Введение к работе
Актуальность проблемы. Проблема распространения вирусной инфекции внутри зараженного растения в настоящее время является одной из наиболее активно изучаемых в молекулярной вирусологии растений. Исследование биохимических аспектов транспорта вируса имеет не только очевидное теоретическое, но и практическое значение, поскольку резистентность рас гении к вирусам в большинстве случаев связана именно с блоком транспорта, и знание механизма взаимодействий вируса и клетки в процессе распространения инфекции может послужить основой для разработки эффективных методов борьбы с вирусными заболеваниями сельскохозяйственных культур.
За последние несколько лет в молекулярной вирусологии растений произошел значительный прогресс в понимании процесса межклеточного и системного транспорта вирусной инфекции. Была выработана и подтверждена многочисленными экспериментальными данными общая концепция вирусного транспорта, согласно которой перемещение инфекции из клетки в клетку является активным процессом, в котором ключевую роль играют вирус-кодирусмые транспортные белки (ТБ).
Объектом настоящей работы является вирус желтухи свеклы (ВЖС), типовой представитель рода Closterovirux семейства Clostrroviridoe. Среди ( 11P1IK-содержащих вирусов растений, клостеровирусы выделяются рядом струю урных и биологических особенностей. Они имеют морфологически полярные сверхгпбкие нитевидные внрионы (Agranovsky el al., 1995), которые содержат молекулу геномной РНК очень большого размера, 15-20 тысяч нуклеїн плов. Клостеровирусы вызывают флоэмно-ограниченные инфекции в растениях и переносятся насекомыми-векторами полуперсистентно. Одной из характерных особенностей клостеровирусов является присутствие в их геномах гена белка размером около 65 кДа, который гомологичен клеточным белкам теплового шока семейства HSP70 (Agranovsky el al, 1991). Вероятно, ген шапероноподобиою белка был захвачен предком клостеровирусов в результате РНК-рекомбинации с клеточной мРНК. Высказывалось предположение, что этот белок может отвечать за транспорт вирусной инфекции из клетки в клетку (Agranovsky el al., 1991; Agranovsky, 1996).
Цель и залами исследования. Целью настоящей работы было исследование функции шапероноподобного 65К белка ВЖС и отработка мсгодов его иммунологической диагностики в растениях. В ходе исследования решались следующие задачи:
получение мышиных моноклинальных антител (МА) к 65К, и проверка их специфичности;
получение генетических конструкций на основе вектора с каулимовирусным 35S промотером, экспрессирующих полноразмерный белок 65К ВЖС и его N-концевой фрагмент для использования в экспериментах по комплементации транспортной функции потексвируса (X вируса картофеля, ХВК) in vivo;
получение химерных генетических конструкций на основе инфекционной кДНК гордеивируса штриховатой мозаики ячменя (ВШМЯ) РНК(?, в которых гены тройного блока (ТБГ) замещены геном 65К ВЖС;
исследование транспортной функции химерного (ВШМЯ/ВЖС) вируса в растениях Chenopodium.
Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей рабою впервые были получены высокоспецифические моноклональные антитела к С-концевому 13К фрагменту белка 65К ВЖС. Показано, что 65К ВЖС, экспрессироваипыи в клетках растений после их бомбардировки плазмидой с геном 65К под контролем 35S промотора, способен комплемеитировать функцию транспорта мутанта потексвируса. Получен химерный вирус ВШМЯ/ВЖС. способный к заражению и накоплению в растениях.
Результаты могут иметь практическое значение для дальнейшего изучения принципов функционирования вирусных ТБ и, в частности, транпортных белкос клостеровирусов.
Апробация работы. Диссертация была апробирована на совместное заседании кафедры вирусологии Биологического факультета МГУ и отделг биохимии вирусов растений НИИ физико-химической биологии им. А.Н Белозерского 16 марта 1998 г. Материалы исследований, представленных в работі докладывались на международных конференциях: "X International Congress о Virology", Иерусалим, Израиль 1996, "75 Years of Phytopathological and Resistanci Research in Aschersleben" Ашерслебен, Германия, 1995, на ПІ Российскол симпозиуме "Новые методы биотехнологии растений", Пущино, Россия, 1995.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 исчашых работ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из глав "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты и обсуждение", "Выводы", "Список литературы", список цитируемой литературы включает более 200 публикаций.