Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Что такое поведенческие реакции?
1.2. Определение понятия «агрессия»
1.3. Различные подходы к изучению агрессивного поведения .
1.3.1. Психогенетический подход
1.3.2. Поиск генетических ассоциаций .
1.3.3. Способы оценки агрессивного поведения
1.4. Механизмы формирования агрессивного поведения
1.4.1. Области мозга, вовлеченные в агрессию
1.4.2. Молекулярные механизмы контроля агрессии
1.4.2.1. Роль дофаминергической системы
1.4.2.2. Роль серотонинергической системы .
1.4.2.3. Роль других нейромедиаторов и гормонов
1.5. Молекулярно-генетические маркеры, ассоциированные с агрессивным поведением .
1.5.1. Молекулярно-генетические маркеры генов дофаминергической системы
1.5.2. Молекулярно-генетические маркеры генов серотонинергической системы
1.5.3. Другие молекулярно-генетические маркеры, ассоциированные с агрессивным поведением
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1. Материалы исследования .
Сбор биологических образцов
2.1.1. Характеристика объектов исследования
2.2. Методы исследования 67
2.2.1. Выделение геномной ДНК 67
2.2.2. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 68
2.2.3. Обработка ДНК с помощью эндонуклеаз рестрикции 70
2.2.4. Электрофорез ДНК в агарозном геле 71
2.2.5. Фрагментный анализ ДНК 75
2.2.6. Клонирование и секвенирование ДНК 75
2.2.7. Статистическая обработка полученных данных 76
Глава 3. Результаты исследований 77
3.1. Анализ аллельного полиморфизма генов дофаминергической системы 77
3.1.1. Ген дофаминого транспортера SLC6A3 (локус DAT1-VNTR) 77
3.1.2. Ген дофаминого рецептора второго типа DRD2 (локус rs1800497) 80
3.1.3. Ген дофаминого рецептора четвертого типа DRD4 (локусы DRD4 120bp INS и DRD4exonIII) 81
3.1.4. Ген катехол-О-метилтрансферазы COMT (локус rs4680) 83
3.2. Анализ аллельного полиморфизма генов серотонинергической системы 84
3.2.1. Ген серотонинового транспортера SLC6A4 (локусы 5-HTTLPR, rs25531 и STin2) 84
3.2.2. Ген серотонинового рецептора первого типа А HTR1A (локус rs6295) 89
3.2.3. Ген серотонинового рецептора второго типа А HTR2A (локус rs6311) 91
3.2.4. Ген серотонинового рецептора первого типа B HTR1B (локус rs6296) 92
3.2.5. Ген моноаминоксидазы А МАОА (локус MAOA-uVNTR) 93
3.3. Ген андрогенового рецептора AR (локус AR (CAG)n)... 94
3.4. Ген окситоцинового рецептора OXTR (локус rs53576) 95
3.5. Анализ ассоциаций полиморфных локусов изучаемых генов с показателями различных форм агрессивного поведения 97
Глава 4. Обсуждение результатов 107
Выводы 117
Список литературы .
- Способы оценки агрессивного поведения
- Характеристика объектов исследования
- Ген дофаминого рецептора второго типа DRD2 (локус rs1800497)
- Ген андрогенового рецептора AR (локус AR (CAG)n)...
Введение к работе
Актуальность проблемы. Наша многогранная жизнь включает различные поведенческие реакции, такие как защита партнера, забота о потомстве, ритуальное поведение, агрессия, а также альтруизм. В последние десятилетия проблема человеческой агрессии привлекает все большее внимание ученых, потому что в повседневной жизни человек, так или иначе, сталкивается с различными формами агрессивного поведения. Об уровне агрессии позволяет судить целый ряд методик, программ и тестов. Одной из популярных в настоящее время методик для исследования легитимированной агрессии в различных социальных группах является опросник Басса-Перри, где агрессия оценивается по четырем шкалам: физическая, вербальная агрессия, гнев и враждебность (Buss and Perry, 1992). Благодаря использованию близнецовых и семейных методов исследований удалось установить, что агрессия с одной стороны является социально обусловленной, с другой стороны индивидуальные различия агрессивности в существенной степени (около 40%) обусловлены генетическими факторами (Craig and Halton, 2009). Поэтому популярный в последние два десятилетия поиск генетических ассоциаций стал одной из самых важных стратегий по выявлению генов, вносящих свой вклад в формирование сложных черт личности и поведения человека. По имеющимся данным гены нейромедиаторных систем (дофаминергической, серотонинергической), экспрессия которых обеспечивает работу нервных цепей миндалины, играют ключевую роль в формировании индивидуальных особенностей агрессивности (Trainor et al., 2009; Skuse et al., 2009). Также показано, что некоторые стероидные гормоны (например, андрогены), а также окситоцин могут изменять уровень агрессивности индивида (Archer, 2006; Fetissov et al., 2006; Lee et al., 2009). Ранее исследования молекулярно-генетических основ агрессивного поведения проводились в группах лиц с патологическим агрессивным поведением (осужденных за совершение насильственных преступлений) (Гайсина и др., 2004; Kulikova et al., 2008; Zai et al., 2012), лиц с психическими расстройствами (Hessl et al., 2008; Kolevzon et al., 2014; Wu et al., 2013) или совершивших попытки суицида (Гайсина и др., 2008; Gaysina et al., 2006; Murphy et al., 2011), а также в группах спортсменов (Малюченко и др., 2007). Генетический полиморфизм генов-маркеров, определяющий разнообразие форм агрессивного поведения в пределах нормы, в традиционных обществах до сих пор остается практически не изученным.
Цель и задачи исследований. Цель настоящей работы состояла в оценке аллельного полиморфизма генов нейромедиаторных (дофаминергической и серотонинергической) и эндокринных (андрогеновой и окситоциновой) систем у представителей взрослой мужской части африканских популяций хадза и датога, выявлении межпопуляционных различий и определении аллелей и генотипов, ассоциированных с агрессивным поведением.
Для выполнения этой цели были поставлены следующие задачи:
-
Определить геномную вариабельность пяти локусов четырех генов дофаминергической системы (DRD2, DRD4, SLC6A3, COMT), шести локусов пяти генов серотонинергической системы (HTR1A, HTR2A, HTR1B, SLC6A4, MAOA), а также двух локусов генов андрогенового (AR) и окситоцинового (OXTR) рецепторов в выборках мужчин хадза и датога;
-
Провести сравнение популяционно–генетических характеристик у представителей хадза и датога;
-
Установить нуклеотидную последовательность новых аллельных вариантов исследованных локусов, выявленных у представителей хадза и датога;
-
Выявить взаимосвязь между аллельными вариантами и/или генотипами изучаемых генов и поведенческими характеристиками в выборках хадза и датога.
Научная новизна. Данное исследование является уникальным с позиции выбранной модельной системы и комплексного изучения генетических и поведенческих характеристик представителей традиционных культур. Впервые была проведена популяционно–генетическая характеристика мужчин хадза и датога по 13 полиморфным локусам 11 генов нейромедиаторных и эндокринных систем, выявлены межпопуляционные различия по генетическим параметрам и с помощью корреляционного и дисперсионного анализа установлена взаимосвязь между отдельными аллелями и/или генотипами и поведенческими характеристиками мужчин хадза и датога по данным опросника Басса-Перри.
Теоритическое и практическое значение работы. Полученные данные представляют интерес для понимания молекулярно-генетических основ агрессивного поведения и могут быть использованы в дальнейшем при исследовании других этносов и популяций, выборочных групп и отдельных индивидов, а также для создания комплексной методики по выявлению предрасположенности и психокоррекции агрессивного поведения у детей на ранних стадиях развития, а также оптимизации профотбора взрослых в силовые структуры и для работы в экстремальных условиях.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Геномный полиморфизм хадза и датога характеризуется наличием как уже известных для других популяций, так и новых структурных вариантов изученных генов;
-
По ряду изученных локусов получены генетические параметры, позволяющие дифференцировать популяции хадза и датога;
-
Существуют достоверные ассоциации ряда аллелей и/или генотипов генов дофаминергической, серотонинергической и эндокринной систем с различными формами агрессивного поведения у мужчин хадза и датога;
Степень обоснованности и достоверности результатов. Работа выполнена на высоком методическом уровне; научные результаты, изложенные в диссертационной работе, основаны на
экспериментальных данных, полученных с использованием современных молекулярно-генетических методических подходов и методов статистической обработки данных. Выводы, полученные в ходе работы, обоснованы и соответствуют целям и задачам исследования.
Личный вклад соискателя. Представленная диссертационная работа является результатом 4-х летних научных исследований автора. Экспериментальная часть работы, которая включала выделение ДНК из образцов буккального эпителия, генотипирование 12 локусов 10 генов дофаминергической, серотонинергической и окситоциновой систем, а также попарные сравнения распределений частот аллелей и генотипов всех изученных генов в выборках выполнены лично соискателем. Анализ одного локуса гена AR (ПЦР-амплификация и фрагментный анализ) выполнял Д.В. Шибалёв. Популяционно-генетическая характеристика представителей хадза и датога, которая включала расчёт индексов гетерозиготности и коэффициентов Райта, а также проверку соответствия равновесия Харди-Вайнберга, проводилась совместно с О.Е. Лазебным. Анализ ассоциаций аллелей и/или генотипов с поведенческими характеристиками проводился совместно с О.Е. Лазебным и А.С. Гуляевым. Биологические образцы (клетки буккального эпителия) и данные по количественным признакам, включая данные опросника Басса-Перри, предоставлены М.Л. Бутовской. Подготовка статей на основе анализа данных проводилась в совместной работе со всеми соавторами.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на конференциях: XIII Международная зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 7-10 февраля 2011 года); 23rd Annual Conference of Human Behavior and Evolution Society (France, Montpellier, June 29 – July 3, 2011); The 4th International IMBG Conference for young Scientists “Molecular Biology: Advances and Perspectives” (Украина, Киев, 14-17 сентября 2011 года); Ломоносов – 2012: XIX Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых: Секция «Биология» (Москва, 9-13 апреля 2012 года); XXth ISRA World Meeting 2012 at the University of Luxemburg (Luxemburg, July 17 – 21, 2012); Международная научная конференция «Хромосома 2012» (Новосибирск, 2-7 сентября 2012 года); XXVI Зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 10-14 февраля 2014 года); VI съезд ВОГиС и ассоциированных генетических симпозиумов (Ростов-на-Дону, 15-20 июня 2014 года); 19th Congress of the European Anthropological Association (Москва, 25-29 августа 2014 года); XXVII Зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 9-12 февраля 2015 года); 19-ая Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 20-24 апреля 2015 года).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 17 печатных работ, в том числе 6 статей в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК, и 11 тезисов докладов.
Объем и структура диссертации. Диссертация включает введение, четыре главы, состоящие из обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждений, а также выводы и список цитируемой литературы. Список литературы включает 255 наименований, в том числе 11 отечественных, 238 иностранных и 6 электронных ресурсов. Работа изложена на 146 страницах, иллюстрирована 32 рисунками и содержит 21 таблицу.
Способы оценки агрессивного поведения
В настоящее время существует большое количество подходов к изучению агрессивного поведения. Тем не менее, все их разнообразие обычно сводят к двум основным типам – биологический (или биогенетический) и психологический.
По мнению сторонников психологического подхода, агрессивное поведение индивидуально и является результатом каких-либо врожденных или приобретенных особенностей психики человека. В основе данного направления лежит концепция психоанализа, разработанная З. Фрейдом, и фрустрационная теория Д. Доланда. Выдвинутое Фрейдом предположение о том, что агрессия - это инстинкт, действующий согласно принципу удовольствия, дало толчок для развития фрустрационной теории агрессии, согласно которой агрессия побуждается желанием преодолеть фрустрацию. Общим для психологических объяснений агрессии является положение о том, что агрессивного поведения можно избежать: вероятность его возникновения зависит от влияния множества способствующих и препятствующих агрессии факторов, связанных как с самой личностью, так и с внешней средой.
Ученые-сторонники биологического подхода большое внимание уделяют природе агрессивного поведения, врожденным механизмам, передающимся из поколения в поколение. Вследствие влияния естественного отбора возникает предрасположенность человека к агрессии. Согласно мнению К. Лоренца, основателя этологического подхода, агрессия развилась в ходе длительной эволюции, как врожденный инстинкт борьбы за выживание. Он полагал, что агрессивная энергия возникает в организме спонтанно, постоянно накапливаясь с течением времени, и в результате выплескивается наружу. Он утверждал, что агрессивная энергия может быть предотвращена благодаря участию в различных действиях, не связанных с причинением ущерба. Таким образом, можно снизить вероятность вспышек насилия. Сторонники социобиологического подхода утверждают, что такое явление, как агрессивность – способ получения своей доли ресурсов, и, в результате, это обеспечивает успех (на генетическом уровне) в естественном отборе. Опираясь на их идею, агрессивное поведение будет проявляться по отношению к тем организмам, у кого наименее вероятно наличие общих генов, то есть не к родственным организмам.
Нельзя утверждать, что за проявления агрессии ответственны только биологические или психологические факторы. Хотя в основе проявлений агрессии, безусловно, лежат биологические процессы, они находятся в зависимости от социальных и средовых процессов и тесно взаимодействуют с ними. Накопление знаний в области психологии и генетики привело к созданию такой пограничной области науки, как психогенетика. Психогенетика – междисциплинарная область знаний, предметом исследований которой является относительная роль и взаимодействие факторов наследственности и среды в формировании индивидуальных различий по психологическим и психофизиологическим признакам. (Равич-Щербо и др., 2000). Методология психогенетики, нацеленная на выявление влияния наследственности и окружающей среды на формирование индивидуальных психологических качеств, включает в себя следующие методы: генеалогический метод, метод приемных детей, метод близнецов, а также различные статистические методы.
Генеалогический метод, или метод исследования семей, основан на простой логике: если какой-либо признак кодируется в генах, то, чем ближе родство между людьми, тем более похожими друг на друга по данному признаку должны быть эти люди. Обязательным условием использования данного метода является наличие родственников первой степени родства, образующих так называемую нуклеарную («ядерную») семью; к ним относятся пары родитель - потомок и сиблинг - сиблинг. Чем больше поколений включает в себя генеалогическое древо и чем шире круг родственников, тем надежнее должны быть получаемые результаты. Однако разрешающая способность генеалогического метода очень невелика и не позволяет развести генетический и средовой компоненты дисперсии психологического признака.
Максимальной разрешающей способностью обладает метод приемных детей. В исследование включаются дети, максимально рано отданные на воспитание чужим людям-усыновителям, их биологические и приемные родители. С первыми дети имеют, как родственники I степени, в среднем 50% общих генов, но не имеют никакой общей среды; со вторыми, наоборот, имеют общую среду, но не имеют общих генов. Таким образом, сходство биологических родителей с их отданными на воспитание детьми дает достаточно надежную оценку наследуемости; сходство же усыновленных детей с приемными родителями оценивает средовой компонент дисперсии. Для контроля в исследование также включаются обычные семьи — биологические родители и их дети, живущие вместе.
Третьим важнейшим методом исследований является близнецовый. Существуют два типа близнецов — монозиготные (МЗ) и дизиготные (ДЗ). МЗ близнецы, развивающиеся из одной зиготы, имеют одинаковые наборы генов. ДЗ близнецы, развивающиеся из двух зигот, с генетической точки зрения являются сиблингами и имеют в среднем 50% общих генов. При исследовании пар МЗ и ДЗ близнецов влияния одного фактора (среды) уравнены, что и позволяет выделить и оценить влияние второго фактора (наследственности). Заключение о наличии генетического компонента в изменчивости признака делают в том случае, если внутрипарное сходство МЗ близнецов надежно выше внутрипарного сходства ДЗ близнецов; их относительное равенство говорит о средовой обусловленности изменчивости. Данные, полученные на близнецовой выборке, необходимо сопоставлять с такими же данными, полученными на выборке одиночно рожденных. Отсутствие статистически значимых различий между ними будет говорить о том, что выборка близнецов репрезентативна популяции одиночно рожденных людей того же возраста. В настоящее время близнецовый метод широко используется при исследовании относительного влияния генетических и средовых факторов на различные формы социального поведения, в том числе и агрессивного (рис. 1 и 2).
Благодаря использованию близнецовых и семейных методов исследований удалось установить, что индивидуальные различия агрессивности в существенной степени (около 40%) обусловлены генетическими факторами (Craig and Halton, 2009). В то время как общесемейная среда играет относительно небольшую роль (не более 20%) в формировании индивидуальных различий по агрессивному поведению, уникальные средовые компоненты объясняют также около 40% различий (рис. 2). Примечательно то, что близнецовый метод позволяет лишь в целом произвести оценку наследуемости, но ни число генов, ни эффект каждого конкретного гена при этом не могут быть выявлены.
Характеристика объектов исследования
Исследования тканей головного мозга post mortem показали, что концентрация ГАМК и декарбоксилазы аминомасляной кислоты, фермента, участвующего в синтезе ГАМК, снижается в полосатом теле и обонятельном бугорке у мышей и крыс, демонстрирующих агрессивное поведение (Clement et al., 1987). Эти данные свидетельствуют о тормозящей проявления агрессии роли ГАМК (Miczek and Fish, 2005). Аллостерические модуляторы ГАМКА-рецепторов, такие как бензодиазепины, барбитураты и аллопрегнанолон, влияют на уровень агрессии у грызунов в зависимости от дозы: умеренные дозы провоцируют агрессию, в то время как малые или большие дозы снижают агрессивное поведение (Miczek et al., 2002). Стимулирующее агрессию действие алкоголя возможно также обусловлено аллостерическими модуляциями ГАМКA-рецепторов: алкоголь увеличивает продолжительность и частоту открытия Cl- -ионных каналов (Miczek et al., 2002). Агонисты ГАМК-рецепторов также снижают агрессию у большинства людей, по-видимому, оказывая общее тормозящее действие на ЦНС. Однако есть данные, что малые и большие дозы бензодиазепинов иногда провоцируют агрессивное поведение у некоторых пациентов. Индивидуальные различия в проявлении агрессии в ответ на прием алкоголя или бензодиазепинов, вероятно, обусловлены сложной структурной организацией ГАМКА-рецепторов. В их состав могут входить субъединицы различных семей: -, - или -субъединицы (Miczek et al., 2002).
Ацетилхолин Нарушения холинергической передачи возбуждения приводят к гиперреактивности подкорковых лимбических областей мозга и дисфории, которая характеризуется мрачной раздражительностью, чувством неприязни к окружающим и проявлениями агрессии. Ингибитор ацетилхолинэстеразы, физостигмин, усиливает депрессивные проявления у пациентов с диагнозом общее аффективное расстройство и пограничное расстройство личности (Steinberg et al., 1997). Норадреналин
Любая стрессовая ситуация сопровождается выбросом норадреналина в организме. Есть данные, указывающие на то, что норадренергическая нейротрансмиссия способствует проявлениям агрессии (Miczek and Fish, 2005). – и – адренергические рецепторы по-разному влияют на агрессивное поведение. Так, например, клинические исследования показали, что пропранолол, блокатор постсинаптических – рецепторов, подавляет агрессивные проявления (Miczek and Fish, 2005). Было показано, что агонисты и антагонисты 2 – рецепторов вызывают сходную поведенческую реакцию: низкие дозы повышают агрессивность, а высокие - снижают. По-видимому, это объясняется особенностями локализации и характером действия данного типа рецепторов: они могут располагаться как пресинаптически, так и постсинаптически (Haller and Kruk, 2006). Препараты, подавляющие норадренергическую нейротрансмиссию, такие как агонисты 2 – рецепторов и блокаторы – рецепторов, используются для лечения агрессии, вызванной гипервозбуждением, у детей. Наконец, существенную роль норадреналина в формировании агрессивного поведения подтверждают эксперименты по нокауту гена дофамин-бета-гидроксилазы (DBH), ответственного за синтез норадреналина. Нокаутные по данному гену мыши характеризуются сниженными показателями агрессии, однако нормальной реакцией на стрессовые воздействия (Marino et al., 2005).
Некоторые классы стероидных гормонов (например, андрогены и эстрогены) могут влиять на агрессию. Согласно данным, полученным в экспериментах с животными, кастрация, снижающая уровень андрогенов в крови, уменьшает агрессию самцов у многих видов. Андрогены способны активировать агрессивное поведение: кроме формирования мужского паттерна поведения, андрогеновые рецепторы способствуют формированию модели поведения детнышей, которые в игре друг с другом обучаются навыкам отражения атак и нападения (Field et al., 2006). С упомянутыми выше данными хорошо согласуется тот факт, что самцы мышей, несущие спонтанные мутации, инактивирующие андрогеновые рецепторы, не агрессивны (Siegel et al., 1999). Несмотря на то, что есть убедительные доказательства причинно-следственной взаимосвязи между уровнем тестостерона и агрессией у животных, результаты исследований человека неоднозначны. Положительная взаимосвязь между тестостероном и агрессией выявляется при измерении уровня тестостерона в условиях конкурентного взаимодействия. Согласно теории конкуренции, повышение уровня тестостерона у мужчины происходит в ответ на сексуальное возбуждение или в условиях полового соревнования. При этом выброс тестостерона в условиях полового соревнования увеличивает агрессию. Чем выше уровень тестостерона, тем выше агрессивное доминирование мужчины. Кроме того уровень тестостерона ассоциирован с альтернативными стратегиями выживания. Показано, что для мужчин имеющих собственных детей, характерен сниженный уровень тестостерона. Возникает вопрос, применима ли теория конкуренции к женщинам. Исследования показывают, что в условиях соревновательных ситуаций у женщин также может повышаться уровень тестостерона и что женщины демонстрируют аналогичные корреляции между уровнем тестостерона и такими личностными характеристиками, как агрессивность и доминирование. Эти характеристики должны, как правило, помогать им в условиях конкуренции с другими женщинами (Archer, 2006).
Уровень эстрогенов в организме также может влиять на агрессивное поведение. У самок мышей, нокаутных по гену, кодирующему -изоформу эстрогенового рецептора (ERKO), повышается уровень агрессии по отношению к другим самкам. ERKO самцы, напротив, демонстрируют снижение агрессии в некоторых экспериментальных условиях (Ogawa et al., 1997; Ogawa et al., 1998). Однако, нокаутные по -изоформе самцы (ERKO) характеризуются нормальным или повышенным уровнем агрессивности в зависимости от ситуации (Ogawa et al., 1999; Ogawa et al., 2000). Влияние эстрогеновых рецепторов на развитие тревожного поведения было показано как на модельных животных (Walf et al., 2008; Walf and Frye, 2010), так и в исследованиях ассоциаций аллельных вариантов ESR1 с чертами импульсивности у человека (Comings et al., 1999; Westberg et al., 2003).
Аргинин-вазопрессин Многочисленные исследования природы социального поведения модельных животных доказывают вовлеченность высоко консервативного нейропептида аргинин-вазопрессина в формирование как аффилиативного, так и агрессивного поведения ( Donaldson and Young, 2008). Так, например, было установлено, что у полвок высокая плотность нейронов передней области гипоталамуса, содержащих вазопрессин, ассоциирована с высокими показателями внутривидовой агрессии (Gobrogge et al., 2007). В других исследованиях было показано, что мыши, нокаутные по гену аргинин-вазопрессинового рецептора типа 1b (AVPR1B), характеризуются снижением данного типа агрессии (Wersinger et al., 2007). Кроме того есть данные о положительной корреляции между концентрацией аргинин-вазопрессина в спинномозговой жидкости и случаями проявления агрессии у больных с диагнозом расстройство личности (Coccaro et al., 1998). По-видимому, механизм действия данного нейропептида варьирует у представителей разных полов. Интраназальное введение вазопрессина вызывало напряжение мимических мышц у мужчин (хмурое выражение лица) при демонстрации нейтральных мужских лиц, в то время как у женщин напротив стимулировало положительные эмоции в ответ на демонстрацию нейтральных женских лиц (Thompson et al., 2006).
Ген дофаминого рецептора второго типа DRD2 (локус rs1800497)
В промоторном регионе гена SLC6A4 обнаружены два функционально значимых полиморфизма по типу VNTR (локус 5HTTLPR) и SNP (локус rs25531), комбинацию которых можно рассматривать как трехаллельный локус (Heils et al., 1996; Hu et al., 2006; Wendland et al., 2006). Кроме того в интроне 2 гена SLC6A4 описан полиморфизм, обусловленный вариациями числа тандемно повторяющихся звеньев размером 16-17 п.н. (локус STin2) (Fiskerstrand et al., 1999). Распределение частот аллелей и генотипов по полиморфным локусам 5HTTLPR, rs25531 и STin2 гена SLC6A4 в исследуемых выборках представлено в таблицах 11 и 12. Распределение частот генотипов комбинированного локуса 5HTTLPR+rs25531 в выборке датога соответствует равновесному состоянию, однако у хадза наблюдается отклонение от состояния равновесия. Обе выборки по локусу STin2 находятся в равновесном состоянии (табл. 19). Анализ полиморфных вариантов локуса 5HTTLPR выявил в обеих выборках три типа аллельных вариантов (S, L, xL) (табл. 11). Частоты аллелей и генотипов локуса 5HTTLPR оказались сходными в обеих выборках. Достоверных различий между хадза и датога по данному локусу выявлено не было (p=0.155, сравнение частот аллелей; p=0.133, сравнение частот генотипов). Однако анализ полиморфных вариантов локуса rs25531 в выборках хадза и датога выявил значимые различия в частотах распределения аллелей (p=0.001) и генотипов (p=0.003) между ними. Кроме того, данный полиморфизм позволил провести дополнительное разделение L-аллеля на транскрипционно активную форму La и слабоактивную форму Lg. Наибольшая доля приходится на аллель La: 0.588 – у хадза и 0.614 – у датога. Частота аллеля Lg составила 0.210 и 0.127, соответственно, а частота аллеля Sa – 0.197 и 0.250, соответственно. Частота аллеля xL в обеих выборках не превышает 0.009. Частоты генотипов у хадза составили: La/La – 0.303, La/Lg – 0.289, Lg/Lg – 0.051, La/Sa – 0.273, Lg/Sa – 0.030, Sa/Sa – 0.045. У датога частоты генотипов равны: La/La – 0.379, La/Lg – 0.129, Lg/Lg – 0.026, La/Sa – 0.332, Lg/Sa – 0.070, Sa/Sa – 0.047. Доля генотипов, содержащих аллель xL, не превышает 0.017 в исследованных выборках. Сравнительный анализ распределений частот аллелей и генотипов комбинации этих двух полиморфных локусов 5HTTLPR+rs25531 показал достоверные различия между хадза и датога (p=0.009 и p=0.011, соответственно). У хадза по сравнению с датога наблюдается снижение частоты активного аллеля Lа и увеличение частоты менее активного Lg. Однако, значение коэффициента фиксации Райта (FST = 0.007) свидетельствует об отсутствии дифференциации хадза и датога по данному локусу. Рисунок 25. Схема структурной организации промоторной области аллельных вариантов локуса 5HTTLPR гена SLC6A4 у представителей хадза и датога.
Было проведено секвенирование нуклеотидных последовательностей S- и L-аллелей локуса 5HTTLPR, которое показало, что они состоят из 14 и 16 повторов, соответственно (рис. 25). Секвенирование нуклеотидных последовательностей третьего сверхдлинного аллельного варианта xL показало, что данный аллель у хадза и датога длиннее L-аллеля за счет вставки длиной 85 п.н., состоящей из четырех повторяющихся единиц и расположенной между восьмым и девятым повторами. Нуклеотидный состав вставок был идентичен нуклеотидному составу определенных повторов S- и L-аллелей, однако вставки имели разную структуру у представителей хадза и датога. У хадза первый повтор вставки соответствует нуклеотидной последовательности девятого повтора, а у датога – седьмого, остальные повторы вставок одинаковы в обоих случаях и соответствуют нуклеотидным последовательностям шестого, седьмого и восьмого повторов (рис. 25).
Анализ полиморфных вариантов локуса STin2 выявил в обеих выборках три типа аллелей, содержащих 8, 10 и 12 повторов (табл. 12). Ранее было показано, что у представителей различных популяций мира встречаются всего четыре аллельных варианта – 9R, 10R, 11R и 12R. Таким образом, нами впервые у африканцев был детектирован аллельный вариант с восемью повторами. В обеих выборках преобладает 12R-аллель, частота которого у хадза достигает 0.711, а у датога – 0.746. Частота 10R-аллеля у хадза составляет 0.286, у датога – 0.239, а частота 8R-аллеля не превышает 0.015 в обеих выборках. Распределение генотипов данного локуса также оказалось сходным в исследуемых выборках. У хадза частота генотипов составила: 12/12 – 0.521, 10/12 – 0.375, 10/10 – 0,099, а у датога: 12/12 – 0.574, 10/12 – 0.326, 10/10 – 0,070. Частота генотипов, содержащих 8R-аллель, не превышала 0.005 у хадза и 0.030 у датога. Достоверных различий в распределениях частот аллелей и генотипов между хадза и датога по данному локусу выявлено не было (p=0.061 и р=0.053, соответственно). Значение коэффициента фиксации Райта (FST = 0.002) также свидетельствует об отсутствии дифференциации хадза и датога по данному локусу.
Также было проведено секвенирование нуклеотидных последовательностей всех аллельных вариантов STin2, выявленных у индивидов хадза и датога, которое обнаружило в составе аллельных вариантов 7 типов повторяющихся единиц (A-G), описанных ранее в других популяциях (Battersby et al., 1996). Все полученные нуклеотидные последовательности были размещены в международной базе данных NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) (KF719973, KF719974, KF719975). Впервые выявленный у хадза и датога 8R-аллель оказался короче 10R-аллеля на 33 н.п. за счет делеции D и G повторов в 3 участке вариабельного кластера. В свою очередь 10R-аллель также оказался короче 12R-аллеля за счет такой же делеции D и G повторов (рис. 26).
Полиморфизм гена HTR1A обусловлен SNP по типу трансверсии в промоторном регионе (локус rs6295) (Lemonde et al., 2003). Данные по распределению частот аллелей и генотипов данного локуса у представителей хадза и датога представлены в таблице 13. Согласно результатам теста на соответствие равновесию Харди-Вайнберга обе выборки находятся в состоянии равновесия (табл. 19). В выборке хадза преобладающим является G-аллель с частотой 0.779, частота С-аллеля равна 0.221. У датога G-аллель обнаружен с частотой 0.468, а С-аллель – с частотой 0.532. Среди представителей хадза преобладает гомозиготный генотип G/G с частотой 0.590. Частота других генотипов составляет: C/G – 0.379, C/C – 0.031. Среди представителей датога преобладает гетерозиготный генотип с частотой 0.487. Частота других генотипов составляет: С/С – 0.289, G/G – 0/224. Сравнительный анализ распределений частот аллелей и генотипов показал достоверные различия между хадза и датога (p 0.001). Частота G-аллеля повышена у индивидов хадза по сравнению с индивидами датога (0.779 и 0.468, соответственно). Также в выборке хадза наблюдается превышение доли гомозигот G/G по сравнению с датога (0.590 и 0.224, соответственно). Значение коэффициента фиксации Райта (FST = 0.176) свидетельствует о сильной дифференциации хадза и датога по данному локусу.
Ген андрогенового рецептора AR (локус AR (CAG)n)...
В нашем исследовании было показано, что у мужчин хадза по сравнению с датога наблюдается снижение частоты активного аллеля Lа комбинации двух полиморфных локусов 5HTTLPR+rs25531 и увеличение частоты менее активного аллеля Lg. При этом в обеих выборках наблюдается характерная для других африканцев тенденция к преобладанию транскрипционно активной формы Lа и снижению частот менее активных форм Lg и Sa (Murdoch et al, 2013). Проведнный в данном исследовании анализ показал, что у мужчин вне зависимости от этнической принадлежности с уменьшением функциональной активности генотипов в ряду LaLa- LaSa, LaLg- LgLg, LgSa, SaSa понижается суммарный средний балл враждебности и общей агрессии. Эти данные хорошо согласуются с результатами более ранних исследований, указывающими на то, что носители L-аллелей чаще проявляют агрессию и не способны ее контролировать (Малюченко и др., 2007). Также имеются данные об ассоциации L-аллеля и/или генотипа L/L с агрессивным поведением при различных нейродегенеративных заболеваниях (Sukonick et al., 2001; Hessl et al., 2008) и психических расстройствах (Kolevzon et al, 2014). Проведенное нами секвенирование нуклеотидных последовательностей S- и L-аллелей локуса 5HTTLPR не выявило отличий структуры данных аллелей у представителей хадза и датога по сравнению с описанной ранее (Heils et al., 1996; Hu et al, 2006). Сверхдлинный аллельный вариант xL у хадза и датога оказался длиннее L-аллеля за счет вставки длиной 85 п.н., состоящей из четырех повторяющихся единиц и расположенной между восьмым и девятым повторами. Нуклеотидный состав вставок был идентичен нуклеотидному составу определенных повторов S- и L-аллелей, однако вставки имели разную структуру у представителей хадза и датога. Выяснение возможной роли различий первичной структуры xL-аллеля в изменении транскрипционной активности данного аллеля у хадза и датога требует дальнейших исследований. Наше исследование не выявило достоверных различий в распределениях частот аллелей и генотипов локуса STin2 между хадза и датога. Частоты аллелей данного локуса в исследованных выборках близки к таковым, наблюдаемым в выборках других африканских популяций (данные Alfred). Многочисленные работы указывают на взаимосвязь данного локуса с самонаправленным агрессивным поведением (De Lara et al., 2007; De Luca et al., 2006б), однако нам не удалось выявить его ассоциации с различными формами агрессии мужчин в исследованных выборках. Также нами было проведено секвенирование нуклеотидных последовательностей всех аллельных вариантов Stin2, выявленных у хадза и датога, которое обнаружило в их составе 7 типов повторяющихся единиц (A-G), описанных ранее (Battersby et al., 1996). Впервые выявленный у хадза и датога 8R-аллель оказался короче 10R-аллеля на 33 н.п. за счет делеции D и G повторов в 3 -участке вариабельного кластера. Представляется вероятным, что вариации в числе и типах повторов в интроне 2 гена SLC6A4 могут влиять на его функционирование.
В данном исследовании нам не удалось выявить достоверных различий в распределениях частот аллелей полиморфного локуса MAOA-uVNTR между мужчинами хадза и датога. Как и во многих популяциях мира, в исследуемых выборках преобладают аллельные варианты с 3 и 4 повторами. У мужчин хадза и датога частота низко активного 3R-аллеля выше частоты транскрипционно более активного 4R-аллеля. Отсутствие литературных данных по частотам аллелей не позволяет нам сравнить исследованные выборки с другими представителями Африки. Многочисленные исследования указывают на взаимосвязь коротких аллелей данного полиморфного локуса со склонностью к проявлению агрессии у мужчин, подвергавшихся жестокому обращению в детстве (Caspi et al., 2002; Foley et al., 2004; Huang et al., 2004б; Kim-Cohen et al., 2006; Frazzetto et al., 2007; Weder et al., 2009; Edwards et al., 2010). Однако для женщин показана обратная зависимость: наличие длинного аллеля в генотипе повышает риск совершения ими преступных действий (slund et al., 2011). Проведенный нами в каждой отдельно взятой и объединнной выборках анализ показал, что мужчины с длинными аллельными вариантами MAOA-uVNTR (4 и 5 повторов) вне зависимости от этнической принадлежности имеют более высокий уровень агрессии, чем их соплеменники с короткими аллелями (2 и 3 повтора). Отсутствие согласованности между нашими данными и полученными ранее другими исследователями требует дальнейших исследований локуса MAOA-uVNTR в выборке женщин хадза и датога.
В данном исследовании было показано, что мужчины хадза менее полиморфны по числу CAG-повторов гена AR (17-30), чем датога (15-34). Кроме того, генетическое разнообразие мужчин хадза по данному локусу также снижено по сравнению с другими африканскими популяциями, в том числе представителями ариаал (Восточная Африка) (15-34) (Campbell et al., 2009). Такая низкая вариабельность мужчин хадза, по-видимому, может быть обусловлена различиями численности популяций, выбранных для исследования. Мы зафиксировали отрицательную корреляцию между количеством CAG-повторов в гене AR и показателями враждебности и общей агрессии у мужчин датога и показателями гнева и общей агрессии у мужчин хадза. Возможно, данные этнические различия объясняются влиянием социальной среды, то есть различиями культурных факторов и истории исследованных популяций. Данные формы агрессии могут иметь разное приспособительное значение среди охотников-собирателей и скотоводов. Тем не менее, наши данные согласуются с выявленной ранее тенденцией к увеличению частоты аллелей с короткими кластерами CAG среди испытуемых с высокими показателями доминирования и агрессии (Jnsson et al., 2001).
Наше исследование показало достоверные различия в распределениях частот аллелей и генотипом локуса rs53576 гена OXTR между мужчинами хадза и датога. В обеих выборках преобладающим является G-аллель, его частота ниже у хадза, чем у датога. По сравнению с другими африканскими представителями, такими как ишан, йоруба, мандинка и менде (Западная Африка) (данные Ensembl), мужчины хадза и датога имеют самую низкую частоту G-аллеля. Кроме того у мужчин хадза частота гомозигот G/G ниже, а частота гетерозигот G/A выше, чем у датога. Частоты гомозигот А/А статистически значимо не отличаются у исследованных мужчин. По сравнению с другими африканскими представителями (данные Ensembl), мужчины хадза имеют самую высокую частоту гетерозиготного генотипа. Ранее было показано, что лица, гомозиготные по G-аллелю, в сравнении с индивидами с одной или двумя копиями А-аллеля показывают более высокий уровень сочувствия и склонны к проявлению просоциальности (альтруизма) (Rodrigues et al., 2009; Kogan et al., 2011). Наше исследование выявило ассоциацию данного локуса с показателями гнева в выборке мужчин хадза. Группа гомозигот G/G характеризовалась более низким средним баллом гнева, чем гетерозиготы. Средний балл группы гомозигот А/А с учетом стандартной ошибки не отличался от среднего балла группы гомозигот G/G. Предполагается, что гипофункция окситоциновой системы, при которой наблюдается снижение склонности индивида к альтруизму, предрасполагает его к агрессивному поведению (Fetissov et al., 2006). Таким образом, наши данные согласуются с предположением, что гомозиготный генотип G/G, являющийся маркером склонности к альтруизму, ассоциирован с более низким уровнем агрессии.
Суммируя, можно заключить, что наши данные, указывающие на существование взаимосвязи конкретных локусов генов нейромедиаторных и эндокринных систем с различными формами агрессии в выборках мужчин хадза и датога, представляют интерес для понимания молекулярно-генетических основ агрессивного поведения, могут быть использованы в исследовании других этносов и популяций, выборочных групп и отдельных индивидов, а также для разработки и апробации диагностической системы на предрасположенность человека к агрессивному поведению.