Введение к работе
Актуальность проблемы. Осенью 1987 г. на Байкале произошла :ассовая гибель тюленей (Phoca sibirica, байкальская нерпа). В езультате погибло около 6,5 тысяч животных из общего числа 70 ысяч. Ранее эпизоотии у байкальских тюленей не были арегистрированы. Клиническая картина болезни, патологические зменения органов тканей животных и характер распространения іболевания указывали на то, что популяция байкальских тюленей одверглась воздействию инфекционного агента, вероятно, вируса умы плотоядных (CDV - род Morbillivirus, семейство Paramyxovirus). юзднее эта гипотеза была подтверждена гибридизационным эндированием РІЖ из органов больных животных синтетическими лигонуклеотидами, синтезироваными на основе опубликованных груктур известных морбилливирусов.
Массовое заболевание байкальской нерпы стало первым арегистрированным случаем морбилливирусной инфекции среди юрских млекопитающих. В 1988 г. вспышке подобной болезни одверглись популяции других ластоногих (Pinnipedic), а именно ерых (Halichoerus gryphus) и обыкновенных {Phoca vitulina) тюленей в алтайском и Северном морях. Позднее морбилливирусные инфекции ыли зарегистрированы в Средиземном море среди популяций морских виней и дельфинов - представителей отряда китообразных (Cetacea).
За последнее время вирус чумы плотоядных инфицировал не олько морских млекопитающих, но и большое число наземных сивотных в Европе, Соединенных Штатах Америки, Африке и в [понии. О восприимчивости к вирусу чумы плотоядных многих из тих видов животных ранее не было известно.
Молекулярно-биологическое изучение новых
юрбилливирусов, в том числе вируса байкальской нерпы и других ариантов вируса чумы плотоядных, представляет особый интерес, оскольку это не только расширяет существующие знания тносительно разнообразия циркулирующих в природе вирусов, но и ,аёт возможность раскрыть некоторые молекулярные механизмы еожиданной смены хозяина, обнаруженной практически дновременно в нескольких местах.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось юлекулярно-филогенетическое исследование вируса байкальской
.3
нерпы на основе сравнения полных нуклеотидных последовательносте? двух генов этого вируса (белков фосфопротеина Р и гемагглютинина Н и ряда других морбилливирусов.
Для этого необходимо было решить следующие задачи:
-
Определить нуклеотидные последовательности генов Р и Н изолятг вируса байкальской нерпы.
-
Сравнить полученные последовательности с аналогичнымг структурами других морбилливирусов, а также всех известны> изолятов CDV.
-
С помощью молскулярно-филогенетического анализа определиті систематическое положение байкальского вируса относительщ других морбиливирусов.
-
Оценить отличия вируса байкальской нерпы от других циркулирующих в природе штаммов вируса чумы плотоядных.
-
Исследовать популяцию байкальской нерпы на наличие в не і морбилливирусов после вспышки 1987/88 гг.
-
Оценить полиморфизм вирусов, циркулирующих в популяцш байкальской нерпы.
Научная новизна работы. Впервые для изучения вирусной заболевания в природной популяции животных были использовань методы молекулярной биологии, включая амплификацию < использованием полимеразной цепной реакции выбранных участкої генома вирусов, клонирование и последующее определен ігуклеотидной последовательности полученных фрагментов.
В результате анализа нуклеотидных последовательностеі однозначно установлено, что вспышка болезни на Байкале был; вызвана вариантом вируса чумы плотоядных, отличным от других циркулирующих в природе штаммов CDV.
Показано существенное отличие вируса байкальской нерпы о морбилливирусов других морских млекопитающих, как ластоногих, таї и китообразных. Продемонстрировано независимое происхождени морбилливирусов морских и пресноводных животных.
Теоретическая и практическая значимость работы.
Полученные в результате работы нуклеотидны последовательности двух генов вируса байкальских тюленей и ряд других изолятов CDV значительно расширяют существующи представления о разнообразии вирусов чумы плотоядны?
иркулирующих в природе. В распоряжении исследователей оказался ополнительный материал для изучения различий между вирусами на енетическом уровне, для анализа вирусных белков и определения начения изменений в структуре генов и белков.
В ходе изучения вируса байкальской нерпы разработан и интезирован ряд морбилливирусных праймеров для выявления и онкого анализа любой морбилливирусной инфекции с помощью іетода полимеразной цепной реакции. Отработанные методики озволяют быстро, без применения трудоёмкой стадии ультивирования вируса подтвердить или опроверпгуть наличие юрбилливирусной инфекции, а в сочетании с методами еквенирования определить принадлежность выявленного вируса к ому или иному виду морбилливируса и показать его отличие от ругих, близких ему вирусов. Результаты показывают, что данный юдход оказался достаточно эффективным для этих целей.
На защиту выносятся следующие положения: Переход морбилливирусов к морским и пресноводным позвоночным произошёл независимо в нескольких эволюционных линиях. ',. Исследованный в работе вирус байкальской нерпы наиболее близок к вирусу чумы плотоядных и является отдельным вариантом последнего.
Вирус байкальской нерпы высоко изменчив и в популяции байкальской нерпы одновременно циркулируют несколько вариантов этого вируса.
Внедрение в практику. Полученные нуклеотидные юследовательности гена Р и И изученных штаммов CDV (епонированы в международный компьютерный банк данных Genbank.
Материалы исследований используются в учебном процессе іри подготовке студентов-биологов в Иркутском Государственном Университете в циклах «Молекулярная вирусология» и «Частная іирусология».
Апробация работы. Результаты исследований представлялись іа Второй Верещагинской байкальской международной конференции, іроходившей в 1995 г. в городе Иркутске.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано дві статьи в реферируемых журналах. Одна статья находится в печати.
Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 15( страницах машинописного текста, включая 10 рисунков и 6 таблиц Библиографический указатель содержит 136 литературных источников в том числе 15 отечественных и 121 зарубежных. Диссертация состой' из введения, обзора литературы, описания материала и методої исследования, изложения результатов исследования и их обсуждения заключения, выводов, списка литературы и приложения.
Обзор литературы состоит из трёх разделов. В первом раздел* описаны современная классификация и молекулярная биологии морбилливирусов, во втором - роль морбилливирусов в патологш морских и пресноводных млекопитающих; в третьем - особенное эволюции вирусов и современные подходы к изучению молекулярної биологии, и филогении РНК-содержащих вирусов.