемой ёмкости на терагерцовую индукцию биосенсора E. coli/pTdcRurboYFP 101
3.3. Копийность геносенсорных плазмид при терагерцовом облучении биосенсоров E. coli/pSafAurboGFP и E. coli/pTdcRurboYFP 107
3.4. Динамика клеточного роста при терагерцовом облучении биосенсора E. coli/pTdcRurboYFP 108
3.5. Индукция биосенсоров при воздействии тепловым шоком 110
3.6. Индукция биосенсоров при воздействии химическим стрессом 112
Глава 4. Обсуждение результатов 115
4.1. Биосенсоры E. coli/pMatAurboGFP, E. coli/pSafAurboGFP, E. coli/pChbBurboYFP и E. coli/pTdcRurboYFP: основные особенности 115
4.2. Промоторы PmatA, PsafA, PchbB и PtdcR: функции в клетках Escherichia coli и возможное участие в адаптивном клеточном ответе на терагерцовое излучение 117
4.3. Реакция биосенсоров на воздействие терагерцовым излучением с различными физическими параметрами 129
4.4. Влияние состава питательной среды и формы облучаемой ёмкости на терагерцовую индукцию биосенсоров 137
4.5. Тепловая и химическая индукция биосенсоров 143
Заключение и выводы 146
Список сокращений и условных обозначений 150
Список литературы 152
Благодарности 197
Приложение А. Результаты контрольных холостых экспериментов 198
Приложение Б. Результаты индукции биосенсоров при воздействии тепловым шоком и химическим стрессом 200
- Сферы применения терагерцового излучения
- Флуоресцентные биосенсоры на основе клеток Escherichia coli в молекулярно-генетических исследованиях воздействия терагерцового излучения на бактериальные клетки
- Воздействие низкоинтенсивным непрерывным излучением
- Тепловая и химическая индукция биосенсоров
Сферы применения терагерцового излучения
Освоение ЭМИ ТГц диапазона тесно сопряжено с развитием технических возможностей в области электроники и фотоники, что служит созданию более компактных и эффективных ТГц устройств: как активных (генераторов, усилителей и приемников), так и пассивных (аттенюаторов, модуляторов, поляризационных преобразователей и пр.) [20]. Результаты анализа соответствующей патентной документации [18] наглядно демонстрируют прогресс в создании ТГц техники, который начал отчётливо обозначаться более двух десятилетий назад (рисунок 3). В целом ТГц разработки преимущественно относятся к трём категориям: измерительная техника, оптика и телекоммуникации; далее следуют полупроводниковые и медицинские технологии; в ещё меньшей степени — энергетика, экология, материаловедение, анализ биологических образцов и др. [18].
ТГц спектроскопия и ТГц имиджинг — подходы, которые реализованы в той или иной форме в подавляющем большинстве применений Т-лучей. В случае ТГц спектроскопии наибольшее распространение имеет так называемая ТГц спектроскопия временного разрешения (англ. «THz time-domain spectroscopy», THz TDS), которая основана на генерации и детектировании когерентного ТГц излучения с помощью импульсов от одного лазерного источника, с получением информации о сдвиге фазы ЭМИ при его взаимодействии с объектом. Данный метод позволяет исследовать сверхбыстрые, на уровне долей пикосекунды, процессы [22].
В случае ТГц имиджинга (т. е. видения) речь идёт о построении ТГц спектральных изображений объектов с субмиллиметровым пространственным разрешением; при сканировании регистрируется ТГц излучение, прошедшее насквозь или отразившееся от каждой точки образца — в результате формируется ТГц картина пропускания и отражения. В отличие от оптического или рентгеновского имиджинга, данный метод даёт более сложную информацию об объекте, т. к. может предоставить данные не только о средней интенсивности пучка в каждой точке сканирования, но и о полной временной форме импульсов [22].
В целом следует отметить, что помимо создания оборудования, ТГц приложения часто нуждаются в разработке достаточно сложных компьютерных алгоритмов. Например, это особенно характерно в случае точной идентификации веществ и определения их количества в многокомпонентных системах [23-25], где алгоритмы необходимы для существенного улучшения разрешающей способности методов — минимизации шума и повышения качества полезного сигнала.
Как уже было отмечено, Т-лучи задействуются во многих, отчасти пересекающихся, сферах деятельности, которые суммарно могут быть обозначены как следующие [3; 18; 26-30]:
неразрушающий контроль материалов и конструкций, а также пищевой, фармацевтической, сельскохозяйственной и др. продукции;
обеспечение безопасности, в т. ч. противодействие терроризму: дистанционное зондирование на предмет наличия холодного и огнестрельного оружия, опасных веществ;
беспроводные технологии передачи данных: радиолокация и телекоммуникации;
экологический мониторинг;
научно-исследовательская деятельность: фундаментальная и прикладная;
медицина: диагностическая и терапевтическая.
Неразрушающий контроль, основанный на ТГц ЭМИ, применим по отношению к разного рода выпускаемой продукции, такой как продукты питания [31] и фармацевтические препараты [32; 33]. Так, например, для мелатонина установлены два характерных пика в ТГц спектре поглощения — при 3,21 и 4,20 ТГц — что позволяет проводить его идентификацию в медикаментах и осуществлять оценку их качества [32]. Т-лучи могут оказаться полезными и в сельском хозяйстве [34; 35]. В частности, имиджинг в диапазоне 0,5-2,0 ТГц, основанный на детекции пропускаемого сигнала, предложено использовать для оценки качества семян подсолнечника: для установления наличия разных дефектов и определения соотношения размеров ядра и оболочки [35]. Большое количество ТГц разработок представляет ценность для технической промышленности в сфере контроля качества различных материалов и устройств [36; 37]. Для гражданской авиации, например, ТГц анализ композитных ламинатов — по отражённому сигналу в диапазоне 0,12-2,0 ТГц — показал хорошие перспективы в количественном определении дефектов, обусловленных низкоскоростными ударными воздействиями [38]. Также ТГц приборы находят применение в измерительной технике для исследования разного рода физических процессов, например, при взаимодействии электронных и лазерных пучков с плазмой [39].
Использование Т-лучей в системах обеспечения безопасности — в первую очередь для сканирования людей и багажа с целью выявления опасных предметов и веществ — базируется на ряде принципиальных для этой сферы особенностей ТГц спектроскопии и имиджинга [1; 20]:
многие неметаллические, неполярные материалы (в частности, сухая одежда) в ТГц спектре прозрачны; с другой стороны, ТГц излучение хорошо отражается металлами (к примеру, скрытым оружием);
спектроскопические сигнатуры взрывчатых и ядовитых веществ, наркотиков лежат в ТГц частотной области;
в сравнении с высокоэнергетическим рентгеновским, ТГц излучение не представляет явную биологическую опасность при сканировании людей и животных.
К примеру, разработана система удалённого 2D-сканирования людей, работающая на частоте 0,1 ТГц и позволяющая обнаруживать скрытые под одеждой предметы: с расстояния 3-6 м и соответственно с латеральным разрешением 3-6 см, при глубине резкости около 30 см [40].
В случае беспроводных технологий, а именно для радиолокационных и телекоммуникационных применений, ТГц системы передачи данных демонстрируют высокую пропускную способность (теоретически вплоть до 100 Гбит/с [41]) и имеют некоторые другие характерные преимущественные особенности в сравнении более традиционными системами беспроводной передачи данных [20; 41; 42].
В экологическом мониторинге ТГц ЭМИ, например, применимо для неинвазивного определения содержания воды в растениях [34; 43] или сверхчувствительного детектирования химических загрязнителей в различных средах [44–46]. Например, для пестицидов ацетамиприда, имидаклоприда и триадимефона показаны характерные пики поглощения в диапазоне 0,4–1,7 ТГц, которые, начиная с определённых концентраций этих поллютантов, хорошо выявляются при анализе продуктов питания [45].
В научно-исследовательской деятельности ТГц методы находят применение во многих разделах физики, химии, биологии и медицины [26]. В первую очередь это относится к ТГц спектроскопии различных веществ: низкомолекулярных органических соединений [47; 48], дезоксирибонуклеиновых кислот (ДНК) [49; 50], рибонуклеиновых кислот (РНК) [51], белков [52; 53] и пр. ТГц спектроскопия и имиджинг активно используются при изучении различных объектов; в особенности это касается биологических клеток и тканей [54; 55], в т. ч. разрабатываются технологии имиджинга морфологии одиночных клеток [56]. Широкий диапазон ТГц измерительных техник используется в археологии и искусствоведении [57; 58]; в астрофизических исследованиях ТГц телескопы находят всё большее применение: как в исследовании фонового космического излучения, так и для анализа спектров различных астрономических объектов [11]. Особое внимание в последнее время уделяется ТГц излучению Солнца, при этом активно исследуются ТГц спектры солнечных вспышек [59].
Флуоресцентные биосенсоры на основе клеток Escherichia coli в молекулярно-генетических исследованиях воздействия терагерцового излучения на бактериальные клетки
Создание ТГц-чувствительных флуоресцентных бактериальных биосенсоров, несущих гибридные геносенсорные ДНК-конструкции, служит цели расширения возможностей оценки функционирования генных сетей в условиях воздействия ТГц ЭМИ. При этом биосенсорный подход позволяет в реальном времени прижизненно измерять экспрессионную активность заданных генов в отдельных бактериальных клетках или клеточных культурах. При создании геносенсорных конструкций выбор того или иного чувствительного (сенсорного) промотора в некотором приближении определяет группу ассоциированных с данным промотором метаболических звеньев, которые могут быть задействованы в клеточном ответе на ТГц излучение и которые, соответственно, через флуоресцентную активность биосенсора косвенно исследуются. Важным при этом оказывается возможность длительных наблюдений (которые фактически ограничены только условиями клеточного роста в течение периода анализа), позволяющих выявлять ранние и поздние ответы клеток на облучение.
К настоящему моменту биосенсорные исследования в сфере ТГц тематики ограничены работами, выполненными в лаборатории молекулярных биотехнологий «Федерального исследовательского центра Институт цитологии и генетики СО РАН» (ИЦиГ СО РАН; г. Новосибирск) [124; 131; 259; 267–273]. В общей сложности, в той или иной степени исследована ТГц индукция пяти флуоресцентных основанных на клетках E. coli биосенсоров, в которых репортерным элементом служил ген белка GFP(AAV), являющегося модифицированным вариантом GFP из медузы Aequorea victoria, с укороченным временем полужизни [274], а чувствительным — промотор одного из пяти генов: фермента антиоксидантной системы (АОС) каталазы (точнее, бифункциональной гидропероксидазы I) katG [124; 131; 259; 267; 268; 273], медного шаперона copA [124; 259; 267; 268; 273], регулятора мультилекарственной устойчивости emrR [124; 259; 267; 268; 273], фермента глутаминсинтетазы glnA [259; 270; 272] и полифункционального антистрессового белка dps (pexB) [267]. При этом гибридные плазмиды pCopA-GFP и pGlnA-GFP были специально получены непосредственно в рамках данных работ, а pKatG-GFP, pEmrR-GFP и pDps-GFP предоставлены для экспериментов сторонними лабораториями (см. соответственно [124], [275] и [264]). В случае конструкции pGlnA-GFP, промотор гена glnA был предварительно выбран по результатам протеомного масс-спектрометрического анализа, показавшего повышенный уровень глутаминсинтетазы в облучённых клетках E. coli [259; 269–272].
При исследовании полученных биосенсоров воздействие импульсным излучением на частоте 1,50, 2,00 или 2,31 ТГц (E = 0,14 Вт/см2, F = 5,6 МГц, = 100 пс, t = 5, 10 или 15 мин) осуществлялось на уникальной установке «Новосибирский ЛСЭ» [276] в центре коллективного пользования (ЦКП) «Сибирский центр синхротронного и ТГц излучения» (Институт ядерной физики им. Г. И. Будкера СО РАН, г. Новосибирск) [277]. Суспензионные клеточные культуры облучались в специальной кювете, аналогичной представленной в настоящей диссертационной работе (см. раздел 2.2.3.1.2), и затем инкубировались в стандартном 96-луночном плоскодонном планшете на термошейкере при 37 оС в течение достаточно длительного времени (до 5 ч), в ходе которого осуществлялся периодический анализ флуоресценции при возбуждения 485 нм и эмиссии 535 нм. При этом интенсивное ТГц излучение нагревало облучаемые бактериальные культуры до 35 ± 2 оС; соответственно, контрольные образцы в ходе облучения параллельно инкубировались в кювете в термостате при 37 оС.
Для четырёх из пяти биосенсоров (кроме E. coli/pEmrR-GFP) показана выраженная продолжительная индукция (флуоресценция) клеточных культур — в экспериментах с 15-минутным облучением на частоте 2,31 ТГц [124; 131; 259; 267– 273] (рисунок 8).
На примере Е. coli/pKatG-GFP была установлена пороговость индукции биосенсора: слабая, в сравнении с контролем, нестабильная светимость при экспозиции в течение 10 мин, и отсутствие таковой при 5 мин [131; 259]. Также на данном биосенсоре продемонстрирована сопоставимая по интенсивности с вышеописанной его индукция, вызванная 15-минутной ТГц экспозицией на других частотах: 1,50 и 2,00 ТГц [131; 259].
Помимо термостатирования контрольных образцов во всех описанных экспериментах по ТГц облучению биосенсоров, дополнительным подходом, подтверждающим нетепловой характер ТГц воздействия на промоторы исследуемых генов, послужило отдельное выполнение температурного теста: инкубация клеток при 42 оС в течение 15 мин — индукция биосенсоров при этом отсутствовала [124; 131; 259].
Индукция рассматриваемых биосенсоров ассоциировалась с участием определённых генных сетей в развитии бактериального клеточного ответа на нетермическое ТГц ЭМИ, рассматриваемое авторами как фактор в первую очередь окислительного стресса, который вызывает активацию в клетках АОС, что отражается в положительном ответе биосенсоров: Е. coli/pKatG-GFP, Е. coli/pCopA-GFP и Е. coli/pDps-GFP — у которых в роли сенсорных выступают промоторы генов, так или иначе задействованных в АОС [268]. Отдельно также можно рассматривать влияние ТГц излучения на метаболизм меди, поскольку ген сopA кодирует АТФазную помпу, являющуюся центральным компонентом поддержания гомеостаза ионов данного металла [268]. В случае Е. coli/pDps-GFP, индукция биосенсора являлась маркером активации гена, кодирующего антистрессовый белок Dps. Поскольку он по-разному может быть задействован в защите клеток от неблагоприятных воздействий — через три базовых его свойства: связывание с ДНК, секвестрация железа и феррооксидазная активность [278] — то ТГц-зависимый флуоресцентный отклик Е. coli/pDps-GFP свидетельствовал о стрессе, молекулярная природа которого может быть различна. Индукция же E. coli/pGlnA-GFP служила в целом маркером раннего протеомного ответа на ТГц воздействие [259]. Биосенсорные эксперименты также показали, что ТГц излучение активирует исследуемые гены избирательно и со своими особенностями. Так, биосенсор E. coli/pEmrR-GFP, флуоресцентная активность которого отражает вовлеченность системы устойчивости к антибиотикам разных типов [279], при облучении не индуцировался [124; 259; 267; 273], а биосенсоры Е. coli/pKatG-GFP и Е. coli/pCopA-GFP показали кинетику индукционного ответа, отличную от таковой при воздействии естественными химическими стимулами: соответственно перекисью водорода [131; 259] и ионами двухвалентной меди [124; 259].
Особый интерес представляют эксперименты с отдельно облучённой питательной средой, в которую вносились необлучённые биосенсорные клетки. Так, на биосенсорах Е. coli/pKatG-GFP, Е. coli/pCopA-GFP и E. coli/pGlnA-GFP и двух средах (минимальными глицерол-глицерофосфатной [280] и минимальной солевой M9, дополненной глюкозой, казаминовыми кислотами, солями магния и кальция) показана возможность среды, облучённой в кювете по основной схеме ( = 2,31 ТГц, t = 15 мин), индуцировать биосенсоры без их непосредственного облучения. Биосенсор же Е. coli/pEmrR-GFP, как и при облучении самих клеток, при воздействии облучённой средой не индуцировался [259]. Во всех экспериментах динамика флуоресцентной светимости в целом совпадала с таковой при непосредственном облучении клеток. В ходе дополнительных экспериментов по индукции облучённой средой M9 биосенсора Е. coli/pKatG-GFP выявлены следующие особенности: пропорциональное снижение индукции при разведении облучённой среды необлучённой; длительное, вплоть до 20 ч, сохранение индукционных свойств среды; пропорциональное изменение индукции биосенсора в зависимости от дозы облучения среды, а именно от выставленных значений E, которые соответствовали нагреванию образца при облучении до температуры в диапазоне от 27 до 45 оС; участие именно органических компонентов среды — глюкозы и казаминовых кислот — в формировании её индукционных по отношению к биосенсору свойств [259].
Таким образом, описаны имеющиеся литературные данные по клеточным биосенсорам, чувствительным к нетермическому воздействию ТГц ЭМИ. По сути, все они относятся к результатам исследований, которые проведены на базе лаборатории молекулярных биотехнологий ИЦиГ СО РАН (г. Новосибирск) и касаются разработки и тестирования пяти флуоресцентных биосенсоров, основанных на клетках E. coli и несущих геносенсорные плазмидные конструкции.
Воздействие низкоинтенсивным непрерывным излучением
При воздействии на биосенсорные клетки 0,14 ТГц низкоинтенсивным непрерывным излучением, от генератора TeraSense, в LB в кювете с последующим 4,5-часовым анализом флуоресценции (инкубация при 37 оС и 800 об/мин) сразу после окончания облучения, показана индукция трёх биосенсоров: E. coli/pSafAurboGFP, E. coli/pChbBurboYFP и E. coli/pTdcRurboYFP (рисунок 20).
Кривые типичной динамики флуоресценции биосенсоров и соответствующие уравнения линейной регрессии (результаты одного независимого повтора) при воздействии ТГц излучением от генератора TeraSense в LB в кювете, в сравнении с контролем (инкубация при комнатной температуре): E. coli/pMatAurboGFP (а), E. coli/pSafAurboGFP (б), E. coli/pChbB TurboYFP (в) и E. coli/pTdcRurboYFP (г). На оси абсцисс отложено время после окончания ТГц либо контрольного воздействия. — уравнения регрессии посчитаны за первый 1-часовой период инкубации. Нормализованные значения индукции, в соответствии с её динамикой, рассчитывали по флуоресценции по прошествии 1 и 4,5 ч инкубации после облучения для биосенсора E. coli/pChbBurboYFP и двух остальных соответственно; линейный регрессионный анализ выполнен по флуоресценции также за указанные временные интервалы (рисунок 21).
Нормализованная индукция биосенсоров (средняя по независимым повторам, n = 5–6), рассчитанная как отношение их флуоресценции в опыте к таковой в контроле через определённое время инкубации (указано дополнительно), при воздействии ТГц излучением от генератора TeraSense в LB в кювете. Планки погрешностей отображают стандартное отклонение; bо и bк — средние коэффициенты линейной регрессии в опыте и контроле соответственно; — различие между b в опыте и контроле статистически значимо по критерию Вилкоксона (p 0,05, точное значение указано дополнительно).
При проведении контрольных холостых экспериментов — аналогичном исследовании клеток E. coli/pTurboGFP-B и E. coli/pTurboYFP-B при 30-минутном воздействии 0,14 ТГц низкоинтенсивным непрерывным излучением, от генератора TeraSense — показано отсутствие индукции клеток: по всем независимым экспериментальным повторам закономерных различий в динамике флуоресценции между опытом и контролем не выявлено (рисунок А.1 в приложении А).
Тепловая и химическая индукция биосенсоров
При тестировании на тепловой шок биосенсорные клетки инкубировали в LB в планшете при 42 оС в течение 30 мин. Тепловой шок не вызывал индукцию биосенсоров (рисунок 27; таблица Б.1 в приложении Б), и наличие такого результата, помимо обеспечения равных температурных условий в опыте и контроле при выявлении ТГц индукции биосенсоров, служило дополнительным критерием нетеплового характера ТГц воздействия на промоторы исследуемых генов.
При тестировании на химический стресс биосенсорные клетки инкубировали в LB в планшете с тем или иным химическим агентом, каждый из которых вызывает определённые токсические эффекты в клетках: перекись водорода — окислительный стресс, фенол — повреждение белков и клеточных мембран, митомицин C — повреждение ДНК [275], салициловая кислота — нарушение энергетического метаболизма [375], сульфат меди (II) — повреждение белков и окислительный стресс [376], хлорид железа (III) — окислительный стресс [377]. В результате митомицин C вызывал индукцию биосенсоров E. coli/pSafAurboGFP и E. coli/pTdcRurboYFP, и наиболее активная его концентрация в обоих случаях составила 9,6 М (рисунки 28 и 29; таблица Б.3 в приложении Б). Во всех прочих случаях химическая индукция биосенсоров отсутствовала (рисунок 28; таблица Б.2 в приложении Б).
Митомицин С является типичным генотоксическим соединением, оказывающим воздействие через образование поперечных ДНК-сшивок в местах расположения гуанин-цитозиновых динуклеотидных последовательностей [378]. Индукция данным антибиотиком биосенсора E. coli/pSafAurboGFP, а точнее активация промотора PsafA в составе его геносенсорной конструкции, легко объяснима с позиций клеточных функций ТФ YdeO, наработка которого контролируется этим промотором в геноме E. coli (таблицы 13 и 14). YdeO выступает активатором экспрессии UspD (таблица 14) — универсального стрессового белка D, который принимает важное участие в защите клеток от ДНК-повреждений [349; 379], и инициация синтеза которого при воздействии митомицином C в литературе ранее показана [379]. Индукция же данным генотоксическим соединением биосенсора E. coli/pTdcRurboYFP (активация промотора PtdcR в составе его геносенсорной конструкции) может объясняться косвенными подтверждением участия оперона tdcABCDEFG — который активируется продуктом гена tdcR (таблица 14) — в защите клеток от повреждений ДНК: установлено, что мутация в гене tdcE приводит к конститутивной экспрессии генов SOS-регулона, обеспечивающих функционирование центральной системы репарации ДНК E. coli [380]. Поясняя этот факт, авторы указывают на возможное взаимодействие со многими субстратами фермента TdcE, который может участвовать в т. ч. в расщеплении некоторых генотоксических соединений [380].
Таким образом, в рамках дополнительно исследуемых факторов показана в целом достаточно высокая избирательность индукции полученных биосенсоров в отношении ТГц ЭМИ. Митомицин С может рассматриваться в качестве химического, альтернативного ТГц излучению, индуктора биосенсоров E. coli/pSafAurboGFP и E. coli/pTdcRurboYFP.
В целом индукция биосенсоров определяется преимущественно свойствами их сенсорных промоторов, каждый из которых активируется в тех или иных естественных условиях. Соответственно, максимальная специфичность биосенсора к ТГц ЭМИ может быть обеспечена за счёт комбинации (объединения) внутри одной клетки нескольких флуоресцентно дифференцируемых ТГц-чувствительных геносенсорных элементов, возможность одновременной активации промоторов которых при условиях, отличных от ТГц воздействия, пренебрежимо мала. Поэтому разработка в дальнейшем именно таких, комбинированных, биосенсоров, в т. ч. на базе тех, что получены и охарактеризованы в настоящей диссертационной работе, является одним из путей закономерного развития данной тематики.