Содержание к диссертации
Введение
2 Обзор литературы
2.1 Характеристика возбудителя инфекционного некроза гемопоэтической ткани лососевых 12
2.2 Эпизоотологические особенности и ситуация по ИНГТ лососевых в России и в мире 18
2.3 Патогенез, клинические признаки и патологоанатомические изменения при ИНГТ 20
2.4 Лабораторная диагностика ИНГТ
2.4.1 Выделение вируса в культуре клеток 23
2.4.2 Реакция иммунофлуоресценции 23
2.4.3 Иммуноферментный анализ 24
2.4.4 Обратная транскрипция-полимеразная цепная реакция
2.5 Реакция агглютинации латекса как метод диагностики вирусных болезней 28
2.6 Заключение по обзору литературы 38
3 Собственные исследования 40
3.1 Материалы и методы 40
3.2 Результаты собственных исследований 55
3.2.1 Поиск оптимальных условий для получения культурального антигена вируса ИНГТ 56
3.2.2 Получение и характеристика моноклональных антител к антигенам вируса ИНГТ 60
3.2.3 Разработка реакции агглютинации латекса для выявления вируса ИНГТ 65
3.2.4 Разработка метода ОТ-ПЦР-РВ с применением диагностических ПЦР-чипов для выявления вирусов ИНГТ, ВГС и ВВК 90
3.3 Обсуждение результатов 98
4 Заключение 110
5 Список сокращений 112
6 Список литературы 114
7 Список иллюстрированного материала
- Патогенез, клинические признаки и патологоанатомические изменения при ИНГТ
- Обратная транскрипция-полимеразная цепная реакция
- Поиск оптимальных условий для получения культурального антигена вируса ИНГТ
- Разработка метода ОТ-ПЦР-РВ с применением диагностических ПЦР-чипов для выявления вирусов ИНГТ, ВГС и ВВК
Введение к работе
1.1 Актуальность темы исследования. Инфекционный некроз гемопоэтической ткани (ИНГТ) – высококонтагиозное вирусное заболевание лососевых рыб, которое встречается как в пресноводной, так и в морской аквакультуре [27]. Болезнь протекает по типу эпизоотии, характеризуется развитием септического процесса с тяжелым поражением органов гемопоэза и приводит к массовой гибели рыбы (смертность молоди приближается к 100%) [11, 27]. Распространение вируса наносит значительный экономический ущерб, который складывается из затрат на проведение ветеринарно-санитарных и карантинных мероприятий, убоя всей рыбы на территории очага болезни и ограничений в торговле [22, 27]. В связи с большим количеством рыбопосадочного материала, поставляемого из стран, неблагополучных по вирусным болезням рыб (США, Канада, страны Скандинавского п-ва и Ю-В Азии), возрастает актуальность проведения экспрессных диагностических исследований в рамках мониторинга по вирусным заболеваниям аквакультуры, в частности по ИНГТ [22].
Возбудитель принадлежит к порядку Mononegavirales, семейству
Rhabdoviridae, роду Novirhabdovirus. Геном представлен несегментированной одноцепочечной негативной РНК длиной около 11000 нуклеотидов и кодирует N-, P-, M-, G-, NV- и L-белки [22, 24].
Впервые заболевание было зарегистрировано в 1953 г. на рыбозаводах США, а затем в Канаде и на Аляске. В семидесятые годы болезнь появилась в Западной Европе, Юго-Восточной Азии и Японии. В Российской Федерации вспышки ИНГТ регистрируют с 2000 г. [8, 12, 13, 22, 27]. По данным Всемирной Организации здравоохранения животных (МЭБ, OIE), в течение последних 15 лет в различных странах мира было зарегистрировано около 100 вспышек ИНГТ. Данная инфекция включена в список заболеваний, обязательно декларируемых в OIE [22]. В настоящее время Приказом Минсельхоза РФ № 476 от 19.12.2011 г. ИНГТ отнесен к перечню заразных и особо опасных болезней, по которым устанавливается карантин, что предусматривает проведение масштабного эпизоотологического мониторинга данного заболевания [9].
По руководству OIE, лабораторная диагностика ИНГТ предусматривает выделение вируса в чувствительных клеточных линиях, серологическую идентификацию вируса с помощью ИФА и РИФ, а также выявление РНК вируса ИНГТ в ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР-РВ [22]. Применение этих методов предполагает высокие требования к лабораторному персоналу, закупку зарубежных коммерческих наборов и оборудования, что существенным образом отражается на стоимости анализов и делает отечественное рыбоводство зависимым от импортных поставок.
В связи с этим разработка экспресс-методов для дополнения существующей схемы диагностики ИНГТ на основе высокочувствительных и специфичных тест-систем, позволяющих упрощать проведение анализа, является актуальной задачей. К одним из таких методов относится реакция агглютинации латекса (РАЛ), используемая для диагностики бешенства, герпеса, сальмонеллеза, листериоза, микоплазмоза и других инфекционных заболеваний. Метод является бесприборным, экспрессным и простым в исполнении, достаточно чувствительным и специфичным. Стоимость исследования значительно ниже по сравнению с другими диагностическими тестами. Учитывая эти преимущества перед другими методами, РАЛ может найти применение в лабораториях рыбохозяйств для проведения скрининговых исследований.
Использование формата реакции ОТ-ПЦР-РВ для одновременного выявления в патологическом материале нескольких возбудителей с применением ПЦР-чипов позволит создать диагностическую тест-систему нового поколения с высокой аналитической и диагностической чувствительностью и специфичностью. За счет снижения количества манипуляций в пределах каждого этапа анализа по сравнению с классическим вариантом ОТ-ПЦР, совмещения в микрореакторе чипа обратной транскрипции и ПЦР и оптимизации режима термоциклирования сократится время проведения анализа.
Таким образом, применение РАЛ и метода ОТ-ПЦР-РВ с использованием диагностических ПЦР-чипов для проведения скрининговых исследований на ИНГТ даст возможность выявлять возбудителя на ранних стадиях заболевания. Следовательно, разработка экспресс-методов выявления вируса ИНГТ лососевых рыб для дополнения существующей схемы диагностики является актуальной.
1.2 Степень разработанности проблемы. Для изучения структуры и свойств возбудителя ИНГТ были исследованы различные изоляты вируса, выделенные на территории Северной Америки, Европы и Азии. На основе анализа отличий генов N и G были определены 5 генетических групп вируса ИНГТ [17]. Применяя моноклональные антитела к гликопротеину и нуклеопротеину вируса ИНГТ была проведена серологическая дифференциация его штаммов [16, 26]. Изучена цитоморфологическая характеристика культур клеток рыб и изучена их чувствительность к некоторым вирусам лососевых [4, 12]. Изоляты вируса были адаптированы к различным клеточным линиям рыб (ЕРС, RTG-2, ВF-2 и др.) [2, 4, 22].
Были разработаны разные варианты ОТ-ПЦР для выявления вируса ИНГТ. Предложены системы ОТ-ПЦР в режиме реального времени для обнаружения вируса ИНГТ [5, 12, 23, 25]. Разработаны системы мультиплекс-ПЦР [28] и мультиплекс-
ПЦР-РВ с целью выявления вирусов ИНГТ, ВГС и ИНПЖ [15, 20]. ОТ-ПЦР-РВ возможно проводить не только в пробирке, но и в микрореакторах чипа, на гидрофильном дне которых адсорбирована смесь компонентов для одновременного проведения обратной транскрипции и ПЦР, что позволяет при оптимизации режима термоциклирования сокращать время проведения анализа. В нашей стране в таком формате разработаны коммерческие тест-системы, позволяющие выявлять возбудителей некоторых вирусных и бактериальных болезней птиц и КРС [29]. Сведения о разработке метода ОТ-ПЦР-РВ с применением диагностических ПЦР-чипов для выявления вируса ИНГТ отсутствуют.
Экспресс-метод для выявления антигенов вирусов, бактерий и других патогенных микроорганизмов, который основан на агглютинации сферических частиц латекса, сенсибилизированных специфичными антителами, находит применение как в медицинской, так и ветеринарной практике. Широкий спектр тестов латексной агглютинации для нужд ветеринарии производят предприятия «Microgen Bioproducts» (Великобритания), «БиоВитрум» (РФ) и др. В ФГБУ «ВНИИЗЖ» (г. Владимир) были синтезировали латексные препараты для диагностики различных вирусных болезней животных, в частности бешенства, микоплазмозов птиц и др. [3, 6]. Сведения о разработке РАЛ для выявления вируса ИНГТ отсутствуют.
1.3 Цели и задачи исследований. Основная цель данных исследований
заключалась в разработке экспресс-методов, позволяющих выявлять вирус ИНГТ в
патологическом материале рыб. Для достижения поставленной цели необходимо
было решить следующие задачи:
а) подобрать оптимальные условия для получения культурального антигена
вируса ИНГТ;
б) получить поликлональные и моноклональные антитела к антигенам вируса
ИНГТ и дать им характеристику;
в) оптимизировать параметры получения латексных диагностикумов и
разработать экспресс-метод РАЛ для выявления вируса ИНГТ в патологическом
материале лососевых рыб с использованием поликлональных и моноклональных
антител;
г) разработать экспресс-метод ОТ-ПЦР-РВ с применением диагностических
ПЦР-чипов для выявления вируса ИНГТ;
д) провести апробацию разработанных методов при диагностических
исследованиях полевого материала в рамках мониторинга в ряде регионов РФ
в 2014-2015 гг.
1.4 Научная новизна результатов исследований. Подобраны оптимальные
условия для получения культурального антигена вируса ИНГТ. Предложена методика
по вирусвыделению из патологического материала рыб одновременно в нескольких чувствительных культурах клеток с определением титра накопления вируса. Определены оптимальные параметры получения латексных препаратов и впервые разработан экспресс-метод РАЛ для выявления вируса ИНГТ в патологическом материале лососевых рыб с использованием поликлональных и моноклональных антител. Впервые разработан экспресс-метод ОТ-ПЦР-РВ в формате диагностических ПЦР-чипов для выявления вирусов ИНГТ, вирусной геморрагической септицемии (ВГС) и весенней виремии карпа (ВВК) в пробах патологического материала рыб. Проведена апробация разработанных методов РАЛ и ОТ-ПЦР-РВ с применением диагностических ПЦР-чипов при диагностических исследованиях полевого материала на вирусные заболевания рыб в рамках мониторинга в ряде регионов РФ в 2014-2015 гг.
1.5 Теоретическая и практическая значимость работы. Изучены культуральные свойства штамма «Аркус 32/87» и изолята «Воронин 14/08» вируса ИНГТ. Определена оптимальная инфицирующая доза вируса ИНГТ и выбрана наиболее подходящая клеточная линия для его культивирования. Оценена эффективность культивирования вируса в клеточной линии гонад радужной форели (RTG-2) в зависимости от его пассажного уровня и концентрации фетальной сыворотки КРС в поддерживающей среде. Культуральный антиген вируса ИНГТ с высоким титром накопления получали на основе штамма «Аркус 32/87», который использовали для получения вирусспецифичных сывороток и моноклональных антител.
Получены 18 гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к антигенам вируса ИНГТ. Проведена оценка чувствительности и специфичности связывания полученных антител с белками вируса ИНГТ в ИФА и вестерн-блот-анализе. Для разработки диагностических тест-систем использовали моноклональные антитела, специфичные к G- и N-белкам вируса ИНГТ, с активностью в двойном сэндвич-варианте ИФА 1:192000 и 1:384000, соответственно.
Определены оптимальные условия синтеза и хранения латексных диагностикумов с разными функциональными группами в процессе физической и химической адсорбции антител, специфичных к вирусу ИНГТ. Разработан экспресс-метод РАЛ (реакция агглютинация латекса) для выявления вируса ИНГТ с использованием полученных моноклональных и поликлональных антител. Оценены диагностические характеристики полученных латексных препаратов.
Разработан экспресс-метод ОТ-ПЦР-РВ с применением диагностических ПЦР-чипов для выявления вирусов рыб. Предложены оригинальные системы праймеров и зонды, а также оптимизированы режимы термоциклирования для каждой тест-
системы. Разработаны тест-системы с высокими показателями эффективности амплификации, аналитической и диагностической чувствительности и специфичности.
Разработаны «Методические рекомендации по вирусвыделению из патологического материала рыб на культуре клеток» (утверждены в ФГБУ «ВНИИЗЖ» 20 декабря 2013 г.), «Методические рекомендации по выявлению вируса инфекционного некроза гемопоэтической ткани лососевых в реакции агглютинации латекса» (утверждены в ФГБУ «ВНИИЗЖ» 17 июня 2015 г.), «Методические рекомендации по выявлению вирусов рыб в обратно транскриптазной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ОТ-ПЦР-РВ) с применением диагностических ПЦР-чипов» (утверждены в ФГБУ «ВНИИЗЖ» 09 октября 2015 г.).
Проведено депонирование использованных в работе штамма вируса ВГС «Аланд» и штамма вируса ВВК «Яяла» в КШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ» (справка о депонировании штамма вируса геморрагической септицемии (ВГС) лососевых рыб «Аланд» (диагностический) № 41/15 – 3 от 08.04.2015 г.; справка о депонировании штамма вируса весенней виремии карпа (ВВК) «Яяла» (диагностический) № 45/15 – 9 от 05.08.2015 г.).
Разработанные методы применяются в ФГБУ «ВНИИЗЖ».
1.6 Методология и методы исследования. Методология проведенных
исследований включает стандартные процедуры с использованием различных
материалов и естественно восприимчивых животных. В работе использовали
молекулярно-биологические (ПЦР, секвенирование, анализ нуклеотидных
последовательностей), вирусологические (вирусвыделение, культивирование вируса)
и серологические (ИФА, РИФ, РАЛ) методы исследований.
1.7 Положения, выносимые на защиту:
а) метод вирусвыделения из патологического материала рыб одновременно в
клеточных линиях RTG-2, EPC, FHM с определением титра накопления вируса;
оптимальные условия для получения культурального антигена вируса ИНГТ;
б) получение 18 гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к
антигенам вируса ИНГТ, и их характеристика для разработки диагностических тест-
систем;
в) тест-системы на основе экспресс-метода РАЛ для выявления вируса ИНГТ
лососевых с применением поликлональных и моноклональных антител;
г) экспресс-метод ОТ-ПЦР-РВ с применением диагностических ПЦР-чипов для
выявления вирусов рыб;
д) результаты апробации разработанных методов при диагностических
исследованиях полевого материала из ряда регионов РФ в 2014-2015 гг.
1.8 Личный вклад автора. Диссертационная работа выполнена автором
самостоятельно. Автор выражает искреннюю благодарность сотрудникам ФГБУН
Института биоорганической химии им. Академиков М.М. Шемякина и Ю.А.
Овчинникова РАН (г. Москва), ООО «Люмэкс-Маркетинг» (г. С.-Петербург):
к.б.н. Ф.А. Бровко, к.б.н. М.М. Никитину и ФГБУ «ВНИИЗЖ»: к.в.н. А.А. Пичуевой и
др. сотрудникам реф. лаб. болезней аквакультуры, к.б.н., ст.н.с. Гос НИИОРХ А.В.
Лысанову за помощь в проведении отдельных этапов работы; д.б.н.,
г.н.с. Н.С. Мудрак, к.б.н. Д.Б. Андрейчуку, к.б.н. Назарову Н.А. за консультативную
помощь; д.б.н., проф. С.С. Рыбакову за содействие в выполнении работы. Автор
выражает признательность в.н.с. реф. лаб. болезней аквакультуры, к.в.н. Д.К.
Павлову.
-
Степень достоверности и апробация результатов. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях ученого совета ФГБУ «ВНИИЗЖ», на 18-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых: «Биология – наука XXI века» (г. Пущино, 2014 г.), 10-ой Молодежной международной научно-практической конференции: «Наука XXI века: новый подход» (г. Санкт-Петербург, 2014 г.), Международной научно-практической конференции «Инновационный вектор развития в условиях риска и неопределенности: новые задачи и пути их решения в экономике, экологии, зоологии, химии, биологии и др.» (г. Санкт-Петербург, 2015 г.), III Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы и перспективы развития современной науки: социально-экономические, естественно-научные исследования и технический прогресс» (г. Ростов-на-Дону, 2015 г.), VIII Всероссийской научно-практической конференции "Тенденции развития естественных и гуманитарных наук" (г. Ростов-на-Дону, 2015 г.). Достоверность результатов исследований подтверждена комиссионными испытаниями.
-
Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 8 научных работ, в том числе 2 статьи в изданиях по Перечню ВАК Министерства образования и науки РФ для докторских и кандидатских диссертаций.
1.11 Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 141
страницах компьютерного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор
литературы, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение,
выводы, практические предложения, приложения; иллюстрирована 30 таблицами и
13 рисунками. Список использованной литературы включает 164 источника, из них
112 иностранных. В приложении представлены копии титульных листов документов,
подтверждающих достоверность результатов работы, ее научную новизну и
практическую значимость.
Патогенез, клинические признаки и патологоанатомические изменения при ИНГТ
Механизм и пути передачи возбудителя. Заражение происходит при контакте рыбы с возбудителем ИНГТ в результате взаимодействия здоровых и больных рыб или при нахождении здоровой рыбы в воде, содержащей вирусные частицы. Инфицированная рыба выделяет вирус с мочой и слизью, с половыми продуктами, через жабры и кожу. Возбудитель передается через воду, ил и рыбоводный инвентарь. Возможен оральный путь передачи при каннибализме, скармливании внутренностей инфицированных рыб. Молодь заражается при передаче вируса от родителей своему потомству через икру, а также от возвратившихся из моря производителей, переболевших ИНГТ [1, 41, 126].
Эпизоотии ИНГТ обычно имеют два пика: весенний (конец зимы — начало лета) и реже — осенний (конец лета и осень), но при 8-17 С могут наблюдаться в любое время года. Наиболее остро болезнь протекает при 10-12 С, что приводит к гибели 80—100 % молоди. Если не принимать экстренных мер, то в течение одного месяца погибают более 90% сеголеток. Рыбы старшего возраста (годовики и двухлетки), как правило, болеют реже и легче. Возможна также циркуляция вируса в популяции рыб без возникновения вспышки ИНГТ.
Основные пути распространения ИНГТ - бесконтрольные перевозки больных рыб и оплодотворенной икры из неблагополучных по ИНГТ водоемов или хозяйств в благополучные зоны. Обострению течения болезни способствует совместное выращивание в одном водоеме или бассейне здоровых и больных рыб и содержание рыб разных возрастных групп. Перенос вируса в благополучный водоем может произойти вследствие захода в них рыб-вирусоносителей при отсутствии заградительных сооружений на магистральных каналах водоисточника [12, 122].
Источники и резервуары. Основными хозяевами вируса ИНГТ являются представители семейства лососевых рыб (сем. Salmonidae). К видам, восприимчивым к данному вирусу в естественных условиях, относятся: радужная форель (Oncorhynchus mykiss), кижуч (Oncorhynchus tshawytscha), нерка (Oncorhynchus nerka), кета (Oncorhynchus keta) и атлантический лосось (Salmo salar). Представители других семейств, например сельдь (Clupea pallasi), треска (Gadus morhua), осетр (Acipenser transmontanus) также могут быть инфицированы вирусом ИНГТ в дикой природе [125]. При этом у самок накопление вируса обычно выше, чем у самцов [122]. После эпизоотии часть переболевших или устойчивых к заболеванию рыб становятся вирусоносителями, которые формируют естественный резервуар данной инфекции. В качестве вирусоносителей могут также служить карп Кои и желтый окунь [129]. В аквакультуре источником вируса служит также погибшая от ИНГТ рыба [1, 21].
Экономический ущерб. Страны неблагополучные по ИНГТ несут значительный экономический ущерб, который складывается из потерь от гибели рыбы, затрат на проведение карантинных мероприятий, уничтожение больных и подозреваемых в заражении ИНГТ рыб, а так же затрат на проведение диагностических исследований в рамках мониторинга [39].
Ситуация по ИНГТ в России и в мире. Вирус ИНГТ распространен по всему миру [162]. Впервые заболевание было зарегистрировано в 1953 г. в США, на рыбозаводах штатов Вашингтон и Орегон, расположенных в бассейнах рек Тихого океана, а затем в Канаде и на Аляске. В семидесятые годы болезнь появилась в Западной Европе, Юго-Восточной Азии и Японии. С 1987 года встречается во Франции, Италии, Германии. По данным Всемирной Организации здоровья животных (OIE, МЭБ), в течение последних 15 лет было зарегистрировано около 100 вспышек ИНГТ в различных странах мира [4, 125, 143]. В Российской Федерации вспышки данного заболевания зафиксированы в 2000 - 2009 гг. [11, 34, 125, 141]. В 2000 г. в экспериментальном форелевом хозяйстве п. Рыбное Московской области у молоди радужной форели впервые возникла эпизоотия ИНГТ. Вирус был занесен в хозяйство с икрой неизвестного происхождения. В 2001 г. вирус регулярно выявляли у тихоокеанских лососевых рыб, заходивших на нерест в реки Камчатки [149]. В 2004 г. вирус ИНГТ обнаружили в ООО "Селекцентр" в г. Удомля Тверской области. Не исключена циркуляция вируса ИНГТ на Сахалине и Дальнем Востоке. В Сибири эпизоотическая ситуация неизвестна [49, 52, 150, 163]. В настоящее время приказом Министерства сельского хозяйства РФ ИНГТ отнесен к особо опасным болезням, что предусматривает масштабный контроль данного заболевания, важным звеном которого является эпизоотологический мониторинг [39].
Патогенез. Проникновение вируса ИНГТ в организм рыбы происходит через жабры, либо при попадании на повреждённую кожу или слизистые оболочки. Возможен алиментарный путь заражения при каннибализме. В месте внедрения в организм вирус находится от нескольких часов до нескольких дней. Затем во время диссеминации он продвигается по нервному, гематогенному и лимфатическому путям, проникает в центральную нервную систему, органы гемопоэза, почки, сердце, где происходит размножение и накопление вируса. Далее вирус начинает распространяться по всему организму рыбы [132].
Клинические признаки. Заболевание, вызванное вирусом ИНГТ, носит системный характер, проявляется в форме экссудативно-геморрагического синдрома, развитие которого обусловлено размножением вируса в соединительной, гемопоэтической ткани и клетках экскреторной части почек, что ведет к нарушению водно-минерального баланса, выходу плазмы и клеток крови в окружающие ткани и полости тела. Первыми признаками заболевания являются анорексия, угнетенное состояние рыб, утрата реакции на внешние раздражители. У больных рыб отмечают экзофтальм, побледнение жабр, точечные кровоизлияния в периокулярной соединительной ткани глаз и в межлучевой ткани оснований плавников. Из ануса отдельных больных рыб свисают длинные тяжи слизеподобной консистенции. У личинок наблюдаются множественные кровоизлияния в желточный мешок и гидроцефалия в виде припухлости на голове. Хроническая форма течения болезни характеризуется менее выраженными клиническими признаками [12, 104, 109, 124, 125, 161].
Патологоанатомические изменения. При вскрытии больной рыбы в полости тела обнаруживают скопление желтоватого экссудата, множественные кровоизлияния в перивисцеральной жировой ткани, на брюшине, стенках кишечника и плавательного пузыря. Желудочно-кишечный тракт свободен от пищи, иногда наполнен слизеподобным содержимым молочно-белого цвета. При гистологическом исследовании в ацитарных клетках поджелудочной железы находят тельца-включения. В почках регистрируют некротические фокусы и кровоизлияния. Селезенка бледная, в печени иногда выявляют некротические участки [1, 21].
Обратная транскрипция-полимеразная цепная реакция
Таким образом, степень физической адсорбции белка зависит от его концентрации, ионной силы и показателя кислотности буферного раствора, в котором находятся латексные частицы. Физическая адсорбция возможна благодаря формированию гидрофобных, кулоновских и водородных связей между белком и поверхностью микросфер.
Химическая адсорбция. Сенсибилизация латексных частиц биолигандом возможна не только в процессе физической адсорбции, но и благодаря ковалентному связыванию [119]. Химическая адсорбция имеет ряд преимуществ по сравнению с физическим связыванием. При ковалентном присоединении в большей степени сохраняется правильная пространственная организация белка, благодаря чему биологическая активность латексных препаратов выше. Химическая адсорбция позволяет снижать вероятность спонтанной агглютинации, так как все ионогенные группы латексов взаимодействуют с функциональными группами белка. В процессе физической адсорбции между белком и гидрофобной поверхностью латекса формируются слабые Ван-дер-Ваальсовые взаимодействия, что обуславливает склонность комплекса «латекс-белок» к десорбции. При химической адсорбции устанавливаются более сильные ковалентные связи, снижая вероятность десорбции. Считается, что латексные препараты, полученные благодаря ковалентному связыванию белка, характеризуются более высокой степенью адсорбции и имеют продолжительный срок хранения [74, 131, 150, 156]. Таким образом, по сравнению с физической адсорбцией ковалентное присоединение биолиганда к твердофазному носителю надежнее за счет более высокой специфической адсорбции, что позволяет повысить чувствительность и специфичность латексных препаратов. Химическая адсорбция является сложной, т.к. предусматривает применение широкого спектра химических «сшивок» [71, 82]. Существует много способов химической адсорбции биолиганда на поверхности латекса. Теоретически возможно связывание по всем функциональным группам белка, что часто применяется при синтезе разнообразных конъюгатов [32]. В литературе, посвящённой вопросам адсорбции иммунобиологических лигандов, описаны разные приёмы их физико-химического связывания с активными группами на поверхности латексных частиц [30].
1. Связывание по СООН группе латексных частиц и -NH2 группе белка. Наибольшее количество исследований было проведено с применением карбоксилированных латексов. При их смешивании с карбоимидами образуется промежуточное соединение, которое взаимодействует с -NH2 группами белковой молекулы, что способствует формированию пептидной связи между аминогруппой белка и карбоксильной группы микросфер. Преимуществом данной реакции является хорошая воспроизводимость и устойчивость синтезируемого латекса. Но при этом промежуточное соединение является относительно неустойчивым, что может привести к возникновению побочных реакций [118].
2. Связывание по концевым –NН2 группам латексных частиц и белка. Реакцию конденсации проводят с применением глутарового альдегида H H , позволяющего связывать –COH группы модификатора и –NH2 группы белка и микросфер с образованием основания Шиффа. Это альдегидный тип связывания, при котором отмечается хорошая воспроизводимость данной реакции, но при этом имеется ряд недостатков: в обычных условия может происходить окисление и полимеризация альдегидной группы; основания Шиффа не являются стабильными соединениями, что может вызывать побочные реакции [71].
3. Связывание по ОН группе латексных частиц и -NH2 группе белка. Процесс химической адсорбции белка на поверхности гидроксилированных латексов осуществляется с использованием цианобромида. Реакцию рекомендуется проводить в среде со щелочной реакцией, которая препятствует протонированию –NH2 группы и способствует образованию комплекса «латекс– O–C(NH2)–NH–белок». Недостатком данного метода является опасность работы с цианобромидом, применяемым в качестве модификатора, и побочными продуктами реакции [118].
4. Связывание по –SH группам латексных частиц и белка. Катионы тяжелых металлов с валентностью II (ртути, меди, свинца и других металлов) интенсивно реагируют с меркаптогруппами белка и латексов по типу нуклеофильного замещения, образуя металлоорганические латексные препараты состава «латекс–S–Me–S–белок». Однако при этом высока вероятность образования ионных связей между катионом металла и –SH группами латексных частиц, что может снизить степень адсорбции биолиганда [83].
Для увеличения степени и силы адсорбции белка на поверхности латекса применяют различные компоненты, необходимые для «сшивания» частицы и биолиганда. Так, повысить адсорбционную способность латексов возможно, применяя белок A, который адсорбируется на поверхности микросфер и связывает Fc-фрагменты различных антител. За счет этого происходит присоединение IgG с ориентацией его Fab-фрагментов наружу, что позволяет получать латексные препараты с лучшими диагностическими показателями [119].
Таким образом, по сравнению с физической адсорбцией ковалентное присоединение белка к поверхности латекса является более сложным многоступенчатым процессом. За счет использования широкого спектра функциональных групп и модификаторов существует множество вариантов химического связывания белковых молекул. Для каждого из них следует подбирать оптимальные условия адсорбции, которые позволяют повышать степень связывания белка и улучшать диагностические характеристики латексных препаратов.
Поиск оптимальных условий для получения культурального антигена вируса ИНГТ
Количественная чувствительность синтезированных препаратов была определена в соответствии с приведенной выше методикой (с. 69). Интенсивность агглютинации определяли, как описано на с. 53.
Результаты исследований приведены в таблице 14, из которой следует, что для всех исследованных латексов с разными ионогенными группами плато адсорбции достигалось в нейтральной среде. Наибольшее значение степени адсорбции IgG при рН 7,0 наблюдалось в ГСБР с низким значением ионной силы (5 ммоль/л). При росте ионной силы в нейтральной среде значения плато адсорбции антител уменьшались, и зависимость степени связывания IgG от показателя кислотности буферного раствора становилась менее выраженной.
Также была выявлена зависимость степени адсорбции антител против вируса ИНГТ на заряженной поверхности частиц с разными функциональными группами от ионной силы ГСБР в средах с кислой, нейтральной и щелочной реакциями. Данные таблицы 14 свидетельствуют о том, что в средах с кислой и щелочной реакциями при росте ионной силы ГСБР увеличивалась конформационная стабильность белка и степень его адсорбции. Наибольшая степень связывания IgG в этих средах достигалась при использовании буферного раствора с ионной силой 100 ммоль/л и более. При уменьшении концентрации хлористого натрия и глицина в этих условиях за счет ионизации концевых функциональных групп латекса поверхностный слой микросфер разрыхлялся, в результате этого снижались степень сенсибилизации частиц и аналитическая чувствительность полученных диагностикумов.
В нейтральной среде при увеличении ионной силы буферного раствора уменьшалась стабильность антител, ослабевали силы электростатического взаимодействия между IgG и поверхностью латекса, и тем самым снижалась степень адсорбции иммуноглобулинов G на поверхности частиц со всеми исследованными группами. При ионной силе 100 ммоль/л и более в нейтральной среде степень адсорбции белка была ниже 50%, и в этих условиях она практически не зависела от рН ГСБР. При снижении концентрации компонентов буферного раствора в среде с рН 7 наблюдался рост количества адсорбированных антител, который достигал своего предела при ионной силе 5 ммоль/л.
Таким образом, синтез латексных препаратов, выявляющих вирус ИНГТ, рекомендуется проводить в ГСБР с рН 7 и ионной силой 5 ммоль/л. В этих условиях достигали наиболее высоких значений степени адсорбции антител и лучшие показатели аналитической чувствительности и специфичности.
На следующем этапе работы проводили поиск оптимальных значений диаметра микросфер и концентрации активных групп на поверхности частиц для синтеза латексных препаратов, выявляющих вирус ИНГТ. Исследовали полистирольные микросферы с разными диаметрами: 340, 650, 740, 950 нм, поверхность которых сенсибилизировали поликлональными антителами с концентрацией 1 мг/мл. Синтез препаратов осуществляли с предложенной выше схемой.
Концентрацию неадсорбированных антител при использовании частиц латекса с указанными выше значениями диаметра микросфер определяли спектрофотометрическим методом при 280 нм и в ТФ непрямом варианте ИФА. Степень адсорбции антител рассчитывали по формуле 1 (с. 52). Количественная чувствительность синтезированных препаратов была определена в соответствии с приведенной выше методикой (с. 69). Интенсивность агглютинации определяли, как описано на с. 53.
Результаты исследований приведены в таблице 15, из которой следует, что наиболее высокие значения степени адсорбции антител наблюдались у латексов с меньшим диаметром микросфер. С ростом размера частиц количество адсорбированных IgG снижалось. Это объясняется тем, что при уменьшении диаметра микросфер коэффициент их поверхностно-массового отношения возрастал, тем самым, увеличивалась концентрация ионогенных групп и площадь гидрофобной поверхности частиц, что позволяло адсорбировать большее количество антител и получать латексные препараты с лучшими диагностическими характеристиками.
В данном случае наибольшая степень адсорбции антител и лучшие показатели аналитической чувствительности полученных препаратов достигались при использовании микросфер с диаметром 340 нм. Наибольшая степень адсорбции отмечалась у аминированных латексов (76,7%), а наименьшая – у сульфатированных частиц (66,7%). Вероятнее всего, это вызвано тем, что в молекулах IgG против вируса ИНГТ –COOH группы, формирующие с аминогруппами пептидные связи, количественно преобладают над группами – NH2.
Исследовали также латексы с диаметром микросфер менее 340 нм (250, 110, 90 нм). Предполагалось, что за счет большего поверхностно-массового отношения данные частицы будут адсорбировать более 66,7 – 76,7% антител, следовательно, препараты, полученные на их основе, проявят лучшие диагностические характеристики. Однако, работа с микросферами, имеющими диаметр менее 340 нм, была осложнена проблемным осаждением частиц и высокой вероятностью повреждения нативной структуры антител при высокоскоростном центрифугировании сенсибилизированных латексов.
Оценивали влияние концентрации активных групп латекса на диагностические характеристики полученных препаратов. Для исследования использовали микросферы с диаметром 340 нм и разными концентрациями поверхностных функциональных групп: 1,42, 1,70, 1,98 мкг-экв/м2. Получение диагностических суспензий проводили, как указано в главе «Материалы и методы». Степень адсорбции антител рассчитывали по формуле 1 (с. 52). Количественная чувствительность синтезированных препаратов была определена в соответствии с приведенной выше методикой (с. 69). Синтезированные препараты сравнивали по степени адсорбции антител против вируса ИНГТ и аналитической чувствительности и специфичности. Интенсивность агглютинации определяли, как описано на с. 53
Разработка метода ОТ-ПЦР-РВ с применением диагностических ПЦР-чипов для выявления вирусов ИНГТ, ВГС и ВВК
Одним из основных требований, предъявляемых к латексным диагностическим суспензиям, является их коллоидная стабильность, снижение которой может привести к возникновению спонтанной агглютинации и получению ложноположительных результатов [46, 47, 118]. Для длительного сохранения препаратов в электростатически устойчивом состоянии Peula, J.M., Puig, J. и др. предлагают проводить блокирование сайтов неспецифичного связывания на поверхности латекса [118, 131, 146]. Также повышать устойчивость латексных суспензий возможно за счет применения различных стабилизаторов [47, 69, 127]. По результатам проведенных нами исследований установлено, что с целью сохранения в течение 9 месяцев коллоидной стабильности и высоких диагностических показателей препаратов для выявления вируса ИНГТ, сенсибилизированные частицы оптимально хранить в ГСБР, содержащем модификатор (2-оксиэтил)-триметиламмония хлорид (50 мМ).
Таким образом, полученные тест-системы характеризовались высокими показателями аналитической и диагностической чувствительности и специфичности. Метод простой и быстрый в исполнении, не требует приборного обеспечения, поэтому может найти свое применение в лабораториях рыбоводческих хозяйств для проведения скрининговых исследований патматериала на ИНГТ. На основании полученных результатов были разработаны «Методические рекомендации по выявлению вируса инфекционного некроза гемопоэтической ткани лососевых в реакции агглютинации латекса» и утверждены директором ФГБУ «ВНИИЗЖ» (см. Приложение 2).
Актуальной в настоящее время является разработка молекулярно-биологических экспресс-методов диагностики вирусных болезней рыб. Существует большое количество публикаций, описывающих тест-системы на основе методов ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР-РВ для выявления вирусов ИНГТ, а также ВГС и ВВК [17, 54, 61, 66, 81, 85, 90, 117]. В литературе описано применение тест-систем для выявления РНК вирусов рыб на основе амплификации фрагментов N- и G-генов [17, 54, 64, 66, 72, 81, 86, 98, 107, 117]. В 90-е гг. XX в. впервые были созданы тест-системы на основе ОТ-ПЦР-РВ в формате чипов. На сегодняшний день в нашей стране ООО «Люмэкс-Маркетинг» разработаны тест-системы, позволяющие выявлять возбудителей различных вирусных и бактериальных болезней птиц и КРС (болезнь Ньюкасла, инфекционный бронхит кур; Chlamidophila abortus, Brucella spp., Leptospira interrogans, Ureaplasma diversum, Trichomonas foetus, Campylobacter fetus и др.).
В сотрудничестве с ООО «Люмэкс-Маркетинг» нами были проведены исследования по разработке метода ОТ-ПЦР-РВ с применением диагностических ПЦР-чипов для выявления вирусов ИНГТ, ВГС и ВВК. Подобраны системы праймеров и зонды (структура отражена в табл. 4) для амплификации фрагментов гена N ДНК данных вирусов. Проведен поиск оптимальных температурных условий и времени термоциклирования для осуществления всех этапов реакции. Учитывая результаты наших исследований, обратную транскрипцию было предложено проводить в течение 20 мин при 37 С, предварительный цикл амплификации - 2 мин при 94С. На каждом из 45 циклов амплификации для денатурации кДНК вирусов ИНГТ и ВГС достаточным было воздействие 94С в течение 3 секунд, а для отжига праймеров и элонгации - 60С в течение 20 секунд. Для денатурации кДНК вируса ВВК использовали 95С в течение 3 секунд, а для отжига праймеров и элонгации - 60С в течение 108 секунд. Результаты наших исследований согласуются с опубликованными данными, полученными при оценке тест-систем для выявления других антигенов [164].
Полученные тест-системы позволяли выявлять РНК вирусов ИНГТ, ВГС и ВВК с концентрацией 1,25 нг/мл с титром накопления 1,5 lg ТЦД50/см3. Эффективность амплификации полноразмерных фрагментов гена N вирусов ИНГТ, ВГС, ВВК составляла – 98,0-99,5%, что согласуется с литературными данными, опубликованными по результатам ОТ-ПЦР-РВ при исследовании патологического материала, содержащего вирус ИНГТ и другие рабдовирусы [57, 72, 110, 128, 135, 136].
С помощью разработанной тест-системы методом ОТ-ПЦР-РВ с применением диагностических ПЦР-чипов было исследовано по 500 проб патологического материала от лососевых и карповых рыб, не содержащих вирусов ИНГТ, ВГС, ВВК, по результатам вирусвыделения, ИФА и РИФ, по 50 проб, инфицированных вирусами ИНГТ, ВГС, ВВК. Учитывая результаты исследований, диагностическая чувствительность разработанных тест-систем составила 100 %, диагностическая специфичность – 99,6-99,8 %, что находит подтверждение в публикациях, повященных разработке метода ОТ-ПЦР-РВ для выявления РНК вируса ИНГТ и других рабдовирусов [57, 72, 110, 128, 135, 136].
Разработанные диагностические ПЦР-чипы были удобны в использовании, так как на дно микрореакторов заранее нанесена готовая смесь для реакции. При использовании полученных тест-систем значительно сокращается время проведения анализа за счет оптимизации режима термоциклирования и совмещения обратной транскрипции и ПЦР в одном микрореакторе. ОТ-ПЦР-РВ, который проводится в пробирке, дешевле по сравнению с чиповым форматом. Однако анализ с применением диагностических ПЦР-чипов экспресснее и позволяет проводить скрининговые исследования патматериала одновременно на несколько вирусных болезней рыб (ИНГТ, ВГС и ВВК). Амплификатор «АриаDNA» и ПЦР-чипы (ООО «Люмэкс-Маркетинг») отечественного производства, поэтому их стоимость дешевле по сравнению с зарубежными аналогами.
На основании полученных результатов были разработаны «Методические рекомендации по выявлению вирусов рыб в обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ОТ-ПЦР-РВ) с применением диагностических ПЦР-чипов» и утверждены директором ФГБУ «ВНИИЗЖ» (см. Приложение 3).
Для возможности использования в работе штаммов вирусов ВГС и ВВК в качестве положительных контролей и контролей на специфичность проведена работа по их депонированию в Коллекцию штаммов микроорганизмов ФГБУ «ВНИИЗЖ» (см. Приложения 4 и 5).