Содержание к диссертации
Введение
1. Общая характеристика работы 4
1.1. Актуальность 4
1.2. Цель и задачи исследования 7
1.3. Научная новизна работы 7
1.4. Апробация работы 8
1.5. Публикации 9
1.6. Структура и объем диссертации 9
2. Обзор литературы 10
2.1. Хроматин и эпигенетика 10
2.1.1. Эпигенетическая регуляция экспрессии генов 10
2.1.2. Состав и структура хроматина 11
2.1.3. Ковалентные модификации гистонов 14
2.1.4. Эпигенетическое наследование структуры хроматина . 15
2.2. Гетерохроматин 19
2.2.1. Общая характеристика и функции гетерохроматина 19
2.2.2. Гетерохроматиновый белок HP1 21
2.2.3. Формирование и поддержание структуры гетерохроматина..23
2.2.4. Гетерохроматин и транскрипция 26
2.3. Мозаичный эффект положения гена 31
2.3.1. Феномен мозаичного эффекта положения 31
2.3.2. Факторы, влияющие на эффект положения 33
2.3.3. Распространение эффекта положения 38
2.3.4. Транс-эффект положения 40
3. Материалы и методы исследования 46
3.1. Объекты исследования 46
3.2. Выделение РНК 46
3.3. Обратная транскрипция 47
3.4. Количественная полимеразная цепная реакция
3.5. Высокопроизводительное секвенирование РНК 49
3.6. Иммунопреципитация хроматина 50
3.7. Флуоресцентная гибридизация in situ и иммуноокрашивание 52
3.8. Сайт-направленный трансгенез 54
4. Результаты 56
4.1. Изменения транскрипции генов из района инверсии у взрослых мух и личинок 56
4.2. Анализ содержания белка HP1a в хроматине генов, демонстрирующих изменения транскрипции 60
4.3. Изменение транскрипции генов под влиянием цис-эффекта положения у куколок разных возрастов 61
4.4. Изменение расположения транс-инактивируемого и неинактивируемого участков гомологичной хромосомы в пространстве ядра под влиянием инверсии 63
4.5. Содержание гетерохроматинового белка HP1a в составе хроматина репортерных трансгенов в транс-инактивируемом районе 67
4.6. Влияние энхансера на транс-инактивацию репортерного трансгена 71
5. Обсуждение 75
6. Выводы 80
7. Список цитируемой литературы
- Цель и задачи исследования
- Эпигенетическое наследование структуры хроматина
- Количественная полимеразная цепная реакция
- Изменение транскрипции генов под влиянием цис-эффекта положения у куколок разных возрастов
Цель и задачи исследования
Основной целью данной работы было изучение характера нарушений экспрессии генов под влиянием гетерохроматина в инверсии In(2)A4 на разных стадиях онтогенеза, а также выяснение возможных причин неравномерности индуцируемой данной инверсией транс-инактивации. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
Анализ изменения экспрессии генов из района инверсии под влиянием эффекта положения у взрослых мух, личинок и куколок разных возрастов Оценка содержания гетерохроматинового белка HP1a в хроматине генов, демонстрирующих изменение в уровнях транскрипции Изучение изменений внутриядерного расположения транс-инактивируемого и неинактивируемого участков хромосомы Оценка обогащений гетерохроматиновым белком HP1a репортерных трансгенных конструкций из транс-инактивируемого района Создание при помощи сайт-направленного трансгенеза репортерных конструкций в заданных сайтах транс-инактивируемых участков хромосомы и проверка влияния энхансера на чувствительность трансгена mini-white к транс-инактивации
В работе была использована оригинальная генетическая модель, ранее полученная в Лаборатории биохимической генетики животных ИМГ РАН – хромосомная инверсия In(2)A4. Впервые с использованием полнотранскриптомного подхода при помощи высокопроизводительного секвенирования РНК (RNA-seq) был проведен подробный анализ изменения уровней транскрипции генов в окрестностях точек разрыва инверсии на разных стадиях онтогенеза, а также молекулярный анализ изменения характера обогащения хроматина исследуемых генов маркерными компонентами гетерохроматина. Установлено, что характер ответа индивидуального гена на влияние гетерохроматина может меняться в процессе онтогенеза. Впервые была обнаружена активация транскрипции эухроматиновых генов при гетерохроматиновом эффекте положения. Показано, что транс-инактивируемый участок хромосомы, в отличие от избегающей инактивации области (кластер гистоновых генов), перемещается в гетерохроматиновый компартмент ядра на фоне эффекта положения. Установлено, что отсутствует прямой перенос гетерохроматинового белка на транс-инактивируемую трансгенную конструкцию с гомологичной хромосомы-индуктора инактивации, что свидетельствует об автономном формировании гетерохроматиновой структуры хроматина инактивируемых генов. Впервые с использованием репортерных конструкций заданного состава, встроенных при помощи сайт-специфической интеграции в строго определенные локусы транс-инактивируемых участков хромосомы, показано супрессорное воздействие энхансера на способность гена к инактивации под влиянием гетерохроматина. Полученные результаты позволяют дополнить классическую модель влияния гетерохроматина на экспрессию генов при эффекте положения и выдвинуть предположение о генах как независимых точках индукции гетерохроматинизации, чувствительность которых к влиянию гетерохроматина динамически изменяется в процессе развития организма.
Результаты, полученные в данной работе, были представлены на следующих научных конференциях: «54th Annual Drosophila Research Conference» (Washington, USA, April 3-7, 2013), 17-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 21–26 апреля 2013 г.), XXVI Зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», (Москва, 10-14 февраля 2014 г.), VI Съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров (ВОГиС) и ассоциированные генетические симпозиумы (Ростов-на-Дону, 15-20 июня 2014 г.), VI Международная школа молодых ученых по молекулярной генетике «Геномика и системная биология» (Москва – Звенигород, 16-21 ноября 2014 г.), 19-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 20 - 24 апреля 2015 г.), XXVIII Зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», (Москва, 8-11 февраля 2016 г.).
Материал диссертации изложен на 101 странице машинописного текста, включает общую характеристику работы, обзор литературы, материалы и методы исследования, полученные результаты и их обсуждение, выводы, список цитируемой литературы, включающий 202 источника. Диссертация содержит 15 рисунков и одну таблицу.
Эпигенетическое наследование структуры хроматина
Описанная выше инактивация генов, распространяющаяся из разорванного блока гетерохроматина в эухроматиновые районы перестроенной хромосомы, характерна для цис-эффекта положения, однако в ряде случаев было обнаружено, что инактивация генов может переходить на гомологичную неперестроенную хромосому, это явление было названо транс-инактивацией. Механизм транс-инактивации может быть связан с тем, что в клетках дрозофилы гомологичные хромосомы находятся в состоянии физического контакта на протяжении всего клеточного цикла [12], что, в принципе, позволяет гомологичным участкам оказывать влияние друг на друга. Это предположение подтверждается тем фактом, что транс инактивация при эффекте положения возможна только при условии физического спаривания хромосом [79]. Транс-эффект положения – редкое явление, на данный момент достаточно подробно описано всего два подобных случая. Первым геном, для которого была обнаружена транс инактивация при эффекте положения, был локализованный в правом плече хромосомы 2 ген brown, кодирующий белок, принимающий участие в синтезе глазного пигмента. Было обнаружено, что мутантный аллель brown Dominant (bwD) может обусловливать мозаичную инактивацию нормальной версии гена brown (bw+) в гомологичной хромосоме [171]. Мутация bwD представляет собой инсерцию фрагмента гетерохроматина, образованного сателлитом AAGAG размером 1,6 м.п.о., в седьмой экзон гена brown [144], в результате которой экспрессия гена блокируется за счет нарушения открытой рамки считывания, а также индуцированной сателлитной последовательностью гетерохроматинизации локуса. Второй пример генетической модели, демонстрирующей транс-инактивацию при эффекте положения – инверсия In(2)A4 [1], в результате которой фрагмент прицентромерного гетерохроматина хромосомы 2 был перенесен в эухроматиновую область. Данная инверсия индуцирует мозаичный эффект положения, выражающийся как в цис-инактивации генов, расположенных в окрестностях точки разрыва блока гетерохроматина в этой хромосоме, так и в транс-инактивации генов, распложенных в соответствующем районе гомологичной неперестроенной хромосомы. Как и в случае цис-инактивации, транс-инактивация может распространяться неравномерно по мере удаления от индуцирующего ее гетерохроматина.
Так на системе brown-Dominant было показано [39], что степень транс-инактивации в целом обратно пропорционально зависит от расстояния по хромосомной карте между сайтом локализации bwD и сайтом встраивания репортерного трансгена на гомологичной хромосоме, но были обнаружены и примечательные исключения. Так трансген, расположенный дальше от локуса brown, мог демонстрировать транс-инактивацию, в то время как другой трансген, расположенный ближе, транс-инактивации не подвергался. Также было показано, что два трансгена, встроенные в один и тот же эндогенный ген на расстоянии всего 463 п.н. друг от друга, могут по-разному реагировать на инактивирующее влияние bwD. В случае системы In(2)A4 транс-инактивация репортерных трансгенов наблюдалась в районе размером около 520 т.п.н., в пределах которого был идентифицирован ряд областей, четко различимых по способности расположенных в них трансгенов подвергаться транс инактивации [1]. Так, в окрестностях кластера гистоновых генов транс инактивации не наблюдалось, в отличие от фланкирующих этот район участков хромосомы. Наряду с наличием крупных блоков, различающихся по способности к транс-инактивации, были обнаружены единичные случаи различной чувствительности трансгенов, расположенных в транс инактивируемом районе достаточно близко друг к другу, аналогично тому, что показано для bwD. Есть основания предполагать, что способность генов к транс-инактивации может зависеть от влияния цис-действующих регуляторных элементов генома. Возможно, что одинаковые трансгенные конструкции, расположенные на небольших расстояниях друг от друга, могут различаться по чувствительности к транс-инактивации в силу различного влияния близлежащих энхансеров и сайленсеров или локальной разницы в структуре хроматина. Также возможно, что в определении чувствительности гена к транс-инактивации могут играть роль последовательности, служащие для ассоциирования с определенными структурами ядра, что может облегчать затягивание инактивируемого гена в гетерохроматиновый компартмент, так могут иметь значение инсуляторы, формирующие петли, включающие относительно функционально обособленные домены генома. Если инсулятор около репортерного гена при формировании такой петли будет сближать данный ген с гетерохроматином, то вероятность сайленсинга увеличится. В случае системы brown-Dominant предполагалось наличие последовательности (transceiver element), расположенной в 5 области от кодирующей последовательности гена brown, и способной связывать инактивирующие факторы [79]; [51]; [115]. В случае контакта с гетерохроматином, репрессивные эпигенетические метки могут предотвратить его функцию, инактивируя регулируемый им ген. Еще одним фактором, способным обеспечить различную способность тех или иных локусов к транс-инактивации, может быть их различная организация в пространстве ядра. Внутриядерное положение транс-инактивируемых локусов может изменяться предположительно вследствие того, что гетерохроматиновый блок, расположенный в индуцирующей транс инактивацию хромосоме, ассоциируется с прочими гетерохроматиновыми участками хромосом в особой области ядра (гетерохроматиновый компартмент) и «тянет» за собой спаренный с ним гомологичный локус нормальной хромосомы, что приводит к гетерохроматинизации последнего. На обеих системах при помощи FISH было показано, что транс инактивируемые трансгены затягиваются в гетерохроматиновый компартмент [45]; [40]; [162]; [2], причем в части клеток затягивание обнаружено не было, что может объяснить причину мозаичности. Были установлены случаи затягивания гена в ГХ компартмент, не приводящие к инактивации, то есть такое затягивание – необходимое, но недостаточное условие транс-инактивации. На уровне отдельных клеток показана корреляция между транскрипционным статусом и пространственной организацией индивидуальных генов, подвергающихся транс-инактивации под влиянием bwD [76]. Установлено, что в субпопуляции клеток, демонстрирующих транс-инактивацию, имеет место перенос локуса, содержащего инактивируемый ген, в гетерохроматиновый компартмент. Блочный характер транс-инактивации, являющийся особенностью системы In(2)A4, может быть объяснен формированием при соматическом спаривании хромосом петли с особой архитектурой [2], что может способствовать неравномерному затягиванию локусов, расположенных в пределах инверсии, в гетерохроматиновый компартмент (рис. 7).
Количественная полимеразная цепная реакция
Личинок третьего возраста гомогенизировали притертым стеклянным пестиком в буфере A1 (60 mM KCl, 15 mM NaCl, 4 мМ MgCl2, 15 мМ HEPES (pH7,6), 0,5% Triton X-100, 0,5 мМ DTT) в присутствии ингибитора протеиназ EDTA-free cOmplete protease inhibitor cocktail (Roche) с содержанием 1,5% формальдегида для химической фиксации изучаемых компонентов хроматина. Фиксацию проводили 15 мин. при комнатной температуре и останавливали добавлением глицина до концентрации 225 мМ. Фиксированные образцы трехкратно промывали буфером A1 без формальдегида, после чего ресуспендировали в буфере для лизиса (140 мМ NaCl, 15 мМ HEPES pH 7,6, 1 мМ EDTA, 0,5 мМ EGTA, 1% Triton X-100, 0,1% дезоксихолата натрия) в присутствии ингибитора протеиназ с добавлением 0,1% SDS и 0,5% лаурилсаркозината натрия. Разрушение ядер и фрагментацию хроматина проводили путем обработки ультразвуком в микроцентрифужной пробирке в объеме 700 мкл с охлаждением во льду на приборе SONICS Vibra-Cell VCX 400. Использовали 30 циклов озвучки (10 сек работы прибора + 10 сек перерыв) при амплитуде 15-20. После озвучки неразрушенные фрагменты тканей осаждали центрифугированием (5 мин, 16000g), содержащую хроматин надосадочную жидкость отбирали для преципитации. Количество ДНК в полученных образцы хроматина измеряли на флуориметре Qubit 1.0 (Thermo Fisher Scientific) с использованием набора реактивов dsDNA BR Assay Kit. Образцы хроматина доводили буфером для лизиса до концентрации SDS 0,05%, для преципитации использовали раствор хроматина, содержащий 1 мкг ДНК. Для преципитации использовали антитела к HP1a (Covance) в разведении 1:200. Образцы хроматина инкубировали с антителами 3 часа на +4С. Для осаждения связанных антителами фрагментов хроматина после преципитации образцы инкубировали в ночь на +4C с суспензией в буфере для лизиса конъюгированного с нерастворимым полисахаридным носителем белка A (Protein A Sepharose CL-4B, GE Healthcare), который был предварительно забит БСА и дрожжевой тРНК для предотвращения неспецифического связывания компонентов хроматина. После инкубации образцы центрифугировали (3000G, 1 мин), осадок последовательно промывали стандартным буфером для лизиса, буфером для лизиса с содержанием 400 мМ NaCl и буфером TE pH8 для отмывки неспецифично связавшихся компонентов преципитационной смеси. После промывок преципитированные фрагменты хроматина последовательно элюировали с носителя буфером для элюции 1 (10 мМ EDTA, 1% SDS, 50 мМ Tris-Cl pH8) и буфером для элюции 2 (буфер TE pH8+0.67% SDS) путем инкубации в термошейкере (65C, 1050 rpm) с последующим осаждением (3000G, 1 мин.) и отбором надосадочной жидкости. Для устранения формальдегидных сшивок образцы преципитированного хроматина инкубировали в ночь на 65С. Для очистки ДНК образцы обрабатывали протеиназой K с последующей очисткой стандартным фенол-хлороформным методом и осаждением изопропанолом с использованием гликогена в качестве соосадителя. Количества преципитированных участков генома после очистки ДНК оценивали при помощи количественной ПЦР в реальном времени с праймерами к интересующим локусам. Для нормализации результатов использовали район генома 60D, не содержащий каких-либо функциональных элементов и заметных обогащений по компонентам хроматина согласно данным Modencode. К району были подобраны праймеры: прямой TTCCCCATCCTCGAGCCCTG, обратный CCAGCCGAGACGAGCACCATAAT. Показателем изменения содержания изучаемого белка в данном локусе под влиянием эффекта положения принимали отношение нормализованного количества преципитированной ДНК в опытном образце к таковому в контроле, достоверными считали разницы не менее 2 раз.
Комбинированную с иммуноокрашиванием на белок HP1 флуоресцентную гибридизацию ДНК in situ проводили в соответствии с ранее описанным протоколом [169]. Препараты для гибридизации приготавливали из имагинальных дисков и слюнных желез личинок третьего возраста генотипов A4/A12 (транс-инактивация) и гомозигот A12/A12 (контроль). Для детекции сателлита AACAC (маркер прицентромерного гетерохроматина хромосомы 2) использовали меченный биотином ДНК-зонд (Biot-(AACAC)x8). Зонды к транс-инактивируемому району 39AB и кластеру гистоновых генов были получены при помощи ПЦР длинных фрагментов (long-range PCR). Для амплификации гистонового кластера использовали праймеры: CGTCCGCTTCCCCAGTGG и CCTGAGCGATTTCACGCACCA, для амплификации транс-инактивируемого района использовали праймеры:
Зонд к транс-инактивируемому региону 39AB размером 25 т.п.н. метили DIG при помощи DIG DNA labelling mix (Roche), зонд к кластеру гистоновых генов метили путем включения нуклеотида, меченного флуорофором Cy5. Биотинилированный зонд детектировали при помощи стрептавидина, конъюгированного с флуоресцентным красителем Alexa 546 (Life technologies), а меченный DIG зонд – при помощи конъюгированных с FITC анти-DIG антител (Roche) и анти-FITC антител с флуоресцентным красителем Alexa 488 (Life technologies). Внутриядерное распределение белка HP1a (маркер гетерохроматинового компартмента ядра) детектировали при помощи антител, конъюгированных с флуоресцентной меткой Alexa 514. Для визуализации ядра ДНК интерфазных хромосом окрашивали при помощи DAPI. Образцы помещали в среду Slow Fade (Invitrogen). После окрашивания положение флуоресцентных меток определяли при помощи конфокального лазерного сканирующего микроскопа Carl Zeiss LSM510 Meta с использованием лазеров с длинами волн, необходимыми для возбуждения используемых флуоресцентных красителей: 405 нм (DAPI), 488 нм (Alexa 488), 514 нм (Alexa 514), 546 нм (Alexa 546) и 633 нм (Cy5). Визуализацию и анализ полученных трехмерных изображений проводили при помощи программного обеспечения Imaris. Для определения относительных количеств HP1a в районах внутриядерного расположения участков хромосом оценивали интенсивность флуоресцентного сигнала Alexa 514 в местах локализации сигналов от соответствующих зондов. За единицу принимали интенсивность сигнала от HP1a в районе локализации сателлита AACAC. Всего было проанализировано около сотни ядер каждого генотипа.
Изменение транскрипции генов под влиянием цис-эффекта положения у куколок разных возрастов
Особенностью инверсии A4 является ее способность одновременно с цис-влиянием на экспрессию прилежащих генов вызывать также транс инактивацию генов в гомологичной хромосоме. Проведенный ранее анализ транс-инактивации репортерных трансгенов, расположенных в разных сайтах гомологичной хромосомы, выявил неравномерный характер распространения транс-инактивации с увеличением расстояния по хромосомной карте от индуцирующего эффект положения гетерохроматина [2]. При этом значительный район хромосомы, включающий кластер гистоновых генов, избегал транс-инактивации, в то время как во фланкирующих областях она обнаруживалась. Полученные в рамках представленной работы данные показывают, что наличие таких протяженных участков хромосомы, отличающихся по способности к транс-инактивации под влиянием инверсии A4, обусловлено затягиванием инактивируемых участков в гетерохроматиновый компартмент ядра, при этом участок хромосомы, содержащий кластер гистоновых генов, остается вне гетерохроматинового компартмента и не подвергается инактивации. Такое поведение гистонового кластера может быть связано с тем, что он формирует особую внутриядерную структуру – Histone locus body [133]. Возможно, существуют механизмы, обеспечивающие определенную внутриядерную локализацию этой структуры, которые не позволяют кластеру гистоновых генов переместиться вместе с прилежащими участками хромосомы в гетерохроматиновый компартмент. Полученные результаты об изменении внутриядерного положения участков хромосом представляют интерес в свете современных данных о роли пространственной организации генома в регуляции его работы (см. [60]; [167]; [146]; [157]). Возможно, именно локальные особенности архитектуры тех или иных участков хромосомы могут объяснить различную чувствительность генов к влиянию гетерохроматина и обусловленную этим неравномерность распространения инактивации. Кроме того, изменение архитектуры генома в процессе дифференцировки клеток (см. [137]) могло бы быть одним из механизмов изменения чувствительности генов к влиянию гетерохроматина в процессе развития организма.
Попадающие в гетерохроматиновый компартмент репортерные трансгенные конструкции могут отличаться по чувствительности к влиянию гетерохроматина, так, исследованная конструкция 11127 обогащена белком HP1 и подвергается транс-инактивации, в то время как конструкция 20102 не связывает HP1 и не инактивируется. Несмотря на наблюдающуюся ассоциацию гомологичных участков хромосом, показано, что гетерохроматиновый белок не переходит напрямую на транс инактивируемую конструкцию с гомологичной хромосомы, индуцирующей инактивацию, что может свидетельствовать об автономном и независимом формировании транскрипционно-неактивной структуры хроматина трансгена, предположительно, за счет связывания компонентов гетерохроматина из гетерохроматинового компартмента ядра. Наличие энхансера предотвращало транс-инактивацию трансгена, что может свидетельствовать о снижении чувствительности к гетерохроматинизации.
Возможно, именно влияние регуляторных элементов, таких как энхансер, может определять онтогенетические изменения чувствительности гена к влиянию гетерохроматина. В связи с этим, имеет смысл изучить в контроле и на фоне транс-инактивации онтогенетические профили экспрессии трансгена без энхансера и сравнить с аналогичными профилями для трансгена под контролем энхансера, чтобы установить стадию развития, на которой влияние энхансера блокирует гетерохроматинизацию гена. Также представляет интерес вопрос о возможном влиянии энхансера на локальную архитектуру хромосомы, учитывая данные о физическом взаимодействии регуляторных элементов генома (см. [152]). Возможно, формирование комплекса энхансера с промотором экранирует ген от влияния гетерохроматина на определенной стадии развития, вместе с тем, могут иметь значение и другие регуляторные элементы. Поскольку установить весь спектр регуляторных элементов, контролирующих экспрессию эндогенных генов в онтогенезе, не всегда возможно, имеет смысл изучать влияние регуляторных элементов с ранее описанными функциями в модельной системе. Хорошим инструментом для решения этой задачи могут быть репортерные трансгенные конструкции заданного состава и локализации, методология создания которых была отработана в рамках представленной работы. Имеет смысл изучить обеспечиваемую тем или иным регуляторным элементом онтогенетическую динамику экспрессии и структуры хроматина репортерного гена в норме и на фоне транс-инактивации. Кроме того, имеющую место в ходе онтогенеза активацию гена можно смоделировать у взрослых мух при помощи трансгенных конструкций с управляемой при помощи внешнего сигнала транскрипцией. Это позволит изучить особенности влияния гетерохроматина на транскрипционный аппарат гена в контролируемых условиях, установить критическую для индукции гетерохроматинизации стадию и молекулярные механизмы этого процесса.