Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 13
1.1. История и опыт применения МСК 13
1.2. Характеристика МСК 15
1.2.1. Оценка характеристик МСК 15
1.2.2 Клоногенность 16
1.2.3. Мультипотентность 17
1.2.4. Самообновление в культуре 18
1.2.3. Фенотипирование МСК 18
1.3 Свойства МСК 20
1.3.1 Противовоспалительные и иммуномодулирующие свойства 20
1.3.2 Выделение трофических факторов 22
1.4. МСК и опухоль 23
1.4.1. Онкогенные свойства МСК. 24
1.4.2. Противоопухолевые свойства МСК 25
1.4.3 Иммуномодулирующие онкогенные свойства МСК 25
1.4.4. Хоуминг МСК 26
1.5. Генная терапия 27
1.5.1 Противоопухолевые агенты 28
1.5.2 Введение генов 32
1.6.Система ЦДА/5-ФЦ 35
1.7 Лизомустин 37
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 39
2.1.Культуры клеток, методы культивирования и получения 39
2.1.1. Культуры клеток 39
2.1.2 Культивирование клеток 39
2.1.3. Выделение МСК 39
2.2. Оценка биологических свойств МСК 40
2.2.1. Иммунофенотипирование МСК 40
2.2.2. Дифференцировка МСК
2.2.2.1. Адипогенная дифференцировка 40
2.2.2.2. Остеогенная дифференцировка 41
2.2.3. Оценка миграционной способности МСК in v itro 41
2.3. Создание плазмидных конструкций 42
2.3.1. Клонирование плазмидных конструкций 42
2.3.2. Выделение плазмидной ДНК для трансфекции 43
2.4. Методы доставки, плазмидных и лентивирусных конструкций 44
2.4.1.Электропорация 44
2.4.2. Химическая трансфекция 44
2.4.2.1. Химическая трансфекция с помощью Xreme GENE HP DNA (Ro c he) 44
2.4.2.2.Химическая трансфекция с помощью Polyethylenimine (PEI, Sigma) 45
2.4.2.3.Химическая трансфекция с помощью Lipofectamine 3000 (Invitrogene) 45
2.4.3. Вирусная инфекция МСК 46
2.4. Методы оценки экспрессии генов 46
2.4.1. Вложенная ПЦР (Nested PCR) 46
2.5. Оценка чувствительности клеток к воздействию 5-ФЦ, 5-ФУ или системы ЦДА UPRT/5-ФЦ 47
2.5.1. Оценка чувствительности клеток к воздействию 5-ФЦ и 5-ФУ 47
2.5.2. Оценка цитотоксического воздействия системы ЦДА-UPRT/5-ФЦ 47
2.6. Методы оценки динамики изменения содержания МСК в тканях опухоли in vivo .48
2.6.1. Оценка динамики изменения содержания МСК по люциферазной активности в лизатах опухолевой ткани 48
2.6.2 Анализ динамики изменения содержания МСК с помощью метода биолюминесцентного in v iv o имиджинга 49
2.7. Перевиваемые опухоли мышей, методы их трансплантации и оценки противоопухолевого эффекта 49
2.7.1. Лабораторные животные 49
2.7.2. Модели опухолевого роста 50
2.7.3. Методы оценки противоопухолевого эффекта 51
2.8.Статистическая обработка 51
ГЛ АВ А 3. Резул ьтаты исследований 53
3.1 Характеризация мезенхимальных стволовых клеток 53
3.1.1. Иммунофенотипирование МСК 53
3.1.2. Дифференцировка МСК in vitro 54
3.1.3. Оценка миграционной активности МСК in v it ro 55
3.2. Создание плазмидных конструкций, отработка методик их введения, 57
получение трансфицированных МСК 57
3.2.1. Получение плазмидных конструкций, несущих гены ЦДА-UP RT и ЦДА-UP RT-VP22 57
3.2.2. Сравнительная химическая трансфекция 58
3.2.3.Электропорация 60
3.3. Оценка экспрессии терапевтических генов 63
3.3.1. Экспрессия гена ЦДА-UPRT в МСК 63 3.3.2. Экспрессия гена ЦДА в HEK293T 64
3.4. Оценка чувствительности клеток к 5-ФЦ и 5-ФУ 65
3.5. Оценка цитотоксического эффекта системы ЦДА-UPRT/5-ФЦ in vitro 67
3.5.1. Оценка цитотоксической активности системы ЦДА-UPRT/5-ФЦ, при монокультивировании 68
3.5.2. Оценка опосредованного цитотоксического эффекта системы ЦДА-UPRT/5-ФЦ,
при совместном культивировании 73
3.6. Оценка динамики изменения содержания МСК в тканях опухоли in vivo 77
3.6.1. Анализ люциферазной активности в лизатах опухоли. 77
3.6.2. Биолюминесцентный анализ динамики изменения содержания МСК в опухоли LLC (биолюминесцентный in v iv o имиджинг).. 79
3.7. Оценка противоопухолевого эффекта модифицированных МСК на моделях меланомы B16 и аденокарциномы легких Льюис LLC 81
3.7.1. Противоопухолевый эффект генетически модифицированных МСК на модели мышиной меланомы B16 82
3.7.1.1. Противоопухолевый эффект МСК, продуцирующих ЦДА-UP RT и ЦДА-UPRT-VP22, на модели мышиной меланомы B16 82
3.7.1.2. Противоопухолевая активность МСК, продуцирующих ЦДА-UP R T в комбинации с лизомустином на модели мышиной меланомы B16 85
3.7.2. Противоопухолевая активность генетически модифицированных МСК на
модели аденокарциномы легких Льюис LLC 87
3.7.2.1. Противоопухолевая активность МСК, продуцирующих ЦДА-UPRT и ЦДА-UPRT-VP22, на модели аденокарциномы легких LLC 87
3.7.2.2. Противоопухолевый эффект МСК, продуцирующих ЦДА-UPRT, в комбинации с лизомустином на модели аденокарциномы легких Льюис LLC 89
Заключение 92
Выводы 103
Список литературы
- Характеристика МСК
- Дифференцировка МСК
- Оценка цитотоксического воздействия системы ЦДА-UPRT/5-ФЦ
- Противоопухолевый эффект МСК, продуцирующих ЦДА-UP RT и ЦДА-UPRT-VP22, на модели мышиной меланомы B16
Введение к работе
Актуальность исследования. Каждый год по всему миру регистрируются миллионы случаев заболевания раком. Согласно некоторым данным, около 20% онкобольных с зарегистрированным диагнозом умирают в течение первых 5 лет (Siegel et al., 2016.; Статистика онкологических заболеваний: электрон. ресурс). На сегодняшний день, в России, зарегистрировано порядка 2,5 миллионов пациентов с онкологическими заболеваниями и каждый год от рака гибнут порядка 300 тыс. человек (Статистика онкологических заболеваний: электрон. ресурс).
Несмотря на обилие информации о различных противораковых агентах, современные методы лечения в клинической практике не обладают достаточной эффективностью и имеют тяжелые и длительные побочные эффекты. И хотя, современные режимы химиотерапии уже не оказывают таких тяжелых системных токсических эффектов, как прежде, до сих пор часто наблюдаются острые и отсроченные побочные эффекты такие, как появление язв слизистой ротовой полости, тошноты, когнитивных нарушений (Chemotherapy and you: A guide to self-help during cancer treatment: электрон. ресурс). Проблема заключается в том, что, успешное применение большинства противоопухолевых агентов возможно только в высоких концентрациях, вызывающих тяжелые системные токсические эффекты. Одним из способов решения этой проблемы, может быть разработка системы адресной доставки противоопухолевых препаратов к опухолям и их метастазам. Это позволит не только повысить эффективность терапии, но и свести к минимуму системные токсические эффекты.
Перспективным направлением в этой области является генная терапия – терапия, основанная на адресной доставке различных терапевтических генов. Продукт экспрессии этих генов оказывает определенное противоопухолевое действие. Таким образом, поиск оптимального средства доставки этих генов представляется ключевым моментом в разработке нового перспективного терапевтического направления (Sun el al., 2000; Sasportas et al., 2009).
На сегодняшний день, подавляющее большинство работ, представленных в исследовательской литературе, основано на использовании вирусных векторов в качестве средства доставки необходимых терапевтических генов. Хотя этот метод имеет ряд преимуществ, вирусные вектора обладают и серьезными недостатками, важными из которых являются, реакция иммунной системы организма и повышенный риск мутагенности. Вирусные вектора могут подвергаться биологической элиминации еще до того момента, как успеют достигнуть цели. Исходя из этого, использование в качестве средства доставки аутологичных/ аллогенных клеток, обладающих определенным тропизмом к опухоли, можно рассматривать как альтернативный и более безопасный подход (Harrington et al., 2002).
Мезенхимальные стволовые клетки (МСК)- это мультипотентные «взрослые» стволовые клетки, обладающие определенным тропизмом к опухоли и ее метастазам, а также низкой иммуногенностью. Немаловажным преимуществом их использования является относительная легкость выделения МСК из различных источников, в том числе из костного мозга, жировой ткани, пуповины, фетальной печени, мышечной и легочной ткани. После выделения, МСК можно легко размножить их ex vivo для дальнейшей трансфекции и введения в организм (Hamada et al., 2005; Zuk et al., 2001).
Ген цитозиндезаминазы (ЦДА) относят к, так называемым, суицидальным генам (его экспрессия ведет к гибели клетки хозяина). Представленный только у прокариот и грибов, в обычных условиях, этот фермент катализирует превращение цитозина в урацил, способствуя функционированию пиримидинового «спасательного пути», помогающего организмам использовать экзогенные пиримидиновые основания и нуклеозиды. Интересным свойством данного фермента является его способность превращать относительно нетоксичный субстрат 5-фторцитозин (5-ФЦ) в мощный противоопухолевый агент 5-фторурацил (5-ФУ), уже применяющийся в онкологии. Фермент урацилфосфорибозилтрансфераза (UPRT) также участвует в метаболизме пиримидинов. В нормальных условиях, превращает урацил в уридинмонофосфат, а при взаимодействии с 5-ФУ катализирует его превращение в 5-фторуридин монофосфат. Под действием клеточных ферментов 5-фторуридин монофосфат превращается в фтордеоксиуридин монофосфат и фторуридин трифосфат- метаболиты 5-ФУ с более высокой токсичностью. Совместное действие этих ферментов повышает их цитотоксический эффект. Белок VP22 встречается в оболочке вируса простого герпеса 1 типа. Известен своей способностью увеличивать уровень обмена ковалентно связанных с ним белков между клетками (Lemken et al., 2007). Хотя, сочетание адресной доставки гена ЦДА с системным введением ее субстрата- 5-ФЦ рассматриваться как весьма перспективная схема в противоопухолевой генной терапии, подавляющее большинство этих работ используют в качестве средства доставки вирусные вектора, как непосредственно в сам организм- in vivo, так и в клетки организма ex vivo (Morris, 1993; Koyama et al., 2000; Sadeghi, 2005). В связи с этим, разработка и доклиническая оценка эффективности генетически модифицированных МСК, как средства доставки гена цитозиндезаминазы, является актуальной задачей для генной терапии рака.
Целью исследования. изучение противоопухолевой активности генетически модифицированных МСК, экспрессирующих цитозиндезаминазу, на экспериментальных моделях перевиваемых солидных опухолей мышиной меланомы В16 и аденокарциномы легких Льюис LLC.
Задачи исследования
-
Создание, отработка методики трансфекции и оценка экспрессии плазмидных конструкций кодирующих гибридный фермент, состоящий из цитозиндезаминазы слитой с ферментом урацилфосфорибозилтрансферазой (ЦДА-UPRT), а также данный гибридный фермент, слитый с белком оболочки вируса простого герпеса 1 типа- VP22 (ЦДА-UPRT-VP22);
-
Отработка условий культивирования МСК, оценка их биологических свойств, а также получение трансфицированных МСК, экспрессирующих заявленные плазмидные конструкции;
-
Оценка цитотоксического эффекта гибридного фермента ЦДА-UPRT в присутствии 5-фторцитозина in vitro;
-
Оценка противоопухолевой активности трансфицированных МСК in vivo на моделях мышиной меланомы и аденокарциномы легких;
-
Оценка эффективности комбинированной терапии, сочетающей введение трансфицированных МСК и химиопрепарата лизомустина in vivo на моделях мышиной меланомы и аденокарциномы легких.
Научная новизна. Впервые подобраны эффективные условия для временной плазмидной трансфекции МСК, экспрессирующих противоопухолевые белки. Впервые изучена противоопухолевая активность МСК, экспрессирующих цитозиндезаминазу слитую с урацилфосфорибозилтрансферазой (ЦДА-UPRT) и ЦДА-UPRT слитую с белком оболочки вируса простого герпеса 1 типа -VP22 (ЦДА-UPRT-VP22) на перевиваемых моделях мышиной меланомы В16 и аденокарциномы легких Льюис LLC. Впервые показана эффективность и подобраны режимы введения для комбинированной терапии, включающей МСК, экспрессирующие ЦДА-UPRT, и химиотерапевтический агент - лизомустин на перевиваемых моделях мышиной меланомы В16 и аденокарциномы легких Льюис LLC.
Практическая значимость. Полученные данные об эффективности терапии с использованием МСК, несущих гены ЦДА-UPRT и ЦДА-UPRT-VP22, с системным введением 5-ФЦ на опухолевых моделях мышиной меланомы В16 и аденокарциномы легких LLC могут послужить основанием для проведения клинических испытаний. Разработанные методики выделения, культивирования и доставки генов в МСК могут послужить основанием для разработки противоопухолевой генной терапии, с использованием генов других противоопухолевых агентов, клиническое применение которых было ограничено из-за их высокой токсичности. Кроме того, данная методика может послужить основанием для разработки дизайна генной терапии в регенеративной и иммуномодулирующей терапии, с доставкой широкого спектра генов.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
-
Показана эффективность противоопухолевой терапии in vivo с использованием МСК, несущих гены ЦДА-UPRT и ЦДА-UPRT-VP22, при системном введения 5-ФЦ на перевиваемых опухолевых моделях мышиной меланомы В16 и аденокарциномы легких Льюис LLC;
-
Показана эффективность комбинированной противоопухолевой терапии in vivo, с использованием МСК, экспрессирующих гены ЦДА-UPRT, при многократном системном введении 5-ФЦ и однократном системном введении лизомустина, на опухолевых моделях мышиной меланомы В16 и аденокарциномы легких Льюис LLC.
Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены на межлабораторном коллоквиуме в ИМБ им.Энгельгардта РАН 2016 г; на 16-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука 21 века», Пущино, 16-21 апреля 2012 г; на 17-й Международой Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука 21 века», Пущино, 22-26 апреля 2013 г; на конференции Европейского Биохимического общества (Federation of European Biochemical Societies CONGRESS 2013) “Mechanisms in Biology” 6–11 июля 2013 г, Санкт- Петербург.
Публикации. По теме научного исследования было опубликовано 7 научных работ в т.ч. 3 тезиса, 3 статьи, 2 из которых в рекомендованном ВАК РФ журнале «Молекулярная биология» и 1 в журнале «Journal of Gene Medicine», официальном журнале Японского общества генной терапии (Japan Society of Gene Therapy) и Австралийского общества генной терапии (Australasian Gene Therapy Society), индексируемого базами данных Web of Science и Scope. Получен 1 патент РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 124 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, заключение, выводы и список используемой литературы (207 источников). Работа содержит 1 таблицу и 25 рисунков.
Характеристика МСК
В п ериод с конца 1980х по 1990е годы в ряде работ была определена связь МСК, выделенных из костного мозга, с тканями, развивающимися из мезенхимы, а также определены первые поверхностные маркеры –CD73 и СD105 [72,74]. Трансплантация этих клеток в условия in vivo привела к образованию целого ряда клеток, участвующих в образовании костей, хрящей, жировой ткани и связок. Это привело к тому, что к 1988 году в литературе для этого типа клеток стал применяться термин «остеогенные стволовые клетки» или «костномозговые стромальные стволовые клетки» [135]. Однако наиболее впечатляющим открытием была способность МСК дифференцироваться в фиброзную, костную и хрящевую ткань в условиях in vivo, даже после 30 клеточных удвоений в ус л о в и я х in v itro[52].
Определенный вклад в концепцию МСК также был внесен рядом классических экспериментов по трансплантации костного мозга летально обл ученным животным и гетеротопическая трансплантация аспиратов костного мозга животным в брюшную полость, с последующим образованием остеоцитов и хондроцитов de novo. Сам термин «мезенхимальная стволовая клетка» был впервые введен в работах Каплана [17]. МСК иногда называют, как мезенхимальные стромальные клетки, подчеркивая тем самым, что эти клетки относятся к подтипу не гемопоэтических «взрослых стволовых клеток», берущих свое начало из мезодермы [148].
В настоящее время, под термином МСК в литературе понимаются постнатальные («взрослые») стволовые клетки, обладающие способностью к самообновлению в течение длительного времени без значительных изменений их основных свойств, а также к дифференцировке в различные специализированные клеточные линии и типы, при определенных физиологических или экспериментальных условиях. Как и эмбриональные стволовые клетки, МСК обладают способностью к дифференцировке как в клетки мезодермального происхождения (хондроциты, остеоциты, адипоциты), так и экто - и энтодермального типа. МСК присутствуют во всех типах тканей организма. Источниками для получения МСК могут быть: костный мозг, жировая ткань, пуповина (Вартонов студень, пуповинная кровь), эмбриональная печень, мышечная ткань, ткань легкого. Сравнительно простая методика культивирования МСК позволяет легко размножать этот тип клеток в условиях in vitro. Возможные варианты применения этих клеток в будущем представляются гораздо шире, чем предполагалось учеными ранее, во многом, из-за отсутствия этических ограничений при получении и работе с МСК, как, например, в случае эмбриональных стволовых клеток.
Несмотря на то, что в литературе накоплено довольно много информации о свойствах МСК, информации о характеристиках самих МСК по- прежнему недостаточно. МСК выделенные из различных источников (по различным методикам), могут обладать весьма различающимися характеристиками. В связи с этим, в 2006 году Международным Сообществом Клеточной Терапии (International Society fo r Cellular Therapy) был разработан список минимальных требований, которым должны удовлетворять клетки человека, чтобы называться МСК [37]:
1. МСК должны обладать хорошей адгезией к культуральному пластику, при стандартных условиях культивирования;
2. на поверхности МСК должны присутствовать маркеры CD73, CD90, CD105 и отсутствовать CD45, CD34, CD14, CD11b, CD79- или CD19, а также HLA-DR;
3. МСК должны обладать способностью к дифференцировке в остеобласты, адипоциты и хондроциты при стандартных культуральных условиях.
Следует отметить, что применение этого стандарта на практике связано с рядом трудностей. К примеру, в литературе упоминаются случаи получения неадгезивной популяции МСК человека из аспиратов костного мозга. Причем, при сравнении пролиферативной способности, а также способности к остеогенной и хондрогенной дифференцировке у адгезивной и неадгезивной субпопуляции МСК, полученных из одного образца аспирата костного мозга, отличий не выявлено [191]. Кроме того, следует учитывать, видоспецифичность (данный стандарт был разработан для МСК человека), время нахождения в культуре и источник выделения.
На сегодняшний день, технический уровень анализов, применяющихся для оценки свойств и характеристик МСК, позволяет собрать довольно много данных об этих клетках. Основной проблемой является отсутствие единой концепции оценки для этой информации. Большинство существующих подходов базировались на концепции, разработанной для ГСК т.к. исторически, именно ГСК раньше попали в поле зрения ученых, МСК же рассматривались больше как субпопуляция клеток, составляющих строму и микроокружение для ГСК. Согласно основному критерию оценки ГСК, единичная гемопоэтическая стволовая клетка должна обладать способностью последовательно восстанавливать кроветворение у летально облученных мышей в течение длительного периода времени. Исходя из этого, к МСК могут применяться следующие требования [15]: 1. «Стволовость» или клоногенность клеток в условиях не только in vitro, но и при трансплантации in v iv o; 2. Мультипотентность (с уверенностью доказать мультипотентность клетки возможно, только при проведении анализов на уровне единичных клеток); 3. Самообновление, т.е. способность популяции стволовых клеток поддерживать без изменений свой фенотип и функции, как у их предшественников.
Согласно классическим представлениям, костномозговые МСК (кмМСК), обладают клоногенностью, если их единичные клетки способны давать начало колониям фибробластоподобных клеток в условиях in vitro культуры. В современных анализах, руководствуются представлением, что кмМСК обладают клоногенностью, если они способны образовывать колонии при высевании в низкой плотности, т.е. плотности исключающей возможность межклеточного контактного взаимодействия. Важным моментом является тот факт, что кмМСК должны обладать клоногенностью, даже при высевании в высокой плотности, однако в данном случае, любой количественный анализ единичных колоний станет невозможным.
Пока не выявлено специальных маркеров, которые бы позволили выделить мультипотентные КОЕф от их более коммитированных потомков. Утверждение о том, что любая стволовая клетка в костном мозге является клоногенной, не свидетельствует о том, что все полученные in vitro КОЕф автоматически будут являться стволовыми клетками. Единственная установленная зависимость на сегодняшний день, это прямая корреляция между количеством КОЕф и количеством МСК в образцах. Клоногенность фракции кмМСК может быть повышена, при положительной селекции клеток по маркерам STRO-1 и MCAM [172,160] При анализе полученных первичных культур МСК, следует учитывать, что, хотя все выделенные клетки являются потомками КОЕф, в полученной культуре будут также присутствовать клет ки с ограниченным, но четко выраженным потенциалом к росту в культуре. Поэтому первичные культуры клеток, полученные при высевании клеток в клоногенной и не в клоногенной плотности, так сильно отличаются друг от друга, однако, ни одна из них не может называться стопроцентной культурой МСК. Конечно, в культуре, полученной от одной или всего нескольких КОЕф возможно более гомогенное распределение определенных маркеров. Однако даже в культуре, теоретически полученной из одной КОЕф, клетки начинают стохастически делиться до определенного момента, а затем, часть клеток может начать дифференцироваться в культуре или же перейти в состояние старения и ли сенесенса («senescence») [160]. В связи с этим, однозначно утверждать, о сохранения КОЕф потенциала в культуре МСК возможно, только если единичные клетки, потомки изначально выделенной и размноженной в у с л о в и я х in v itro КОЕф, при помещении их в условия in v iv o начинают дифференцироваться и давать начало новым тканям. Подобный подход к оценке клоногенности МСК хотя и является общепризнанным, однако, практически не реализуемым на практике. Поэтому, на сегодняшний день, нельзя с уверенностью утверждать, что, в полученных из аспиратов костного мозга или других тканей, адгезивных культурах клеток действительно происходит размножение именно МСК, а не просто рост определенной популяции клеток, при одновременном истощении пула стволовых клеток [172,160].
Дифференцировка МСК
На сегодняшний день, генная терапия, с использованием суицидальных генов, основывается, главным образом, на двух системах, состоящих из фермента и его субстрата (пролекарства): Hsvk / ганцикловир и ЦДА/5-ФЦ. Однако, в литературе есть данные о том, что система ЦДА/5-ФЦ имеет ряд преимуществ по сравнению с Hsvk / ганцикловир. Основным преимуществом является мощный «эффект свидетеля»(b ys ta nd e r effect) системы ЦДА/5-ФЦ, не требующий непосредственного межклеточного щелевого контакта (gap junctions). При сравнительном анализе in vitro и in v iv o эффективности этих двух систем на модели карциномы почки человека (SK-RC-29, -31, -38, -42, -52), оказалось, что при отсутствии у клеток щелевых контактов (оценка по экспрессии белка connexin-43), система Hsvk / ганцикловир резко теряла свою цитотоксическую активность, в то время как ЦД А /5 -ФЦ свою сохраняла [169]. Цитозиндезаминаза (ЦДА, ЕС 3.5.4.1) –это фермент, принадлежащий к семейству гидролаз и катализирующий. реакцию деаминации цитозина, в результате которой образуются урацил и аммиак. Этот фермент представлен исключительно в прокариотах и грибах и участвует в функционировании пиримидинового «спасательного пути». Пиримидиновый «спасательный путь» помогает организмам потреблять экзогенные пиримидиновые основания и нуклеозиды, не образовавшиеся в качестве интермедиатов, при синтезе пиримидинов в клетке de no vo [131].
Сравнительное исследование ЦДА от Escherichia coli и Saccharomyces cerevisiae выявило значительное различие между бактериальной ЦДА и ЦДА грибов. Эти отличия включают первичную структуру, молекулярную массу, четвертичную структуру, а также их относительную субстратную специфичность. Так, например, ЦДА дрожжей представляет собой гомодимер, с субъединицей состоящий из 158 аминокислотных остатка и массой 35кDa [71]. Бактериальная ЦДА представляет собой гексамер с субъединицами около 426 аминокислотных остатка и массой приблизительно 300 кDa, является более термостабильной, чем дрожжевая ЦДА [85, 95]. В настоящее время учеными используются оба варианта ЦДА. Однако, есть данные, о том, что дрожжевая ЦДА может быть более эффективной, при ее применении в генной терапии. Это связано с ее более низким значением Km и большей аффинностью по отношению к 5-ФЦ, в сравнении с бактериальной ЦДА [95].Клетки экспрессирующие ЦДА становятся чувствительными к аналогу цитозина- 5-ФЦ, т.к в результате реакции, катализируемой ЦДА, 5-ФЦ превращается в токсичный метаболит 5-фторурацил (5-ФУ) (Рис.
Молекула 5-ФУ может встраиваться в молекулу РНК, ингибируя, тем самым, ее функции [95] Однако, действие 5-ФУ обусловлено во многом действием его метаболитов. Цитотоксичность молекулы 5-ФУ значительно увеличивается, при его дальнейшем, двух-ступенчатом преобразовании до его метаболитов: 5-фт о р -уридинмонофосфат (5-FUMP) и, затем, и в 5-фт о р -деоксиуридинмонофосфат (5-FdUMP). Молекула 5-FdUMP, в свою очередь, является необратимым ингибитором фермента тимидилатсинтазы. Ингибирование этого фермента приводит к истощению пула деокситимидин трифосфата (dTTP) в клетке и, как следствие, ингибированию синтеза ДНК. У прокариот также существует другой путь метаболизма 5-ФУ, где он разлагается до нетоксичного -аланина [120].
Известны случаи развития относительной устойчивости раковых клеток к воздействию 5-ФУ, из-за низкой эффективности превращения 5-ФУ в его более токсичные метаболиты. Дело в том, что в клетках млекопитающих отсутствует фермент урацил фосфорибозилтрансфераза (UPRT), участвующий в дальнейшем метаболизме 5-ФУ и, также как и ЦДА, принадлежащий к пиримидиновому «спасательному пути». В клетках E. coli, к примеру, UPRT катализирует синтез уридин 5- монофосфата (UMP) [101]. Показано, что совместное введение в опухолевые клетки гена UPRT и ЦДА повышает чувствительность к 5-ФЦ в десятки раз, как in vitro, так и in vivo [120,101].В связи с тем, что ЦДА представлена в клетках грибов, 5-ФЦ долгое время использовали в клинике только как противогрибковый препарат [95]. Лишь значительно позже, из-за своей избирательной активности, ЦДА стала рассматриваться как противоопухолевый агент в борьбе с солидными опухолями [78]. Генетически модифицированные клетки млекопитающих, экспрессирующие ЦДА, после введения 5-ФЦ, гибнут от образовавшихся продуктов реакции. Эта система показала свою эффективность при лечении рака прямой кишки, молочной железы, поджелудочной железы и легких [95]. На сегодняшний день, адресная доставка генов ЦДА и системное введение ее субстрата-пролекарства 5-ФЦ считается очень перспективным подходом в противораковой терапии. На основе этого подхода проведен целый ряд как доклинических, так и клинических исследований [49].
К веществам группы производных нитрозоалкилмочевины относится класс препаратов, давно применяющихся для лечения злокачественных опухолей различных видов и локализации. Известно, что соединения группы производных N-нитрозо-N-алкилмочевин являются цикло- и фазонеспецифическими цитостатиками, алкилирующими ДНК, РНК и белки и успешно применяются в клинической практике, особенно в комбинации с другими противоопухолевыми препаратами[2].
Лизомустин– это отечественный препарат, созданный совместно Институтом органического синтеза УрО РАН и ГУ Российский Онкологический научный центр им. Н.Н.Блохина РАМН. Лизомустин 2-хлорэтилнитрозо-L-гомоцитрулин (C9H17C lN 4O4) представляет собой смесь изомеров (Рис. 2) производных нитрозомочевины (1,3-бис-(2-хлорэтил)-1-нитрозомочевины): 9-(2-хлорэтил)-7-нитрозо-L-гомоцитрулин (І) и 9-(2-хлорэтил)-9-нитрозо-L-гомоцитрулин (ІІ). Соотношение изомеров І и ІІ в выпускаемой субстанции лизомустина выглядит как 75:25 [143] При этом, следует отметить, что если активность изомера ІІ сходна с активностью других препаратов, производных 2-хлорэтилнитрозомочевины, то противоопухолевая активность изомера І остается до конца не ясной. При оценке цитотоксического эффекта каждого из изомеров лизомустина на культуре клеток К562, оказалось, что изомер ІІ обладает гораздо большей эффективностью, чем изомер І. При этом, если эффект изомера ІІ успешно ингибировался О6-метилгуанин-ДНК метилтрансферазой (O6-methylguanine-DNA methyltransferase), на эффекты изомера І она практически не влияла. Это может говорить о разных механизмах активности изомеров [157]
Оценка цитотоксического воздействия системы ЦДА-UPRT/5-ФЦ
Для выбора оптимальной методики введения генетических конструктов в МСК, а также в культуры клеток LLC, В16 и HEK293T (Рис. 8), была проведена сравнительная химическая трансфекция этих культур клеток. То обстоятельство, что все 4 культуры клеток подвергались химической трансфекции при идентичных условиях позволяет сделать выводы о восприимчивости этих клеток к процедуре трансфекции и о выборе приемлемой методики.
Для проведения сравнительной химической трансфекции культур клеток использовались реагенты полиэтиленимин (PEI), Xreme GENE HP DNA и липофектамин (Lipofectamine 3000), согласно методикам описанной ранее. Эффективность трансфекции оценивалась визуально, по уровню светимости белка EGFP на флуоресцентном микроскопе (Leica 4000B), а также согласно данным проточной цитофлуориметрии (Gallios). При оценке жизнеспособности клеток ориентировались на изменение морфологии и стандартную скорость удвоения опытных клеток в культуре, в сравнении с интактными клетками (данные не представлены). эффективность химической трансфекции МСК была получена, при применении реагента Lipofectamine 3000. Однако ни один способ химической трансфекции не давал необходимого уровня эффективности, необходимой для применения этой методики в дальнейшем, при постановке терапевтических опытов. Кроме того, Lipofectamine 3000 вызывал изменение морфологии, замедление роста МСК (данные не представлены), что может говорить о его токсическом воздействии. При оценке эффективности химической трансфекции культур клеток B16 и LLC, оптимальный уровень эффективности был получен, при применении двух реагентов: Xreme GENE HP DNA и Lipofectamine 3000. Однако из-за высокой токсичности, применение Lipofectamine 3000 в дальнейших эксп ери мен тах, где учи тыв алась жизн есп особн ость клеток, было нев озможн ым. К у л ь т у р а HEK293T демонстрировала наибольшую восприимчивость к процедуре химической трансфекции, в сочетании с хорошей жизнеспособностью клеток. Максимальный уровень трансфекции продемонстрировали 2 реагента X r e me GEN E HP DNA и P EI. О дн а ко из-за высокой токсичности PEI, его применение возможно только в случаях, когда не учитывается жизнеспособность клеток. Представленная гистограмма была построена по усредненным данным 4-х экспериментов.
В целом, по результатам проведенного сравнительного исследования методики химической трансфекции культур клеток МСК, LLC, В16 и HEK293T (Рис.8) можно заключить, что наименьшей эффективностью обладал реагент PEI, эффективное применение которого возможно только на легко т р а н с фи цируемой культуре клеток-HEK293T, которая обладала максимальной трансфицируемостью среди всех 4 культур клеток. На стабильных клеточных культурах наилучшим сочетанием высокой эффективности трансфекции и хорошей переносимостью обладал реагент Xreme GEN E HP DNA. В связи с этим, этот реагент было решено использовать для постановки дальнейших экспериментов по оценке цитотоксичности системы ЦДА-UPRT/5-ФЦ in vitro. При получении и наработке вирусных стоков на культуре HEK293T применялся реагент PEI, т.к. в данном случае, при высокой эффективности трансфекции нет необходимости в длительном культивировании клеток, после трансфекции.
Наибольшей резистентностью к процедуре химической трансфекции обладала культура МСК. Ни один из испытанных реагентов не давал необходимого уровня эффективности трансфекции. Из всех трех испытанных реагентов максимальным уровнем трансфекции обладал реагент Lipofectamine 3000. Однако, из-за выраженного токсического воздействия и недостаточной эффективности, применение этой методики трансфекции, в дальнейшем, оказалось невозможным. В связи с этим, для введения в МСК необходимых плазмидных конструктов стал отрабатываться метод трансфекции клеток путем электропорации.
При отработке оптимальных режимов электропорации использовались различные режимы, с разной, длинной, величиной и формой волны электрического импульса, их количеством, а также количеством используемой ДНК. При выборе начальных режимов для отработки, руководствовались рекомендациями производителя прибора GenePulserXcell (“BioRad”) и литературными данными. Выбор наиболее удачных режимов происходил с учетом не только эффективности электропорации, но и жизнеспособности самих клеток. Для отработки методики использовались кюветы для электропоратора с плоскими алюминиевыми электродами, с зазором между ними равным 1 мм, 2мм и 4 мм. В качестве буфера для электропорации использовалась коммерческая среда OptiMem, которая по нашим неопубликованным данным обладает рядом преимуществ по сравнению с бессывороточной средой, повышая эффективность и жизнеспособность клеток почти в 2 раза, что согласуется с некоторыми литературными данными [75]. При оптимизации методики, были испытаны режимы с экспоненциальной и квадратной формой волны. У режимов с экспоненциальным импульсом варьировалась длина (мс) и величина (В) и емкость (мФ), у режимов с квадратной формой импульса варьировали длину (мс), величину (В) и количество импульсов и интервал между ними (с).
В процессе отработки методики электропорации МСК было сформулировано несколько выводов. Во-первых, электропорация культуры МСК, хорошо переносится, если клетки не «моложе» 2 пассажа в in vitro культ уре, на более ранних пассажах наблюдается в ысокая ги бель кл еток. Во-вторых, оптимально использовать кю в е т ы с расстоянием между электродами 4 мм, т.к. они не только дают возможность трансфицировать большое количество МСК (что важно, при постановке терапевтических экспериментов), но и лучше сохраняют жизнеспособность клеток. В-третьих, увеличение концентрации ДНК (с 10 мкг /106 МСК до 50 мкг/106 МСК) в среде для электропорации повышает эффективность электропорации в среднем на 30%, дальнейшее увеличение концентрации не дает заметного увеличения эффективности (Рис.9). Этот результат согласуется с некоторыми литературными данными [75, 123] и может объясняться токсическим воздействием свободной ДНК и сильного магнитного поля на мембраны МСК. Предварительная инкубация клеток с ДНК незначительно увеличивала эффективность электропорации. Однако это позволяло добиться более стабильных результатов (данные не представлены). Кроме того, было показано, что эффективность электропорации обратно пропорциональна сохранению жизнеспособности МСК.
Зависимость эффективности электропорации от содержания ДНК в среде для электропорации. На гистограмме представлены усредненные количественные данные из четырех экспериментов.
По результатам отработки методики электропорации, путем варьирования параметров электрических импульсов квадратной формы, были сделаны следующие выводы:
1. Увеличение числа последовательных импульсов, в диапазоне от 5 до 10, незначительно повышает эффективность электропорации с резким снижением жизнеспособности МСК,
2. При повышении напряжения, в диапазоне от 200 В до 280 В (кювета 2 мм), повышается эффективность электропорации, но резко падает жизнеспособность МСК;
3. Увеличение длины импульса в диапазоне от 0,05 до 2 мс, происходило увеличение эффективности электропорации, при минимальном влиянии на жизнеспособность клеток до определенного порога. Оптимальными с точки зрения соотношения параметров эффективность/ жизнеспособность МСК в кюветах с зазором 2 мм были режимы: 260 В, 0,8 мс, 7 импульсов с интервалом 7 с (эффективность в среднем 34% (Рис.10 А)) и 280 В, 0,5 мс, 7 импульсов с интервалом 7 с (эффективность в среднем 26% (Рис. 10 Б)). Однако, при более высоком значении напряжения или увеличении длинны импульса режимы оказывали прямо противоположное действие- эффективность электропорации и жизнеспособность клеток резко снижалась.
Противоопухолевый эффект МСК, продуцирующих ЦДА-UP RT и ЦДА-UPRT-VP22, на модели мышиной меланомы B16
Примечательно, что между группами мышей получав ших МСК-ЦДА-UP R T и МСК-ЦДА-UPRT-VP22 не было статистически достоверных отличий. Этот эффект не согласуется с некоторыми литературными данными [197]. Однако, это может объясняться высоким уровнем экспрессии ЦДА-UPRT, после транзиентной плазмидной трансфекции, что приводит к высокой концентрации метаболитов 5-Ф Ц маски р ую щи х э ффе кт бел ка VP22, способствующего эффективному обмену, ковалентно связанных с ним белков, между клетками. 3.7.1.2. Противоопухолевая активность МСК, продуцирующих ЦДА-UPRT в комбинации с лизомустином на модели мышиной меланомы B16
Для оценки эффективности комбинированной терапии генетически модифицированными МСК с лизомустином, мышам линии C57BL/6, спустя 7 дней после имплантации опухолевых клеток В16, проводили внутриопухолевое введение МСК экспрессирующих гены ЦДА-UPRT (МСК-ЦДА-UPRT) либо МСК-Mock (интактные МСК). Группам, получившим МСК-ЦДА-UPRT в течение 7 последующих дней, внутрибрюшинно вводили 5-ФЦ. Спустя 7 дней после введения генетически модифицированных МСК (по окончании курса 5-ФЦ), животные получали однократную внутрибрюшинную инъекцию лизомустина в дозе 175 мг/кг. Контрольная группа получала аналогичные объемы PBS.
По результатам проведенного эксперимента, было обнаружено, что в группе, получавшей МСК-ЦДА-UPRT с 5-ФЦ и однократной инъекцией лизомустина, наблюдается почти 2-кратное торможение скорости роста опухоли в экспоненциальной фазе, в сравнении с контрольной группой. Время удвоения объема опухоли в этой группе, составило T d =5,7 против T d =3,0 в контрольной группе (Рис.23 А). В течение 8-ми пер в ы х суток, после начала лечения, наблюдался незначительный эффект ТР3О3%. Однако, к 12-м суткам (5-е сутки после введения лизомустина) происходило увеличение параметра ТРО до 61%, а к 20-м суткам уже до 79% (Рис.23 Б). Средняя продолжительность жизни в группе составляла 47 дней, при этом, было отмечено увеличение параметра УПЖ на 37%.
Данные полученные при анализе показателей группы, получавшей МСК-Mock и лизомустин, демонстрируют незначительное замедление скорости роста опухоли в экспоненциальной фазе роста- Td=3.6, в сравнении с Td=3 в контрольной группе (Рис. 23 А). В течение первых 9-и суток после введения интактных МСК, наблюдалось небольшое торможение роста опухоли (ТРО=33%). Однако, на 12-е сутки после введения МСК, что соответствует 5-м суткам после введения лизомустина, был зафиксирован ингибирующий эффект выше значимой величины ТРО=58%. Далее, параметр ТРО возрастал до 65% и сохранялся вплоть до окончания эксперимента на уровне 69% (Рис.23 Б). Средняя продолжительность жизни в этой группе составила 38 дней, что выше, чем в контрольной группе на 13%. А
Эффективность комбинированной терапии с использованием генетически модифицированными МСК в сочетании с 5-ФЦ и лизомустином на модели мышиной меланомы В16. Спустя 7 дней после имплантации мышам опухолевых клеток В16, каждому животному проводили внутриопухолевое введение 110 МСК-ЦДА-UPRT либо МСК-Mock, в объеме 70 мкл. Животным, получившим МСК-ЦДА-UPRT, в течение 7 последующих дней внутрибрюшинно вводили 5-ФЦ, остальным группам вводили аналогичные объемы PBS по той же схеме. Группы с введением МСК-ЦДА-UPRT и МСК-Mock комбинировались с однократным внутрибрюшинным введением лизомустина в дозе 175 мг/кг. Контрольная группа животных вместо лечения получала аналогичные объемы PBS по той же схеме. А. Динамика роста опухоли. Б. Эффективность лечения, значение параметров ТРО и УПЖ. Представленные в пунктах (А) графики и в пункте (Б) гистограмма были построены по усредненным данным из трех экспериментов.
Торможение роста опухоли отмечалось как в группе МСК-ЦД А-UPRT с 5-Ф Ц и лизомустином, так и МСК-Mock с лизомустин (Рис. 23 А и Б). Следует отметить, что максимальный противоопухолевый эффект был отмечен в группе получавшей МСК-ЦДА-UPRT с 5-ФЦ и лизомустином (УПЖ=37%, ТРО=76% к концу эксперимента), в сравнении с контрольной группой. Во всех опытных группах отмечалось статистически значимое (P 0.05) увеличение продолжительности жизни (Рис. 23 Б).
Противоопухолевая активность МСК, продуцирующих ЦДА-UPRT и ЦДА-UPR T-VP22, на модели аденокарциномы легких LLC
Для оценки противоопухолевого эффекта генетически модифицированных МСК in vivo, самцам мышей линии C57BL/6, спустя 7 дней после имплантации опухоли L LC , вводили МСК, экспрессирующие гены ЦДА-UPRT (МСК-ЦДА-UPRT) и ЦДА-UP RT-VP22 (МСК-ЦД А-UP R T-VP22), параллельно с системным введением 5-ФЦ в течение 7 дней.
Показано, что на 9 день после введения МСК-ЦДА-UPRT и МСК-ЦДА-UP RT-VP22, в сочетании с внутрибрюшинным введением 5-ФЦ, зафиксировано ингибирование роста опухоли на 56%, в сравнении с контролем. Ни каки х значимых различий между группами МСК-ЦДА-UPRT и МСК-ЦДА-UPRT-VP22 обнаружено не было (Рис. 24 А). Зафиксированное биологически значимое увеличение продолжительности жизни составило 27% в группе МСК-ЦДА-UPRT и 31% в группе МСК-ЦДА-UPRT-VP22 (Рис. 24 Б). Эти данные согласуются с представленными данными по оценке терапии с применением МСК-ЦД А-UPRT и МСК-ЦД А-UP R T-VP22 на модели В16, где та кже не было зафиксировано существенных различий между этими экспериментальными группами. Данный результат хотя и противоречит некоторым литературным источникам [197, 105], также может объясняться высоким уровнем экспрессии плазмидной конструкции ЦДА-UPRT в МСК, что может маскировать эффект вносимый белком VP22, который облегчает межклеточную диффузию, ковалентно связанных с ним, белков.