Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор 9
1.1 Краткая характеристика болезни Паркинсона 9
1.1.1 Эпидемиология болезни Паркинсона 9
1.1.2 Клинические признаки и нейропатологические изменения при болезни Паркинсона 10
1.2 Генетические факторы, вовлеченные в патогенез болезни Паркинсона 16
1.2.1 Гены аутосомно-доминантной формы болезни Паркинсона 18
1.2.2 Гены аутосомно-рецессивной формы болезни Паркинсона 23
1.2.3 Между семейной и спорадической формами болезни Паркинсона 26
1.2.4 Генетические факторы, принимающие участие в развитии спорадической формы болезни Паркинсона 28
1.2.5 Роль микроРНК в патогенезе болезни Паркинсона 29
1.2.6 Современное представление о молекулярно-генетических механизмах болезни Паркинсона 34
1.3 Различные модели болезни Паркинсона 38
1.3.1 Генетические модели болезни Паркинсона 38
1.3.2 Нейротоксические модели болезни Паркинсона 39
1.4 Анализ изменения транскриптома при болезни Паркинсона 48
2. Методы 54
2.1 Моделирование досимптомной и ранней симптомной стадий болезни Паркинсона с использованием МФТП 54
2.2. Характеристика анализируемых выборок 54
2.3 Выделение РНК из тканей 55
2.4 Полнотранскриптомный анализ тканей мозга мышей с токсической моделью болезни Паркинсона
2.5 Анализ экспрессии отдельных генов-кандидатов 56
2.6 Анализ уровней микроРНК в периферической крови пациентов с болезнью Паркинсона 58
2.7 Статистическая обработка результатов 59
3. Результаты и обсуждение 60
3.1 Транскриптомный анализ тканей мышей с МФТП индуцированной моделью досимптомной и ранней симптомной
стадий болезни Паркинсона 60
3.1.1 Полнотранскриптомный анализ тканей мозга мышей с МФТП-индуцированной моделью досимптомной и ранней симптомной стадий болезни Паркинсона 61
3.1.2 Анализ изменения экспрессии отдельных генов в тканях мышей с МФТП-индуцированной моделью досимптомной и ранней симптомной стадий болезни Паркинсона 66
3.2 Анализ периферической крови пациентов с болезнью Паркинсона 72
3.2.1 Исследуемые группы пациентов 72
3.2.2 Анализ изменения экспрессии отдельных генов в периферической крови пациентов с болезнью Паркинсона, находящихся на ранних стадиях заболевания 73
3.2.3 Анализ изменения экспрессии микроРНК в периферической крови пациентов с болезнью Паркинсона, находящихся на ранних стадиях заболевания 79
Заключение 83
Выводы 86
Список сокращений 88
Список литературы
- Генетические факторы, вовлеченные в патогенез болезни Паркинсона
- Нейротоксические модели болезни Паркинсона
- Полнотранскриптомный анализ тканей мозга мышей с токсической моделью болезни Паркинсона
- Анализ изменения экспрессии отдельных генов в тканях мышей с МФТП-индуцированной моделью досимптомной и ранней симптомной стадий болезни Паркинсона
Введение к работе
Актуальность проблемы
В настоящее время большое внимание уделяется изучению механизмов функционирования центральной нервной системы человека на всех уровнях организации - от молекулярного до всего организма в целом. При этом крайне важным является изучение нервной системы при развитии патологических процессов, так как подобный анализ позволит получить наиболее полную информацию о функционировании нервной системы в различных условиях и стать основой для формирования новых подходов к терапии наиболее распространенных неврологических заболеваний. К числу таких нейродегенеративных заболеваний относится болезнь Паркинсона. В среднем, частота встречаемости болезни Паркинсона составляет 1% в популяции лиц старше 60 лет, а в группе лиц старше 85 лет составляет не менее 4-5% населения. При этом в последнее время отмечается рост числа больных, страдающих данной патологией, а также снижение возраста начала заболевания.
Болезнь Паркинсона является сложным системным заболеванием и обусловлена нарушением функционирования различных нейромедиаторных систем с выраженным преобладанием недостаточности дофаминергической системы. Подобные нарушения приводят к дисбалансу медиаторов и дезорганизации деятельности мозга в целом. Нейродегенеративным процессам подвержен не только центральный, но и периферический отдел нервной системы. Таким образом, болезнь Паркинсона затрагивает практически все отделы нервной системы, что обуславливает сложную и клинически гетерогенную картину проявлений данного заболевания.
В настоящее время не вызывает сомнений, что важную роль в развитии болезни Паркинсона играют генетические факторы. На это, в первую очередь, указывает наличие семейных форм. Считается, что семейная форма заболевания составляет (по разным данным) от 10 до 20% от всех случаев болезни Паркинсона. У большинства больных развитие заболевания носит спорадический характер и определяется сложным взаимодействием между генетической конституцией организма и факторами внешней среды.
В настоящее время в геноме человека выявлено большое количество генов, так или иначе вовлеченных в патогенез данной патологии. Однако только для семи генов (SNCA, PARK2, PINK1, PARK7, LRRK2, АТР13А2, VSP35) точно определен характер наследования и выявлены мутации, приводящие к развитию моногенных форм болезни Паркинсона.
Также до сих пор остается не решенным окончательно вопрос о том, где начинаются процессы нейродегенерации - в соме нейрона или на его периферии, а также остается неизвестным, какие именно процессы запускают развитие патологического процесса.
Одним из подходов к поиску механизмов, связанных с развитием патологии, является изучение изменения транскриптома на самых ранних стадиях патогенеза. Известно, что характерной особенностью патогенеза болезни Паркинсона является хроническое и медленно прогрессирующее течение заболевания.
Одним из возможных путей для решения этой проблемы является изучение моделей, воспроизводящих самые ранние стадии болезни Паркинсона. Однако при этом необходимо учитывать, что ни одна из существующих моделей не является совершенной и не воспроизводит полностью все закономерности патогенеза болезни Паркинсона. Таким образом, наиболее оптимальным представляется параллельное изучение как моделей самых ранних стадий болезни Паркинсона, так и пациентов,
находящихся на ранних клинических стадиях заболевания. Такой комплексный подход позволит выявить механизмы, инициирующие процессы нейродегенерации при болезни Паркинсона.
Цель и задачи исследования:
Целью данной работы является изучение изменения экспрессии генов в процессе развития болезни Паркинсона и выявление новых транскриптомных маркеров заболевания.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
-
Полнотранскриптомный анализ тканей черной субстанции и стриатума мышей с МФТП-индуцированными моделями досимптомнои и ранней симптомной стадий БП. Отбор генов для дальнейшего анализа.
-
Детальный анализ изменения экспрессии отобранных генов в различных тканях мышей с МФТП-индуцированными моделями досимптомнои и ранней симптомной стадий БП.
-
Анализ изменения экспрессии генов, отобранных при изучении МФТП-индуцированных моделей БП, в периферической крови пациентов с БП, находящихся на самых ранних клинических стадиях развития заболевания.
-
Анализ изменения экспрессии генов, отобранных на основе литературных данных, в периферической крови пациентов с БП, находящихся на самых ранних клинических стадиях развития заболевания.
-
Анализ уровней различных микроРНК в периферической крови пациентов с БП, находящихся на самых ранних клинических стадиях развития заболевания.
Научная новизна и практическая значимость работы
В ходе работы впервые был проведен полнотранскриптомный анализ тканей стриатума и черной субстанции мышей с МФТП-индуцированными моделями досимптомнои и ранней симптомной стадий болезни Паркинсона. При этом было выявлено четыре кластера генов, непосредственно связанных с везикулярным транспортом. Эти данные свидетельствуют о важной роли нарушений везикулярного транспорта на ранних этапах нейродегенерации при болезни Паркинсона.
При анализе экспрессии отобранных по результатам полнотранскриптомного анализа генов Cplx2, Drd2, Ерп2, Ехос4, Ntrk2 и Snca было показано развитие компенсаторных процессов в теле нейрона на досимптомнои стадии заболевания.
Сравнительный анализ профилей экспрессии генов Cplx2, Drd2, Ерп2, Ехос4, Ntrk2 и Snca в черной субстанции и периферической крови выявил сходные изменения в уровнях мРНК данных генов у мышей с МФТП-индуцированными моделями болезни Паркинсона. Это подтверждает, что периферическая кровь может быть использована в диагностике ранних стадий болезни Паркинсона, а уровни мРНК генов в периферической крови могут рассматриваться в качестве биомаркеров нейродегенерации при болезни Паркинсона.
Проведен анализ изменения экспрессии генов ALDH1A1, АТР13А2, CPLX2, DRD2, EPN2, ЕХОС4, NTRK2, LRRK2, PARK2, PARK7, PDHB, PINK1, PPARGC1A, SNCA, WFS1 и ZNF746 в периферической крови пациентов, находящихся на ранних стадиях БП (1 и 2 стадии по шкале Хен и Яра). При этом впервые было выявлено резкое снижение уровня экспрессии гена PINK1 более чем в 4 раза в группе неврологического контроля и статистически значимое, специфическое для болезни Паркинсона и независимое от проводимой терапии увеличение экспрессии генов АТР13А2, PARK7 и
ZNF746. Данные гены могут рассматриваться в качестве потенциальных биомаркеров ранних стадий болезни Паркинсона.
При анализе уровней микроРНК впервые было установлено, что микроРНК MIR7, MIR9-5p, MIR9-3p, MIR129 и MIR132 высоко чувствительны к проводимой терапии у пациентов с болезнью Паркинсона и могут быть использованы в будущем в качестве биомаркеров эффективности проводимой терапии у пациентов с болезнью Паркинсона.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 17 печатных работ, из них 6 статей и
11 материалов симпозиумов и конференций.
Апробация диссертации
Результаты, полученные в данной работе, были представлены на Третьем всемирном конгрессе по болезни Паркинсона (3rd World Parkinson Congress, Монреаль, Канада), 2013 г., VI Съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (ВОГиС) и ассоциированных генетических симпозиумах (Ростов-на-Дону), 2014 г., Всероссийской конференции «Фундаментальные проблемы нейронаук: функциональная асимметрия, нейропластичность и нейродегенерация» (Москва), 2014 г. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на заседании Ученого совета ИМГ РАН 20 апреля 2015 г.
Структура и объем диссертации
Диссертация включает введение; обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследования и их обсуждение; выводы; библиографический указатель. Список литературы состоит из 280-ти источников, среди которых 4 источника отечественной и 276 источников зарубежной литературы. Материалы диссертации изложены на 129 страницах машинописного текста, содержат
12 таблиц, 13 рисунков и 2 приложения.
Генетические факторы, вовлеченные в патогенез болезни Паркинсона
БП является нейродегенеративным заболеванием, имеет неуклонно прогрессирующее течение и обусловлена гибелью, в первую очередь, дофаминергических нейронов (ДА-ергических нейронов) в черной субстанции, базальных ядрах и покрышке головного мозга. При этом в стриатуме наблюдается снижение уровня дофамина (ДА) (Nussbaum and Polymeropoulos 1997).
Установлено, что характерные для БП двигательные признаки появляются при гибели примерно 50-60% ДА-ергических нейронов в черной субстанции и снижении ДА в стриатуме на 70-80% (Bernheimer, Birkmayer, et al. 1973, Fowler 2007, Cookson, Hardy, et al. 2008). К классическим двигательным симптомам, на основе которых ставится диагноз БП, относятся: тремор в состоянии покоя, нарушение координации движений после сна (постуральная неустойчивость), снижение двигательной активности (гипокинезия) и ригидность скелетных мышц рук и лица (пластический гипертонус). Данные симптомы обычно проявляются асимметрично, начиная с одной половины тела, и с прогрессированием заболевания распространяются на другую половину (Weintraub, Cornelia, et al. 2008).
Также показано, что кроме ДА-ергических нейронов страдают нейроны норадренергической, серотонинергической и ацетилхолинергической систем (Lee and Liu 2008). Их гибель приводит к появлению немоторных симптомов. Так, у пациентов с БП наблюдается депрессия, нарушение сна, снижение внимания, памяти, работоспособности, аспонтанность и замедленность мыслительных процессов, на последних стадиях наблюдается деменция (Mayeux, Chen, et al. 1990, Burn 2002, Aarsland, Andersen, et al. 2003). Ha поздних стадиях могут развиваться обсессивно-компульсивный синдром, а также иллюзии и галлюцинации. Кроме того, у пациентов развиваются вегетативные нарушения, к которым относятся запоры и снижение обоняния, появляющиеся еще до развития двигательных симптомов, а также слюнотечение, дисфагия, недержание мочи, импотенция, пароксизмы тахикардии, трофические нарушения кожи, ноющие боли в мышцах (Hawkes, Shephard, et al. 1997, Muller, Mungersdorf, et al. 2002).
На основе клинических признаков, их появления и темпов прогрессирования построена модифицированная шкала Хен и Яра, которая широко применяется в клинической практике (Goetz, Poewe, et al. 2004). При этом первые две стадии считаются ранними, симптомы прогрессируют постепенно, оставаясь слабовыраженными. На 3-4 стадиях тяжесть симптомов нарастает, и к пятой, последней, стадии больной не может обходиться без посторонней помощи.
В настоящее время всё чаще начинает применяться другая классификация стадий БП, разработанная Брааком и описывающая нейродегенеративные изменения, происходящие при развитии данного заболевания (Braak, Del Tredici, et al. 2003, Braak, Ghebremedhin, et al. 2004). В шкале Браака большое внимание уделено ранним стадиям БП, особенно доклиническим, при этом учитываются не только клинические симптомы БП, но и любые нейродегенеративные изменения, наблюдаемые у пациентов (Braak, Ghebremedhin, et al. 2004, Hawkes, Del Tredici, et al. 2009).
Главная особенность этой классификации состоит в том, что она построена на основе анализа постмортальных материалов нервных тканей пациентов с БП на разных стадиях заболевания и наличия телец и нейритов Леви в этих тканях, как одного из классических гистологических признаков БП. Тельца Леви обнаруживаются в нейронах и представляют собой эозинофильные фибриллярные включения, состоящие, в основном, из различных белков. Основу белковых включений составляет а-синуклеин, a также убиквитин, синфилин, паркин и некоторые другие (Lee and Liu 2008). Несмотря на то, что тельца Леви у пациентов с БП были обнаружены достаточно давно, их точная роль в патогенезе БП остается не до конца ясной.
Далее более подробно будет рассмотрена шкала Браака, представленная на рисунке 1. По данной шкале в стадии 1 и 2 вовлечены нейроны, относящиеся не к дофаминергической системе (ДА-ергическая система). Так, эти стадии характеризуются наличием включений в дорсальных ядрах и/или в ретикулярной формации, продолговатом мозге и покрышке моста; поражения также затрагивают каудальные ядра шва и обонятельную луковицу. Нейродегенеративные процессы при этом ассоциированы с вегетативными нарушениями, которые часто предшествуют двигательным симптомам и имеют постоянный характер. При этом на первых двух стадиях зачастую развиваются неспецифические расстройства: аносмия, нарушения поведения во сне, депрессия, синдром беспокойных ног, хроническая усталость, запоры.
Нейротоксические модели болезни Паркинсона
Данный тип моделирования нейропатологии при БП основывается на введении токсинов, влияющих на деятельность нейронов мозга животных. Основными объектами токсических моделей являются грызуны и приматы. Исторически, первым нейротоксином, использованным для создания модели БП, был МФТП (1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин). Он был открыт в 1982 г и представляет собой побочный продукт синтеза героина. МФТП вызывает у наркоманов и лиц, участвующих в производстве наркотика, неврологические симптомы, характерные для БП (Langston, Ballard, et al. 1983). В настоящее время для моделирования БП используется целый ряд токсинов, основными из которых являются 6-гидроксидофамин (6-ГДА), ротенон и паракват. Однако классическим и самым распространенным нейротоксином остается МФТП.
Этот токсин проходит через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) в мозг и связывается с МАО-В. Под действием МАО-В протоксин превращается в N-метил-4-фенил-2,3-ди-гидропиридин-ион (МФДГҐ), который окисляется до конечного продукта - МФГҐ, обладающего избирательной нейротоксичностью по отношению к ДА-ергическим нейронам. МФГҐ активно переносится в нейроны транспортером ДА. В нейронах МФП+ проникает в митохондрии и селективно ингибирует комплекс I электронной транспортной цепи, вызывая окислительный стресс и нарушения кальциевого гомеостаза. Это приводит к дегенерации ДА-ергических нейронов путем некроза или апоптоза (Langston, Ballard, et al. 1983, Gerlach and Riederer 1996, Przedborski, Jackson-Lewis, et al. 2000).
Введение МФТП моделирует ключевой признак БП - гибель ДА-ергических нейронов черной субстанции и последующий дефицит ДА в стриатуме, а также проявление классических признаков БП (German, Nelson, et al. 1996, Meredith, Totterdell, et al. 2008). К тому же, применение различных схем и протоколов введения токсина животным позволяет добиваться различного нейротоксического воздействия МФТП на животных. Так, варьирование количества введенного МФТП и/или продолжительности его введения позволяет моделировать различные стадии БП (Langston, Forno, et al. 1999, Smeyne and Jackson-Lewis 2005, Бочаров, Кучеряну, et al. 2006). Стоит учитывать, что введение небольших доз данного токсина, а также его однократная инъекция не вызывает существенного снижения уровня ДА в стриатуме и гибели ДА-ергических нейронов в черной субстанции. Было показано, что МФТП при таких условиях не успевает накапливаться в нейронах и выводится в течение первых суток. В то же время многократное введение МФТП грызунам вызывает гибель ДА-ергических нейронов и проявление двигательных расстройств.
Модели, основанные на введении МФТП, являются одними из наиболее адекватных экспериментальных моделей БП. Одним из главных преимуществ МФТП является то, что он избирательно проникает в ДА-ергические нейроны, вызывая их дегенерацию, благодаря высокой степени сродства с транспортером ДА DAT. Кроме того, МФТП способен легко проникать через ГЭБ, что позволяет вводить его подкожно, не вызывая повреждений непосредственным введением в мозг. Однако у этих моделей существуют свои недостатки. Так, основными недостатками являются кратковременное протекание досимптомной стадии заболевания и необходимость введения больших доз токсина для снижения концентрации ДА, характерной для БП. При этом увеличение доз МФТП может оказывать тяжелые побочные эффекты, а также происходит повышение смертности экспериментальных животных. Кроме того, при моделировании продолжительного дефицита ДА у животных при прекращении введения токсина со временем может происходить восстановление функционирования нервной системы.
Разработка разнообразных схем введения МФТП позволяет снизить побочные эффекты. Экспериментально было показано, что подкожное введение МФТП мышам в концентрации от 8 до 16 мг/кг способствует моделированию досимптомной стадии. При этом наблюдается гибель 25-50% аксонов ДА-ергических нейронов в стриатуме, однако, дегенерация тел нейронов в черной субстанции остается на уровне контроля (Ugrumov, Khaindrava, et al. 2011). Однократное введение мышам МФТП в концентрациях 20 мг/кг и 40 мг/кг приводило к быстрому развитию симптомной стадии БП, резкой гибели ДА-ергических нейронов и высокой смертности животных (binder, Klemfuss, et al. 1987, Ugrumov, Khaindrava, et al. 2011). Однако было выявлено,
Полнотранскриптомный анализ тканей мозга мышей с токсической моделью болезни Паркинсона
В 2007 году была проведена первая работа по изучению роли микроРНК в патогенезе БП. Были проанализированы экспрессионные профили предшественников 224 микроРНК в мозге пациентов с БП, и показано значительное снижение уровня МЖІЗЗЬ по сравнению со здоровым контролем. Кроме того, было продемонстировано, что тканеспецифическое удаление гена Dicer in vivo в ДА-ергических нейронах черной субстанции у мышей приводило к гибели этих клеток и проявлению паркинсоноподобного фенотипа (Kim, Inoue, et al. 2007). В настоящее время опубликован ряд работ, проведенных на различных модельных объектах, в которых показано, что микро-РНК могут быть связаны с развитием нейродегенерации при БП (Kim, Inoue, et al. 2007, Wang, van der Walt, et al. 2008, Junn, Lee, et al. 2009, Asikainen, Rudgalvyte, et al. 2010, Doxakis 2010, Gehrke, Imai, et al. 2010, Minones-Moyano, Porta, et al. 2011). При этом существует только одна работа по анализу уровней микроРНК в периферической крови пациентов с БП, в которой было показано снижение уровней MIR1, MIR22 и МШ29а у пациентов с БП по сравнению с контролем (Margis and Rieder 2011). В связи с этим нами был проведен анализ микроРНК в периферической крови пациентов, находящихся на ранних стадиях БП. Отбор микроРНК для исследования осуществлялся на основе литературных данных. Было выбрано 11 микроРНК (MIR7, MR9-5p, MR9-3p, MR129, MR132, MR133b, MR153, MIR191, MIR346, MIR433 и MIR598), которые хорошо представлены в мозге, а для некоторых из них показано возможное участие в патогенезе БП (MIR7, MIRl33b, MIR153 и MIR433). Нами был проведен анализ изменения уровней этих микроРНК в лимфоцитах периферической крови пациентов с БП по сравнению с контролем.
На первом этапе нами был проведено исследование изменения уровней микроРНК в группах пациентов с БП и группе здоровых добровольцев. Для микроРНК, со статистически значимой разницей в уровнях между исследуемыми группами, был проведен дополнительный анализ в группе неврологического контроля для оценки специфичности наблюдаемых изменений при БП (табл. 12). БП нелеч, пациенты с БП, не по двергавшиеся лечению; БП леч, пациенты с Е подвергавшиеся лечению; Неврол.к., группа неврологического контроля; Me, медиана; 25%-75%, 25-75 процентили; Данные, выделенные жирным, являются статистически значимыми (р 0.05). Необходимо отметить, что из всех исследованных нами микроРНК только для четырех были получены данные об их роли в патогенезе БП. В первой работе, посвященной исследованию микроРНК в патогенезе БП, было показано существенное изменение уровня МІШЗЗЬ в мозге пациентов с БП. Также на культурах клеток было показано, что данная микроРНК принимает активное участие в регуляции жизнедеятельности ДА-ергических нейронов (Kim, Inoue, et al. 2007). Возможно, отсутствие различий связано с тем, что в нашей работе были исследованы пациенты на ранних стадиях развития заболевания, а в работе Kim с соавт. были исследованы постмортальные материалы мозга пациентов с БП, активно подвергавшихся лечению и находившихся на поздних стадиях заболевания.
Также, для микроРНК MIR433 в нашей работе не было выявлено изменений экспрессии в группах пациентов с БП, тогда как ранее было показано, что она может быть опосредованно связана с патогенезом БП. Область узнавания этой микроРНК находится в З -НТО FGF20, уровень белка которого коррелировал с уровнем белка а-синуклеина, что позволило предположить участие данной микроРНК в патогенезе БП. Однако полученные нами данные указывают на то, что ни MIR433, ни его ген-мишень FGF20 не играют важной роли на ранних стадиях развития патологического процесса.
Еще для двух микроРНК, MIR7 и MIR153 ранее было показано изменение экспрессии при БП. Мишенью этих микроРНК является ген SNCA, связываясь с З -НТО которого, они способны влиять на синтез белка, снижая его уровень на посттрансляционном уровне (Junn, Lee, et al. 2009, Doxakis 2010). Однако достоверных изменений экспрессии MIR153 для пациентов с БП выявлено не было. Возможно, различия в результатах исследований связаны с тем, что изменения экспрессии этих микроРНК были выявлены при работе с линиями клеток (Doxakis 2010), в нашей же работе анализ проводился с участием пациентов. В работе Junn с соавт на клеточных линиях и на МФТП-индуцированной модели БП у мышей, а также в исследовании Doxakis с соавт. на линиях клеток было показано возможное участие MIR7 в патогенезе БП посредством регуляции экспрессии SNCA (Junn, Lee, et al. 2009, Doxakis 2010). Как видно из таблицы 12, нами было показано увеличение уровня MIR7 в группе пациентов с БП, подвергавшихся лечению, относительно контроля в 32 раза. Необходимо отметить, что для нее было выявлено самое существенное изменение экспрессии среди всех исследуемых микроРНК. Кроме того, еще для четырех микроРНК было показано статистически значимое изменение экспрессии в периферической крови пациентов с БП, подвергавшихся лечению. Так, уровни микроРНК A4IR9-3p, MIR129 и MIR132 возрастают более чем в три раза, MIR9-5р - в шесть раз (табл.12). При этом различий в уровнях микроРНК между неврологическим контролем и группой здоровых добровольцев не наблюдалось. Возможно, повышение уровней этих микроРНК связано с проводимой терапией, так как статистически значимые изменения наблюдались только в группе пациентов с БП, подвергавшихся лечению. Можно предположить, что применение препаратов способно активировать экспрессию данных микроРНК. Так, например, показано, что мишенью микроРНК MIR7 является ген SNCA, a MIR9-5p и МЖ9-Зр экспрессируются преимущественно в мозге (Landgraf, Rusu, et al. 2007) и принимают участие в нейрональной дифференцировке (Zhao, Sun, et al. 2009, Yoo, Sun, et al. 2011).
Наши данные согласуются с данными, полученными в работе Margis R. (Margis and Rieder 2011), в которой было показано, что применение леводопы приводит к изменению экспрессионного профиля нескольких микроРНК. Вероятно, микроРНК весьма чувствительны к проводимой терапии и введению препаратов, а наблюдаемые эффекты от терапии могут быть связаны с изменением уровней данных микроРНК и их генов-мишеней у пациентов с БП. Возможно, микроРНК MIR9-3p, MIR129, MR132, MR9-5p и MR7 могут быть использованы в будущем в качестве биомаркеров эффективности проводимой терапии у пациентов с БП.
Анализ изменения экспрессии отдельных генов в тканях мышей с МФТП-индуцированной моделью досимптомной и ранней симптомной стадий болезни Паркинсона
В настоящее время уже доказано, что развитие БП обусловлено гибелью разных типов нейронов. При этом ведущую роль играет дегенерация именно ДА-ергических нейронов черной субстанции. При БП происходит не столько поражение конкретной нейромедиаторной системы, сколько дисбаланс нейромедиаторов в целом, приводящий к дезорганизации мозга и последующему развитию клинической симптоматики данного заболевания.
Однако несмотря на очевидный прогресс, достигнутый в изучении вовлеченных в развитие БП молекулярно-генетических факторов, до сих пор не выявлены все метаболические процессы, нарушение которых связано с патогенезом БП. Остается неизвестным, какие механизмы инициируют развитие нейродегенерации при данном заболевании.
Для выявления новых молекулярно-генетических закономерностей патогенеза БП было проведено изучение экспрессионного профиля на ранних стадиях заболевания. Были изучены различные ткани мышей с МФТП-индуцированными моделями ранних стадий БП, а также периферическая кровь пациентов с БП, находящихся на ранних стадиях данной патологии (1-2 стадия по шкале Хен и Яра).
На первом этапе нами был проведен полнотранскриптомный анализ тканей стриатума и черной субстанции мышей с МФТП-индуцированными моделями БП. Этот анализ показал, что как на ДС-стадии, так и на РС-стадии большее число генов изменили свою экспрессию в стриатуме по сравнению с черной субстанцией. Эти данные позволяют предположить, что, возможно, на ранних этапах патогенеза БП в первую очередь вовлекаются терминали ДА-ергических нейронов, расположенные в стриатуме. В результате полнотранскриптомного анализа был выявлен ряд кластеров, связанных с различными метаболическими процессами. Для двух из них, функционирование митохондрий и убиквитин-зависимый протеолиз, уже давно получены доказательства их роли патогенезе БП. Также были получены данные, подтверждающие важную роль везикулярного транспорта в развитии нейродегенеративных процессов при данной патологии.
Анализ отдельных генов (Cplx2, Drd2, Ерп2, Ехос4, Ntrk2 и Snca), отобранных по результатам полнотранскриптомного анализа, показал рост их экспрессии на ДС-стадии и последующее снижение экспрессии на PC-стадии в черной субстанции мышей с МФТП-индуцированными моделями БП. Наличие таких изменений в черной субстанции может указывать на развитие компенсаторных механизмов в теле нейрона на ДС-стадии. При этом было установлено, что что профиль изменения экспрессии данных генов в стриатуме на обеих стадиях БП не совпадает с изменениями, наблюдаемыми в черной субстанции. Выявленные различия могут говорить о том, что при БП происходит изменение транспорта веществ, которое, в свою очередь, может приводить к нарушению доставки мРНК из тел нейронов, находящихся в черной субстанции, к их окончаниям, расположенным в стриатуме.
Сравнительный анализ профилей экспрессии генов в черной субстанции и периферической крови выявил сходные изменения в уровнях мРНК данных генов при моделировании БП у мышей. Мы подтверждаем имеющиеся данные о том, что лимфоциты периферической крови могут отражать процессы, происходящие в мозге. Эти данные позволяют предположить, что в дальнейшем периферическая кровь может быть использована в диагностике ранних стадий БП, а уровни мРНК генов в периферической крови могут рассматриваться в качестве биомаркеров нейродегенерации при БП.
Экспрессионный анализ ряда кандидатных генов в периферической крови пациентов с БП, находящихся на ранних симптомных стадиях заболевания, выявил статистически значимое изменение экспрессии генов АТР13А2, PARK7, SNCA и ZNF746 у пациентов с БП. Для гена SNCA было выявлено существенное снижение уровня экспрессии у пациентов с БП. Однако подобные изменения также наблюдались в группе неврологического контроля, которое, возможно, связано с наличием общих закономерностей патогенетических процессов при различных нейродегенеративных заболеваниях. Для генов АТР13А2, PARK7 и ZNF746 было выявлено достоверное повышение их уровней экспрессии более чем в 1,5 раза. Эти изменения являются специфическими для БП, так как в группе неврологического контроля уровни экспрессии данных генов не отличаются от уровней экспрессии в здоровом контроле. Исходя из полученных результатов, можно предположить, что выявленные изменения экспрессии этих трех генов на самых ранних клинических стадиях у пациентов, не подвергавшихся лечению, могут также наблюдаться и на досимптомных стадиях БП, а данные гены могут быть вовлечены в развитие нейродегенерации или принимать участие в ее инициации. Кроме того, гены АТР13А2, PARK7, ZNF746, а также SNCA могут рассматриваться в качестве потенциальных биомаркеров для включения в диагностичекую панель доклинических стадий БП. Однако для проверки данной гипотезы необходимы дальнейшие исследования и, в первую очередь, на больных, находящихся на доклинической стадии БП.
Кроме того, было выявлено статистически значимое повышение уровней пяти микроРНК (MIR9-3p, MIR129, MIR132, MR9-5p и MR7) в периферической крови пациентов с БП, подвергавшихся лечению. Вероятно, микроРНК весьма чувствительны к проводимой терапии и введению препаратов, а наблюдаемые эффекты от терапии могут быть связаны с изменением уровней данных микроРНК и их генов-мишеней у пациентов с БП. При этом данные микроРНК могут быть использованы в будущем в качестве биомаркеров эффективности проводимой терапии у пациентов с БП.
Таким образом, хотелось бы еще раз отметить, что полученные нами данные расширяют представления о процессах, происходящих при БП, и указывают на важную роль терминалей ДА-ергических нейронов и процессов, связанных с транспортом веществ, на начальных этапах развития нейродегенеративных процессов при БП.