Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
1.1. Структура и функциональные особенности синдекана-1 10
1.1.1. Семейство синдеканов 10
1.1.2. Строение синдекана-1 14
1.1.3. Образование «растворимой» формы синдекана -1 15
1.1.4. Альтернативные экзоны синдекана-1 19
1.2. Атеросклероз и факторы риска его развития 20
1.2.1. Строение эндотелиального гликокаликса .22
1.2.2. Роль синдекана-1 в перестроении цитоскелета эндотелиальных клеток под действием напряжения сдвига .25
1.2.3. Роль синдекана-1 в миграции лейкоцитов .27
1.2.4. Транспорт холестерина и метаболизм липопротеинов 28
1.2.5. Синдекан-1 – рецептор печени, связывающий липопротеины с высоким содержанием триглицеридов .32
1.2.6. Мышиные линии С57Black и АпоЕ-/- 34
1.3. Структура полифункциональных белков 34
1.3.1. Компьютерные методы предсказания структуры белка 35
1.3.2. Предсказание вторичной структуры 36
1.3.3. Предсказание третичной структуры белка 38
1.3.4. Предсказание нативно-неструктурированных белков .39
2. Материалы и методы
2.1. Определение группы экспериментальной мышей .42
2.2. Макроскопический анализ дуги аорты у С57Black и АпоE-/- мышей .43
2.3. Выделение РНК .43
2.4. Синтез первой цепи кДНК 45
2.5. Определение уровня экспрессии гена синдекана-1 45
2.6. Измерение концентрации растворимого фрагмента синдекана-1 в сыворотке крови у С57Black и АпоE-/- мышей 47
2.7. Биохимический анализ сыворотки крови у С57Black и AпoE-/- мышей. 49
2.8. Предсказание пространственной структуры белков семейства синдеканов .51 2.9. Статистическая обработка данных 51
3. Результаты и обсуждение .52
3.1. Макроскопический анализ дуги аорты С57Black и AпoE-/- мышей 52
3.2. Анализ данных измерения уровня экспрессии гена синдекана-1 54
3.3. Результаты измерения концентрации растворимого фрагмента синдекана-1 в сыворотке крови у С57Black и AпoE-/- мышей 57
3.4. Результаты измерения биохимических параметров сыворотки крови исследуемых мышей 60
3.5. Предсказание вторичной структуры и пространственной структуры отдельных доменов коровых белков синдеканов .61
3.6. Обсуждение результатов 68
3.7. Заключение 73
4. Выводы 74
Благодарности 74
Список литературы
- Образование «растворимой» формы синдекана
- Синдекан-1 – рецептор печени, связывающий липопротеины с высоким содержанием триглицеридов
- Измерение концентрации растворимого фрагмента синдекана-1 в сыворотке крови у С57Black и АпоE-/- мышей
- Результаты измерения биохимических параметров сыворотки крови исследуемых мышей
Образование «растворимой» формы синдекана
Атеросклероз – это одно из самых распространенных заболеваний цивилизованных стран, когда в стенках магистральных артерий образуются атеросклеротические бляшки. Клиническое проявление атеросклероза связано с постепенным прорастанием бляшек в просвет сосуда, вплоть до полного закупоривания сосудов. В зависимости от органа, который снабжает кровью пораженная артерия, осложнения атеросклероза могут быть самыми разнообразными: инфаркт миокарда, ишемическая болезнь сердца, стенокардия, мозговой инсульт, деменция, стеноз артерий нижних конечностей. Процесс атерогенеза включает в себя взаимодействие разнообразных патогенетических факторов, но в основе развития атеросклероза главным образом лежит воспалительный процесс, который зарождается и развивается во внутренней стенке артерий, в зоне интима. Известно, что артерия состоит из трех слоев: внутренняя (интима), находится ближе к просвету сосуда; средняя (медиа) и наружная (адвентиция). Можно выделить несколько этапов развития атеросклероза: повреждение эндотелиального гликокаликса и инфильтрация липопротеидов низкой плотности; миграция и дифференциация моноцитов в макрофаги; формирование пенистых клеток; миграция и пролиферация гладкомышечных клеток в зону интима из зоны медиа; образование фиброзной капсулы. Развитие атеромы начинается задолго до проявления явных признаков, например, такого как сужение просвета сосудов, но именно на ранних этапах ее формирования, когда из пенистых клеток образуется липидная масса, может произойти разрыв в стенке эндотелия, вызвав окклюзию сосудов, и в некоторых случаях, стать причиной внезапной смерти. На более поздних этапах формирования атеромы, когда начинается активная пролиферация гладкомышечных клеток и их миграция в зону интима сосуда, образуется фиброзная капсула. На этой стадии, атеросклеротическая бляшка переходит в разряд «стабильной» и развивается медленно, вызывая постепенное ухудшение кровоснабжения. Известно, что при ламинарном движении крови и высоком напряжении сдвига атеросклероз не развивается. Также атеросклеротическая бляшка не развивается в венах, мелких артериях и капиллярах. Атерома появляется в определенных зонах турбулентного потока, т.е. на изгибах крупных и средних артерий и в зонах бифуркации, а также при уменьшении пристеночного напряжения сдвига. Атеросклероз легочной артерии встречается крайне редко и только при гипертонии малого круга кровообращения [45]. Из этого можно сделать вывод, что высокое давление и турбулентное течение являются необходимыми и достаточными условиями определения места локализации атеромы. Одна из наиболее принятой концепции раннего этапа развития атеросклероза является теория «реакция на повреждение», т.е когда образованию атеросклеротической бляшки, предшествует разрушение эндотелиального гликокаликса (ЭГ) [46] и усиленная миграция иммунных клеток в зону локального воспаления.
Идея, что повреждение ЭГ как-то связана с развитием атеросклероза подтвердилась в многочисленных экспериментах. Так, группа американских ученых в 1980-х [47], при изучении коронарных артерий голубей, заметила, что толщина ЭГ в зонах, где образуются бляшки, гораздо тоньше по отношению к здоровым сосудам. Ученые из Голландии подтвердили это наблюдение на мышах, у которых в коронарных артериях толщина ЭГ в зонах поражения была намного тоньше по сравнению с соседними участками сосуда, где бляшки не развивались. Более того, у крыс на диете с высоким содержанием жиров, которым искусственно разрушали ЭГ с помощью баллона, вставленного в коронарную артерию, стремительно развивалась атеросклеротическая бляшка [48,49].
ЭГ состоит из протеогликанов, гликопротеинов, закрепленных в клеточной мембране, эктодомены которых удерживают различные гликозаминогликаны (рис.6). Сложная структура и расположение на границе взаимодействия кровотока и эндотелия определяет широкий спектр функций ЭГ. ЭГ обеспечивает защиту эндотелия от патогенного воздействия, избирательную инфильтрацию компонентов крови, защиту от механического воздействия движения крови [50]. Общий отрицательный заряд ЭГ обеспечивает ему взаимодействие с катион-активными сайтами белков плазмы крови, ферментов, ингибиторов, факторов роста, цитокинов, а также с катионами и водой. Дополнительный уровень сложности биологической структуры образуется за счет ее динамичности. Пространственное расположение ЭГ определяется его связью с молекулами крови, именно эти взаимодействия дают возможность цепям гликозаминогланов растягиваться в пространстве, причем максимум растяжения образуется при физиологической концентрации раствора хлорида натрия, аналогичного плазме крови. В этих условиях каждая цепь гликозаминоглана может растянуться до 80%, относительно своей контурной длины [50].
Рис. 6. Схематическое изображение всех компонентов ЭГ, рисунок изменен и адаптирован [50]. Кавеолин ассоциирован с участками мембраны, богатой холестерином и сфинголипидами, вместе они образуют пещероподобные впадины в мембране. Глипикан, связан с гепарансульфатом и, как правило, расположен в кавеолах. SDC1 изображен в форме димера и содержит цепи гепарансульфата и хондроитинсульфата. Гликопротеин связан с сиаловой кислотой. Гиалуроновая кислота связана с трансмембранными рецепторами CD44, которые также соединены с хондроитинсульфатом и расположены в кавеолах. Многочисленные белки плазмы крови, катионы и факторы роста, удерживаются в ЭГ отрицательно заряженными гликозамингликанами.
Гликозаминогликаны, ассоциированные с внутренней поверхностью артерий это гепарансульфаты, хондроитинсульфаты и гиалуроновая кислота. Доля гепарансульфата может достигать до 50-90% от общего пула гликозаминогликанов. Предположительно, в ЭГ существует два основных коровых белка, связывающих гепарансульфат - это SDC1 и глипикан-1. Есть мнение о разделении функций между SDC1 и глипиканом-1. Так, SDC1 передает сигнал на перестроение цитоскелета, а активация сигнала для синтеза NO проходит через глипикан [50].
SDC1 (33 kDa), трансмембранный белок, который синтезируется эндотелиальными клетками, имеет три сайта связывания с гепарансульфатом, расположенных близко к N-концу цепи и два дополнительных сайта для связывания хондроитинсульфата, расположенных ближе к мембране [50]. Цитоплазматический домен SDC1 связывается со структурными белками клетки. Трнасмембранный домен содержит мотив GхххG, который отвечает за димеризацию как самим собой, так и другими рецепторами, а также за удержание холестерина в мембране[17,38,51]. Из последнего можно предположить, что синдеканы локализованы в липидных плотах. Липидные плоты представляют собой участки клеточной мембраны богатые холестерином и сфинголипидами. Эти участки имеют более «твердую» и организованную структуру по отношению к «текучему» липидному бислою мембраны и необходимы для сосредоточения рецепторов и передачи сигналов с поверхности мембраны в клетку.
Глипикан-1 (64 kDa) содержит 3-4 сайта, связывающих гепарансульфат и находящихся близко к мембране [50]. Глипикан заякоривается в мембране через гликозилфосфатидилинозитол (ГФИ). ГФИ способствует перемещению глипикана в кавеолы, которые могут быть рассмотрены как вид липидного плота, только намного больше по размеру и имеющих вид ям и впадин, поддерживающихся цитоскелетом [52]. Кавеолы играют важную роль в эндоцитозе и передаче сигналов из внешнего окружения во внутреннюю часть клетки.
Синдекан-1 – рецептор печени, связывающий липопротеины с высоким содержанием триглицеридов
Концентрация растворимого фрагмента SDC1 в сыворотке крови экспериментальных мышей, была определена с помощью метода иммуноферментного анализа (Elisa - enzyme-linked immunosorbent assay) по типу «сэндвич». Для проведения измерений был использован кит Mouse SDC1/CD138ELISA KIT (Sandwich) -LS-F6487. В основе метода лежит взаимодействие антиген-антитело. Кровь для анализа отбирали из орбитального венозного синуса глаза. Для получения сыворотки образцы крови ставили на ночь на +4о, затем центрифугировали 20 минут при 3000 оборотах в минуту. Отобранную сыворотку замораживали при -70 оС. Далее, в планшет, внутренние лунки которого иммобилизованы специфическими антителами к SDC1, добавляли исследуемую сыворотку и в качестве контроля использовали готовые стандарты с уже известной концентрацией антител к SDC1. В процессе двух часов инкубации при температуре 37оС на твердой фазе образовывался комплекс антиген-антитело. Затем, после удаления жидкой фазы, в лунки добавляли вторичные антитела, меченные биотином и специфичные к другому эпитопу SDC1. На этой стадии образовался иммунный комплекс антигена с молекулами иммобилизованных и биотинилированных антител, который напоминал «сэндвич», отсюда и название метода. Вторичная инкубация длилась один час, также при температуре 37оС, после чего удаляли избыток конъюгата и лунки три раза промывали специальным промывочным буфером. Затем добавляли меченый пероксидазой конъюгат авидина. Авидин имеет 4 сайта связывания с биотином и высокую константу связывания. Следующая инкубация длилась 30 минут при температуре 37оС, после чего лунки промывали пять раз и добавляли субстрат тетраметилбензидин (ТМБ), в процессе пероксидазной реакции субстрат окрашивался. Реакция проводилась в темном месте при температуре 37оС и длилась порядка 20 минут, затем, чтобы остановить процесс окрашивания, добавляли стоп реагент. Интенсивность окрашивания отражала количество выявленных специфических антител к SDC1. Измерение производилось на длине волны 450 nm с помощью спектрофотометра. Количественная оценка производилась путем расчета, используя данные калибровочной кривой, построенной на основе разведенных в несколько шагов стандартов и измеренной оптической плотностью этих разведений.
Измерение биохимических параметров крови было проведено с помощью автоматического биохимического анализатора SAPPHIRE 400 (Prestige 24i) (Tokyo Boeki, Japan) с использованием реактивов, предоставленных лабораторией Randox. Для количественного определения общего белка применялся биуретовый метод. В основе метода лежит способность белков в щелочной среде связываться с двухвалентными ионами меди с образованием биуретового комплекса фиолетового цвета, что легко определяется измерением оптической плотности полученного образца. Для количественного определения альбумина применялся бромкрезоловый зеленый метод, в основе которого заложена способность альбумина образовывать комплексы с бромкрезоловым зеленым в кислой среде, что также легко измеряется с помощью спектрофотометра. Измерение мочевины проводилось с помощью кинетического метода с использованием уреазы. Известно, что уреаза катализирует гидролиз мочевины с образованием аммиака и углекислого газа. При последующем добавлении глутамата и аденозинтрифосфатов, а также в присутствии глутаминсинтетазы, образуется аденозиндифосфат. Последний в присутствии ферментов пируваткиназы и пируватоксидазы, способствует образованию перекиси водорода. На заключительном этапе происходит образование комплекса между пероксидом, фенолом и 4-аминоантипирином при участии фермента пероксидазы, что также легко измеряется с помощью спектрофотометра. Измерение креатинина осуществлялось с помощью метода щелочного пикрата. Креатинин в щелочной среде образует комплекс с пикратом оранжевого цвета, который также измеряется с помощью спектрофотометра. Общий холестерин измеряли с помощью холестериноксидазного метода. В основе метода заложен тот принцип, что при гидролизе с помощью фермента холестеринэстеразы из эфиров холестерина образуется свободный холестерин, который затем в присутствии фермента холестериноксидазы и молекул кислорода окисляется с образованием перекиси водорода. Под действием пероксидазы перекись водорода окрашивает хромогенные субстраты с образованием комплекса, который измеряется с помощью спектрофотометра. Триглицериды были измерены с помощью ферментативного метода. Известно, что триглицериды под действием липазы превращаются в свободный глицерин, который в присутствии фермента глицеролкиназы превращается в глицерол-З фосфат. Последний окисляется в присутствии фермента глицеролфосфатоксидазы до диоксиацетонфосфата с образованием перекиси водорода. Далее, как в предыдущих реакциях, в присутствии пероксидазы перекись водорода образует комплекс с субстратом и измеряется с помощью спектрофотометра. Аланинаминотрансфераза и аспартатаминотрансфераза с помощью трис-буфера без пиродоксаль-5-фосфатазы. Активность щелочной фосфатазы была определена по уровню неорганического фосфора, так как под действием этого фермента Р-глицерофосфат натрия подвергается гидролизу с освобождением неорганического фосфора. Для определения концентрации общего кальция был применен арсеназный метод. В щелочной среде кальций взаимодействует с арсеназо III с образованием комплекса розового цвета, который измеряется с помощью спектрофотометра. Неорганические фосфаты измерялись методом с применением молибденовой кислоты, так как в ее присутствии образуется фосфорованадомолибденовый комплекс, который потом измеряется с помощью спектрофотометра. Ионы хлоридов измерялись колометрическим методом, основанном на образовании комплексов хлора с тиоционатом ртути, которые измеряются с помощью спектрофотометра. Для определения качества биохимического анализа сыворотки исследуемых мышей в качестве контроля была использована коммерческая сыворотка человека (Randox).
С помощью программы PsiPred была предсказана вторичная структура белков семейства синдеканов. Программа представлена в открытом доступе на сайте: http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/. Наличие предсказанного ЯМР цитоплазматического домена SDC4, позволило нам воспользоваться программой SWISS-MODEL для предсказания структуры цитоплазматических доменов остальных представителей семейства синдеканов. Программа PEP FOLD3 была выбрана для предсказания структуру сигнальных пептидов и трансмембранных доменов синдеканов. Программы представлены в открытом доступе на сайтах: https://swissmodel.expasy.org и http://bioserv.rpbs.univ-paris diderot.fr/services/PEP-FOLD3/, соответственно. Программы IsUnstruct и IUPred, а также мета-серверы PONDR-FIT и MetaDisorder были выбраны для предсказания неструктурированных участков коровых белков синдеканов. Все программы представлены в открытом доступе на сайтах: http://iupred.enzim.hu/, http://bioinfo.protres.ru/IsUnstruct/, http://www.disprot.org/search, http://iimcb.genesilico.pl/metadisorder, соответственно. Вычисление лиганд-связывающих участков, осуществили с помощью программы ANCHOR, которая представлена в открытом доступе на сайте http://anchor.enzim.hu/.
Аминокислотные последовательности коровых белков синдеканов, были рассмотрены SDC1, SDC 2, SDC 3 и SDC 4 из 25 организмов млекопитающих. Данные последовательности взяты из баз данных GenBank и Uniprot.
Измерение концентрации растворимого фрагмента синдекана-1 в сыворотке крови у С57Black и АпоE-/- мышей
Как правило, функция белков, лишенных структуры направлена на регуляцию различных каскадов реакций как внутри клетки, так и во внеклеточном матриксе, включая регуляцию транскрипции, трансляции, клеточного цикла, а также регуляцию процессов клеточной адгезии [107,108]. Длина неструктурированных областей в таких белках может быть разной, от нескольких аминокислотных остатков до целого белка. Преимущество таких белков заключается в том, что они способны связываться с другими молекулами с высокой специфичностью, но с низкой аффинностью. Отсутствие структуры также позволяет быстро связываться с различными по структурам мишенями и при этом сохранять максимальную площадь взаимодействия. Есть предположение, что такие белки большую часть времени проводят в комплексе с партнёром по взаимодействию, удаление которого ведет к быстрой деградации неструктурированного белка [105,109].
В нашем исследовании мы показали, что нативно-неструктурирлованные участки белковой цепи SDC1 предопределяют его пластичность и полифункцианальность, как в норме, так и при развитии хронического заболевания, например, как атеросклероз. Согласно нашим измерениям, у AпoЕ/- мышей накапливается большое количество холестерина, что приводит к гиперхолестеринемии, но при этом уровень ТГЛ остается в пределах нормы, что является само по себе парадоксальным. При создании мышиной модели атеросклероза в первую очередь основывались на данных, что высокий уровень холестерина коррелирует с риском развития атеросклероза. Источником накопления такого холестерина в организме могут быть как липопротеины с высоким содержанием ТГЛ и ЛНП. Повышению холестерина может также способствовать нарушение количественного баланса между ЛНП и ЛВП. Следуя перечисленным принципам, в лаборатории Н. Маеда в 1991 были разработаны три мышиные модели, в кровеносной системе которых предполагалось накопление холестерина [110]. Так, наряду с АпоЕ нокутом, было создано еще две модели АпоВ и АпоА1 нокауты. Данные липопротеины были выбраны по следующим соображениям:
АпоВ - основной апобелок ЛНП, отвечающий за связывание с рецепторами ЛНП. предполагалось, что в его отсутствие ЛНП будут накапливаться и как следствие повышаться уровень холестерина;
АпоА1 - один из основных компонентов ЛВП и как результат, ожидалось, что в его отсутствие значительно уменьшится уровень ЛВП и нарушится важное соотношение ЛНП/ЛВП.
АпоЕ белок рассматривался, как основной для утилизации липопротеинов богатых ТГЛ, таких как ЛОНП и хиломикрон. Поэтому выключение гена ароЕ предвещало накопление ТГЛ, и как результат накопление холестерина.
Из полученных трех линий мышей только выключение гена ароЕ привело к ожидаемым результатам, так как у этих мышей успешно развивалась атеросклеротическая бляшка уже к 5 месяцам. Что касается остальных моделей, то результаты получились совершенно противоположными, так и у АпоВ"7уровень ЛНП уменьшился, а соответственно и уровень холестерина, а у мышей АпоА17" мышей уровень холестерина не изменился, по сравнению с диким типом. На момент создания этих моделей не было исследовано, что SDC1 выполняет функцию рецептора по поглощению липопротеинов богатых ТГЛ. Все известные на тот момент рецепторы связывались с липопротеинами, богатыми ТГЛ исключительно через лиганд АроЕ. Возможно, поэтому во многих статьях ссылаются на высокий уровень ТГЛ у АпоЕ"7" мышей. Между тем авторы работ утверждающие, что у АпоЕ"7" мышей высокий уровень триглицеридов, как правило, предоставляют данные с показателями уровня ТРГ в верхнем диапазоне пределов нормы [10-12]. По нашему предположению, наиболее вероятным объяснением феномена низкого уровня триглицеридов в отсутствии основного лиганда АпоЕ для липопротеиновых рецепторов гепатоцитов, заключается в утилизации липопротеинов богатых ТГЛ за счет их связывания с SDC1 (рис.25). Рис. 25. Схематическое изображение обмена липидов у м АпоЕ-/- мышей.
В то же время, накопление ЛНП, а соответственно и холестерина может происходить из-за нарушения обратного захвата холестерина. Известно, что обратный захват холестерина осуществляют ЛВП, которые у мышей в отсутствии АпоЕ сильно деформируются и теряют способность выполнять свои основные функции [75]. И как уже было описано выше, в организме мыши ЛВП представляют собой маленькие сферические частицы размером порядка 8-12 нм, в состав которых входят белки АпоЕ, АпоА1 и АпоС. ЛВП в организме человека содержат дополнительно белки транспорта эфиров холестерина, которые при их переносе от ЛВП к ЛОНП могут захватывать ТГЛ и обеспечивать их обратный перенос к ЛВП. В связи с этим, в организме человека размер ЛВП сильно варьирует и, в зависимости от содержания ТГЛ, делятся на три группы ( 7.57; 7.57–8.22; 8.22 нм) [76]. Поэтому удаление белка АпоЕ у человека не так сильно отразиться на размере ЛВП, в отличие от мышей. Что еще раз подчеркивает необходимость аккуратно интерпретировать результаты, полученные на животных моделях болезней человека, которые зачастую не отражают полной картины развития патологии у человека, что делает сложным экстраполяцию полученных данных. На рисунке 25 мы представили схему обмена жиров у мышей при выключении гена ароЕ.
Наши результаты показали, что при низком уровне ТГЛ у АпоЕ-/- мышей, значительно увеличен уровень экспрессии гена sdc1 в гепатоцитах. И так, увеличение уровня экспрессии гена sdc1 в гепатоцитах носит компенсаторный характер, так как способствует удерживанию уровня ТГЛ в пределах нормы. Благодаря этому у АроЕ-/- мышей гипертриглицеридемия не развивается, что подтверждается полученными ранее данными - у SDC1-/- мышей, уровень ТГЛ увеличивается в два раза, по сравнению с диким типом [4]. Однако, проверка нашего предположения выходит за рамки данной работы, поэтому будет проведена в скором будущем. Как уже было описано выше, в гепатоцитах экспрессируются гены sdc1, sdc2 и sdc 4, но только sdc1 может связывать ТГЛ и поглощать с помощью рафт-опосредованного эндоцитоза. И это несмотря на то, что уровень экспрессии гена sdc1 в гепатоцитах в четыре раза ниже, чем sdc4 и в полтора раза ниже, чем sdc2 [4]. На основании вышесказанного, можно выдвинуть гипотезу, что SDC1 способен связываться с другими апобелками не только за счет электростатических взаимодействий лигандов с цепями гликозаминогликанов, но и непосредственно с эктодоменом корового белка SDC1, который, как мы показали в данной работе, имеет большой процент участков в эктодомене, отвечающих за связывания с другими белками. Мы также предположили, что характер связи может иметь положительный кооперативный эффект. Т.е. по мере присоединения одного лиганда, неструктурированный эктодомен SDC1 будет приобретать конформацию со множественными сайтами связывания, при этом аффинность к данному лиганду будет значительно увеличивается. Соответственно, конформация и аффинность сайта связывания эктодомена будет сильно зависеть от присоединенного апобелка. Также, можно предположить, что внешние домены SDC1, после взаимодействия с липопротеинами богатыми ТГЛ приобретают определенную устойчивую структуру, которая способствует активации экзоцитоза. Между тем, преобразования структуры SDC2 и SDC4 после взаимодействия с липопротеиновыми частицами недостаточно для формирования комплекса рецептора с лигандом, обеспечивающего проведению трансмембранного сигнала для активации эндоцитоза. Функция цепей гликозаминогликанов, как было упомянуто выше, возможно, заключается только в удержании лиганда в необходимой близости от эктодомена SDC1. После связывания с лигандом и перестроения пространственной структуры внешнего домена, происходит преобразование внешних сигналов во внутриклеточные. Для ответа на внешние сигналы клетка также использует активацию рецепторов через активацию цитоплазматических доменов синедканов. В случае рафт-опосредованного эндоцитоза SDC1 кластеризуются на мембранах благодаря образованию гетеродимеров с другими рецепторами. Как уже упоминалось выше, SDC1 больше способны формировать гетеродимеры с другими рецепторами, так как гомодимеры у них имеют слабые взаимодействия, в отличие от SDC2 и SDC4.
Результаты измерения биохимических параметров сыворотки крови исследуемых мышей
Парадигма, что функционально-активный белок в нативном состоянии может приобрести только одну структуру, которая обуславливается аминокислотной последовательностью безвозвратно ушла в прошлое. В естественных условиях, многие белки способны претерпевать значительные изменения в конформации и зачастую становиться частично или полностью развернутыми. Как уже говорилось выше, можно выделить две основные группы белков, обладающих структурным динамизмом - это нативно неструктурированные белки и метаморфические белки [80]. Если предсказание пространственной структуры последней группы можно осуществить на основе гомологии с помощью различных программ описанных выше, то для предсказания нативно-развернутых белков было разработано много других программ с совершенно разными алгоритмами расчетов. Для того, чтобы не использовать такой перечень программ, дополнительно были созданы мета-серверы, которые способны обрабатывать и оптимизировать полученные данные с помощью нескольких программ по предсказанию. Для предсказания неструктурированных участков белков семейства синдеканов нами было выбрано 2 программы IUPred и IsUnstruct, а также 2 мета-сервера PONDR-FIT и MetaDisorder. Программа IUPred предсказывает неструктурированые участки белка, основываясь на предварительно рассчитанной энергии контакта для каждого аминокислотного остатка. Основное предположение, заложенное в расчетах, состоит в том, что глобулярные белки состоят из аминокислот, которые имеют потенциал, чтобы сформировать большое количество контактов, тогда как внутренне неструктурированные белки не принимают стабильной структуры, не обладают таким потенциалом. [91].
Программа IsUnstruct, использовала совершенно новый подход определения неструктурированных аминокислотных остатков основываясь на методах статистической физики. В основу расчетов заложена модель Изинга, которая позволяет сделать расчёты параметров равновесия между различными возможными структурами для всех аминокислотных остатков [92]. Известно, что 70% пространственных структур из PDB банка содержат аминокислотные остатки, которые не формировали структуры и поэтому не были определены методом рентгеноструктурного анализа. При этом около 25% имеют продолжительность больше чем 10 аминокислотных остатков, что позволяет их отнести к нативно-неструктурированным участкам белков и быть использованными в качестве шаблона для предсказания других белков [93]. Для создания базы шаблонов рассматривались все белковые структуры, полученные методом рентгеноструктурного анализа, с разрешением лучше 3, опубликованные до 20-12-2012 [94]. Из базы данных PDB расчитывается вероятность нахождения остатка, который может быть в двух состояниях: структурированном и неструктурированном. Это состояние будет определяться взаимодействием с аминокислотными остатками, расположенными рядом, что делает предсказания более точными. Рассчитанная энергия полностью структурированного состояния была взята за ноль [94].
Программа PONDR-FIT, как мета-сервер, была разработана для проверки достоверности, усредняя предсказания неструктурированных участков белка шестью программами, такими как PONDR: VLXT, VSL2, VL3, а также FoldIndex, IUPred и TOPIDP [95,96]. Аккуратность предсказания PONDR-FIT выше по сравнению с каждым сервером отдельно. Это связано с тем, что программа позволяет интегрировать и оптимизировать результаты 6 программ, расчеты которых базировались на разных свойствах аминокислотных последовательностей. [97]. Программа MetaDisorder, также представляет собой мета-сервер, на котором обрабатываются и оптимизируются предсказания 13 серверов по предсказанию неструктурированных участков белка: DisEMBL, DISOPRED2, DISpro, Globplot, iPDA, IUPred, Pdisorder, Poodle-s, Poodle-l, PrDOS, Spritz, DisPSSMP, and RONN. Программа была высоко оценена сообществом ученых CASP9 [98].
Следует подчеркнуть, что несмотря на такое большое количество разработанных программ по предсказанию структуры белка, их точность не превышает 80%. Так как представляется затруднительным сравнить качество предсказаний такого большого количества программ, использующих совершенно разные алгоритмы расчетов, для оценки их точности была создана база данных DisProt (http://www.disprot.org/), где собраны экспериментально подтвержденные неструктурированные участки в белках. С помощью этого ресурса можно проверить точность предсказания той или иной программы. И тем не менее, для более точного предсказания важно использовать несколько программ в основе которых заложены принципиально разные подходы [99].