Содержание к диссертации
Введение
I. Обзор литературы 12
1.1. Формирование и экспорт мРНП-частиц 12
1.1.1. Состав мРНП-частицы 13
1.1.1.1. Белковые компоненты мРНП-частицы 13
1.1.1.1.1. Открытие первых белков мРНП-частицы: PABP, YBX1 и гяРНП 13
1.1.1.1.2. Белки SR. 14
1.1.1.1.3. Белки связывающие кэп-структуру 15
1.1.1.1.4. Сплайсинг-зависимые белки 16
1.1.1.1.5. Белок NPM1 и полиаденилирование мРНК 17
1.1.1.1.6. Новые белки мРНП-частицы 17
1.1.1.2. мРНК в составе мРНП-частицы 19
1.1.1.2.1. Альтернативные 3 -UTR 19
1.1.1.2.2. Альтернативные 5 UTR 20
1.1.1.2.3. Альтернативный сплайсинг и мРНП-частицы 21
1.1.1.3. Формирование мРНП-частицы 21
1.1.2. Ремоделирование и экспорт мРНП-частицы 24
1.1.2.1. Факторы ремоделинга 24
1.1.2.1.1. THO комплекс 24
1.1.2.1.2. Хеликаза Sub2 28
1.1.2.1.3. TREX-2 комплекс 29
1.1.2.2. Адаптеры 32
1.1.2.2.1. Yra1p 32
1.1.2.2.2. SR-белки, как адаптеры 33
1.1.2.2.3. NAB2 34
1.1.2.3. Рецепторы 35
1.1.2.3.1. Ядерный рецептор Mex67p-Mtr2p 35
1.1.2.3.2. Ядерный рецептор CRM1 -з
1.1.3. Комплекс ядерной поры 37
1.2. Комплекс ORC 40
1.2.1. Структура комплекса ORC 40
1.2.2. Роль ORC-комплекса в репликации 42
1.2.3. Дополнительные функции комплекса ORC
1.2.3.1. Сайленсинге и формирование гетерохроматина 46
1.2.3.2. Связь сестринских хроматид 49
1.2.3.3. Дупликации центросом 51
1.2.3.4. Цитокинез 51
1.2.3.5. Нейрогенез 52
II. Материалы и методы 55
2.1. Материалы, использованные в работе 55
2.1.1. Ферменты 55
2.1.2. Приборы и реактивы 55
2.1.3. Программное обеспечение, базы данных 55
2.1.4. Линии мух 55
2.1.5. Штаммы Escherichia coli и векторы, использованные в работе 2.1.6. Эукариотические клеточные линии и вектора, использованные в работе 56
2.1.7. Праймеры 2.1.7.1. Для создания экспрессионных конструкций в E.coli 56
2.1.7.2. Для секвенирования конструкций 56
2.1.7.3. Праймеры для оценки мРНК генов ras2, ubulin 56D и actin 5C 57
2.1.7.4. Для синтеза дцРНК 57
2.1.7.5. Для оценки количества транскриптов генов Xmas-2, Orc3, Orc4, Orc5, Thoc5, Hpr1, Nxf1 58
2.1.7.6. Для создания экспрессионных конструкций pAc5.1/V5-His B с эпитопами 3хFLAG и HA 58
2.1.7.7. Для синтеза биотинилированных фрагментов мРНК гена ubulin 56D -
2.1.7.8. Для получения ДНК-зонда для флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) 60
2.1.8. Генно-инженерные конструкции 60
2.1.9. Антитела 61
2.2. Методы 63
2.2.1. Работа с нуклеиновыми кислотами 63
2.2.1.1. Работа с ДНК 63
2.2.1.1.1. Приготовление компетентных клеток 63
2.2.1.1.2. Трансформация бактерий 63
2.2.1.1.3. Щелочное выделение плазмидной ДНК 63
2.2.1.1.4. Обработка ферментами рестрикции 64
2.2.1.1.5. Лигирование 64
2.2.1.1.6. Гель-электрофорез ДНК 64
2.2.1.1.7. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 65
2.2.1.1.8. Клонирование 65
2.2.1.1.9. Секвенирование ДНК 66
2.2.1.2. Работа с РНК 66
2.2.1.2.1 Выделение РНК 66
2.2.1.2.2. Получение библиотеки кДНК 66
2.2.1.2.3. Получение двуцепочечной РНК 67
2.2.1.2.4. Синтез биотинилированных фрагментов мРНК гена ubulin 56D 67
2.2.1.2.5. Метод соосаждения РНК 67
2.2.1.2.6. Транскрипция in vitro 68
2.2.2. Работа с белками 68
2.2.2.1. Экспрессия и очистка рекомбинантных белков 68
2.2.2.2. Получение антител 69
2.2.2.3. Очистка антител 69
2.2.2.4. Выделение ядерного эмбрионального экстракта 69
2.2.2.5. Белковый гель-электрофорез 70
2.2.2.6. Вестерн-блот анализ 70
2.2.2.7. Гель-фильтрация белкового ядерного эмбрионального экстракта -
2.2.2.8. Иммунопреципитация белков из ядерного эмбрионального экстракта 71
2.2.2.9. Иммунопреципитация белков из клеточного лизата 71
2.2.2.10. Иммунопреципитация мРНП 72
2.2.3. Работа с S2 клетками 72
2.2.3.1. РНК-интерференция 72
2.2.3.2. Трансфекция клеточной линии S2 73
2.2.3.3. Иммуноокрашивание S2 клеток 73
2.2.3.4. Гибридизация in situ S2 клеток
2.2.3.4.1. РНК in situ гибридизация с зондом к индивидуальному гену 73
2.2.3.4.2. РНК in situ гибридизация с Cy3-oligo-dT праймером 74
2.2.3.5. Окрашивание S2 клеток EU 75
III. РЕЗУЛЬТАТЫ 76
3.1. Подтверждение взаимодействия комплексов TREX-2 и ORC 76
3.1.1. Получение поликлональных антител к компонентам комплексов TREX-2 и ORC 76
3.1.2. Анализ миграции комплексов TREX-2 и ORC на гель-фильтрационной колонке Superose 6 77
3.1.3. Ко-иммунопреципитация субъединиц комплексов TREX-2 и ORC из ядерного эмбрионального экстракта D. melanogaster 79
3.1.4. Ко-иммунопреципитация субъединиц комплексов TREX-2 и ORC овер-экспрессированных в S2-клетках D. melanogaster 80
3.2. Взаимодействие ORC комплекса с мРНК 81
3.2.1. РНК-иммунопреципитация ORC комплекса 81
3.2.2. Взаимодействие мРНК гена ubulin56D c субъединицами комплексов ORC и TREX-2 82
3.2.3. РНК иммунопреципитация ORC-комплекса при истощении комплексов ORC и TREX2 85
3.3. Взаимодействие ORC-комплекса с белковыми компонентами мРНП-частицы 87
3.3.1. Ко-локализация субъединиц комплекса ORC с комплексом ядерной поры в S2 клетках D. melanogaster - 6 3.
3.2. Взаимодействие ORC-комплекса с белковыми компонентами мРНП-частицы 88
3.3.2.1. Подтверждение взаимодействий ORC-комплекса с белковыми компонентами мРНП-частицы 88
3.3.2.2. Участие ORC-комплекса в ассоциации Nxf1 с мРНК 90
3.3.2.3. Участие белка Hpr1 в ассоциации Nxf1 и ORC с мРНК 91
3.4. Участие ORC-комплекса в экспорте мРНК 93
3.4.1. Участие ORC-комплекса в экспорте мРНК ras-2 93
3.4.2. Участие ORC-комплекса в общем экспорте мРНК 94
3.4.3. Участие ORC-комплекса в общем экспорте новосинтезированной РНК 95
Обсуждение результатов 98
Заключение 107
Выводы 108
Список использованной литературы
- Состав мРНП-частицы
- Программное обеспечение, базы данных
- Генно-инженерные конструкции
- Ко-локализация субъединиц комплекса ORC с комплексом ядерной поры в S2 клетках D. melanogaster
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Расположение генетического аппарата в ядре – специальном компартменте, защищенном ядерной оболочкой – главная особенность клеток эукариот. Записанная в геноме информация реализуется при помощи двух матричных процессов – транскрипции и трансляции. В клетках эукариот транскрипция генов, кодирующих белки, т.е. синтез пре-мРНК на матрице ДНК, протекает в ядре с участием РНК-полимеразы II. Полученная в результате транскрипции новосинтезированная мРНК претерпевает целый ряд изменений, прежде чем, зрелая мРНК может быть экспортирована в цитоплазму, где на матрице мРНК пройдет процесс синтеза белка – трансляция.
Формирование зрелой мРНК, способной к экспорту через ядерную пору – важнейший этап экспрессии генов. Уже в процессе транскрипции, с новосинтезированной мРНК связываются многочисленные белки и белковые комплексы, которые осуществляют этапы процессинга мРНК и участвуют в формировании рибонуклеопротеиновой частицы (мРНП-частицы), которая затем экспортируется из ядра в цитоплазму через ядерную пору.
К ключевым комплексам экспорта мРНП-частицы можно отнести комплекс TREX-2. TREX-2 связывается с мРНП-частицей, взаимодействуя с рядом известных факторов, отвечающих за экспорт мРНК. В частности, TREX-2 непосредственно ассоциирован с рецептором ядерной поры Mex67p/Nxf1 и с комплексом ядерной поры (Nuclear Pore Complex, NPC) (Fischer, Strasser et al. 2002; Lei, Stern et al. 2003).
Ранее в нашей лаборатории методами классической хроматографии из ядерного эмбрионального экстракта была проведена очистка комплекса TREX-2 Drosophila melanogaster. По результатам масс-спектрометрии было обнаружено, что выделенный комплекс содержал компоненты TREX-2, а также белки комплекса ORC (Orc1, Orc3, Orc4, Orc5, Orc6).
Комплекс ORC принимает участие в инициации репликации и служит платформой для сборки пререпликативного комплекса в G1-фазе клеточного цикла (Diffley 1996; Machida, Hamlin et al. 2005). Кроме того, ORC участвует в таких процессах, как формирование гетерохроматина, связь сестринских хроматид, транскрипция, дупликация центросом, цитокинез и др. (Sasaki and Gilbert 2007; Chakraborty, Shen et al. 2011; Hossain and Stillman 2012; Akhmetova, Balasov et al. 2015; Hossain and Stillman 2016). Таким образом, ORC-комплекс объединяет различные клеточные процессы и, вероятно, участвует в их координации. Однако связь ORC-комплекса с факторами экспорта мРНП-частиц была найдена впервые.
Предметом изучения данной диссертационной работы являлась ранее не описанная функция комплекса ORC в экспорте мРНК у D. melanogaster.
Цели и задачи исследования
Целью настоящей работы являлось изучение роли комплекса ORC в экспорте мРНК у Drosophila melanogaster.
Для достижения цели были поставлены следующие экспериментальные задачи:
-
Подтвердить взаимодействие комплекса ORC с комплексом ядерного экспорта мРНК TREX-2.
-
Изучить взаимодействие ORC-комплекса с мРНК.
-
Исследовать взаимодействие комплекса ORC с белковыми компонентами мРНП-частицы.
-
Проверить участие ORC-комплекса в экспорте мРНК у D. melanogaster.
Научная новизна и практическая значимость работы
В диссертационной работе была показана новая функция ORC-комплекса в формировании мРНП-частицы и экспорте мРНК у D. melanogaster. Результаты данной работы расширяют наше представление о белковых участниках экспорта мРНК и могут служить основой для дальнейших исследований в области регуляции экспорта мРНК. Открытие новой функции комплекса ORC также представляет большой интерес в свете участия ORC в различных клеточных процессах: формирование гетерохроматина, связь сестринских хроматид, транскрипция, дупликация центросом, цитокинез и др. (Sasaki and Gilbert 2007; Chakraborty, Shen et al. 2011; Hossain and Stillman 2012; Akhmetova, Balasov et al. 2015; Hossain and Stillman 2016). В связи с этим, изучение взаимосвязи и ко-регуляции экспорта мРНК с другими процессами, в которых принимает участие ORC сможет пролить свет на новые механизмы регуляции жизнедеятельности клетки.
Мутации в генах компонентов комплекса ORC часто сопровождают аутосомно-рецессивный синдром Мейера-Горлина человека (Bicknell, Walker et al. 2011; Ladha 2011; Balasov, Akhmetova et al. 2015). Синдром Мейера-Горлина имеет хорошо описанные клинические признаки, однако молекулярные основы синдрома на сегодняшний день остаются мало изучены. Новые данные о функциях ORC, полученные в рамках работы, могут выявить новые аспекты работы комплекса и выявить их участие в причинах возникновения синдрома Мейера-Горлина.
Личныи вклад соискателя
Соискателем была выполнена основная часть работ и экспериментов, представленных в диссертационной работе: создание генетических конструкций, экспрессия и очистка белков, получение поликлональных антител, анализ белок-белковых и РНК-белковых взаимодействий, эксперименты по количественному измерению продуктов транскрипции, иммунопреципитация РНК, иммуноокрашивание клеток, анализы распределения РНК в клетках. Соискатель
принимала непосредственное участие в планировании экспериментальной работы и подготовке научных публикаций по результатам исследований.
Методология и методы работы
Работа была выполнена современными методами молекулярной биологии в сочетании с классическими подходами биохимии. Был использован широкий спектр методов, включающих методики молекулярного клонирования, ведения культур эукариотических клеток, получение ядерного эмбрионального экстракта дрозофилы, хроматографическое фракционирование, иммунопреципитации белков, РНК иммунопреципитации, анализа изменения электрофоретической подвижности РНК, РНК-интерференции, ПЦР и ПЦР в реальном времени и др.
Основные положения, выносимые на защиту
-
У D. melanogaster комплекс ORC взаимодействует с комплексом ядерного экспорта мРНК TREX-2, формируя единый комплекс, посредством взаимодействия нескольких субъединиц каждого комплекса.
-
Субъединицы комплекса ORC ассоциированы с мРНК, ассоциация ORC c мРНК зависит от комплекса TREX-2.
-
Комплекс ORC взаимодействует c рецептором ядерной поры Nxf1 и участвует в его ассоциации с мРНК.
-
Истощение ORC в клетках D. melanogaster приводит к нарушению экспорта мРНК из ядра в цитоплазму.
Степень достоверности и апробация результатов
Результаты работы были опубликованы в рецензируемых научных журналах и представлены автором на следующих конференциях: Offspring-Meeting of the International Research Training Group Gieen/Marburg-Moscow (DFG/RFBR-funded) (Moscow, Russia, 2013), Workshop "Global and mechanistic approaches in nucleic acid biology " of the International Research Training Group Gieen/Marburg-Moscow (DFG/RFBR-funded) (Sankt Petersburg, Russia, 2013), Workshop «Imaging (biology) down to the single molecule level» Transcription and Chromatin of the International Research Training Group Gieen/Marburg-Moscow (DFG/RFBR-funded) (Shloss Rauischholzhausen, Germany, 2014), Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2016» (Москва, 2016), The EMBO | EMBL Symposium «The Complex Life of mRNA» (Heidelberg, Germany, 2016). По теме диссертации опубликовано 8 печатных работы – 3 статьи в рецензируемых научных журналах и 5 тезисов докладов на конференциях.
Структура и объем работы
Состав мРНП-частицы
Экспорт мРНК и формирование мРНП-частицы – сложно скоординированный многоуровневый процесс, в котором участвуют многочисленные белки и белковые комплексы. Согласно современным представлениям, мРНП-частица — это комплекс мРНК с многочисленными белками. Белки в составе мРНП-частицы формируют своеобразные слои одежды для мРНК, при этом смена состава нижележащих белков может происходить только после высвобождения или реорганизации белков расположенных во внешних слоях.
У высших эукарот мРНП-частицы содержат десятки тысяч различных последовательностей мРНК и сотни мРНК-связывающих белков, что делает мРНП-частицы чрезвычайно разнообразными по своей структуре и составу. В то время как, кодирующая часть мРНК несет в себе информацию о полипептидной последовательности, именно белковые компоненты мРНП-частицы отвечают за экспорт мРНК, субклеточную локализацию в цитоплазме, где и когда мРНК будет функционально взаимодействовать с аппаратом трансляции, а также способ и скорость деградации (Singh, Pratt et al. 2015). Белки мРНП-частиц по характеру связывания с мРНК можно разделить на три группы. Белки, распознающие общие структурные элементы большинства мРНК, например, кэп-структуру или поли(А)-хвост. Белки способные распознавать специфические мотивы в последовательности, иногда с помощью коротких РНК, например, Argonautes и микроРНК. Третья группа белков взаимодействует с вторичными или третичными структурами независимо от последовательности мРНК (Singh, Pratt et al. 2015). Также важно отметить, что белки имеют широкий диапазон динамики ассоциации с мРНП-частицей: от стабильно связанных архитектурных белков, которые определяют общую организацию и структуру мРНП-частицы до кратковременно ассоциированных факторов, участвующих только на одном из посттранскрипционных этапов экспрессии гена. Для понимания структуры, динамики и основных принципов работы мРНП-частицы, как единого целого, необходимо представление об основных компонентах входящих в ее состав.
Самые ранние наблюдения за белками на транскриптах РНК-полимеразы II относятся к 1950-м годам, когда, благодаря использованию электронной микроскопии, были визуализированы транскрипты на хромосомах типа ламповых щеток и впервые предложена модель укладки новосинтезированных РНК с белками в РНП-частицы (Gall 1956; Dreyfuss 1986). В 1960-е годы несколько лабораторий начали фокусироваться на биохимической очистке и структурном анализе нерибосомальных РНП, которые привели к ранней идентификации таких ключевых компонентов мРНП-частиц таких, как ядерные и цитоплазматические кэп-связывающие белки, поли(А)-связывающий белок PABP и гетерогенные ядерные рибонуклеопротеины (гяРНП).
Очистка цитоплазматических мРНП-частиц показала, что в ее составе преобладали три белка с молекулярными весами 52, 76 и 120 кДа (Blobel 1972; Bryan and Hayashi 1973; Barrieux, Ingraham et al. 1975; Kumar and Pederson 1975). Белок с весом 76 кДа был ранее идентифицирован как белок PABP (теперь известный как PABPC1) (Blobel 1972), а белок весом 52 кДа оказался Y-бокс-белок (YBX1), который неспецифично связывается с мРНК по всей длине посредством связывания с сахаро-фосфатным остовом (Evdokimova, Wei et al. 1995; Skabkin, Kiselyova et al. 2004). Интересно, что белок с массой 120 кДа до сих пор остается неописанным.
Значительный вклад в открытие и понимание структуры мРНП-частиц эукариот был сделан академиком Георгием Павловичем Георгиевым. В 1962 году в лаборатории Георгиева была впервые открыта и очищена ДНК-подобная РНК (дРНК). Было высказано предположение, что ядерная дРНК является высокомолекулярным предшественником цитоплазматической мРНК (Georgiev, Samarina et al. 1963; Samarina, Lerman et al. 1965; Kalaycioglu 1985). Дальнейшие исследования показали, что дРНП представляют собой цепи сходных РНП-частиц, соединенных мостиками РНК, которые наиболее чувствительны к обработке рибонуклеазой (Lukanidin, Zalmanzon et al. 1972). Найденные РНП-частицы авторы назвали информоферами, т.е. носители информационной РНК. Информоферы представляют собой белковые комплексы, содержащие примерно 20 белков с молекулярным весом около 40 кДа, относящихся, по данным других авторов, к шести разным типам (Dreyfuss, Matunis et al. 1993). В 1965 году, открытая Георгиевым Г.П., дРНК была описана американскими авторами, которые ввели понятие гетерогенная ядерная РНК (hnRNA, или гяРНК), которое в настоящее время является общепринятым (Houssais and Attardi 1966; Penman 1966; Scherrer, Marcaud et al. 1966; Warner, Soeiro et al. 1966).
Таким образом, по итогам многолетний работы Геогиева Г.П. с соавторами был сделан вывод, что ядерные гяРНП – это длинные гяРНК, регулярно намотанные на поверхность серии похожих или одинаковых белковых глобулярных частиц. Подобная структура приводит к сильной компактизации длинных гяРНК, в то же время оставляя ее доступной для взаимодействия с более специфичными факторами, участвующими в процессинге и экспорте РНК.
В 1980 году был разработан новый метод фотосшивки РНК с белками, что позволило добиться крупного прорыва в определении белков в составе мРНП-частицы (Wagenmakers, Reinders et al. 1980). В частности, было показано, что белки, сшитые с ядерной РНК, содержащей поли(А)-хвост, идентичны ранее наблюдавшимся субъединицам гяРНП-частиц (Mayrand, Setyono et al. 1981; van Eekelen, Riemen et al. 1981; Dreyfuss, Choi et al. 1984). Другим важным достижением явилось создание моноклональных антител против отдельных белков гяРНП-частиц (Pinol-Roma, Choi et al. 1988). Полученные антитела позволили разделить белки гяРНП-частиц на основании их скорости миграции в геле, описанные белки были названы гяРНП A1-U (Pinol-Roma, Choi et al. 1988).
Несколько лет спустя, получение моноклональных антител, которые иммуноокрашивали транскрипционно-активные петли хромосом и ядерные тельца, содержащие малые ядерные РНП (мяРНП) в герминальных везикулах ооцитов Xenopus, положило начало открытию второго главного семейства компонентов мРНП-частиц – SR-белков (Roth, Murphy et al. 1990). Свое название SR-белки получили благодаря наличию белкового домена (RS-домена) с длинными повторами аминокислотных остатков серина и аргинина. SR-белки имеют длину около 200-600 аминокислот и состоят из двух доменов: домена распознавания РНК (RNA Recognition Motif, RRM), одного или более, и домена RS (Long and Caceres 2009). RRM обычно располагается вблизи N-конца и отвечает за взаимодействие с РНК, а RS-домен рядом с C-концом и регулируют белок-белковые взаимодействия SR-белков (Long and Caceres 2009).
SR-белки принято разделять на канонические и неканонические. К каноническим относят SR-белки, выполняющие роль шатлов между ядром и цитоплазмой, и таким образом, связывающие ядерные и цитоплазмотичекие события жизни мРНП-частицы (Long and Caceres 2009; Zhong, Wang et al. 2009). В дополнение к 12 каноническим SR-белкам были найдены многочисленные SR-подобные белки с различными функциями в таких процессах как сплайсинг, формирование 3 -конца мРНК, экспорт мРНК, трансляция и деградация мРНК (Boucher, Ouzounis et al. 2001; Long and Caceres 2009).
Программное обеспечение, базы данных
Только ориджины с правильно собранными пререпликативными комплексами смогут служить местами начала репликации в S-фазе клеточного цикла. Сборка пререпликативных комплексов в G1 необходимое условие для перехода клетки в интерфазу, которое гарантирует клетке, что каждый участок генома будет реплицирован (Stillman 2005).
Механизм инициации репликации ДНК крайне консервативен у всех эукариот. Однако организация и функции субъединиц ORC существенно различаются между организмами. Так, в клетках дрожжей все шесть субъединиц ORC ассоциированы с хроматином в течение всего -фосфорилированием (Matsuda, Makise et al. 2007). У высших эукариот комплекс ORC во время клеточного цикла взаимодействует с ДНК более динамично. У дрозофилы и млекопитающих ключевым регулятором работы ORC является диссоциация субъединицы Orc1 (DePamphilis 2003). Интересно, что у D.melanogaster Orc1 деградирует в конце M-фазы с помощью комплекса APC (Anaphase-Promoting Complexe) (Araki, Wharton et al. 2003), тогда как у человека он подвергается убиквитин-зависимому протеолизу в конце перехода G1/S (Mendez, Zou-Yang et al. 2002). Инактивация комплекса ORC после прохождения точки контроля клеточного цикла в G1/S, играет роль в предотвращении ререпликации генома, а деградация Orc1 во время каждого клеточного цикла важна для формирования новых пререпликативных комплексов в G1. Кроме того, в клетках человека ORC2, 3, 4 и 5 образуют ядро комплекса и связаны друг с другом на протяжение всего клеточного цикла, тогда как ORC6 взаимодействует с комплексом транзиентно (Dhar, Delmolino et al. 2001; Vashee, Simancek et al. 2001).
Еще одно существенное различие работы комплекса ORC при инициации репликации между дрожжами и представителями высших эукариот заключается в специфичности связывания комплекса с последовательностью ДНК. У S.cerevisiae комплекс ORC специфично взаимодействует с автономно реплицирующейся последовательностью (Autonomously Replicating Sequence, ARS) (Bell and Stillman 1992). В то время как у высших эукариот определить единый мотив связывания для комплекса не удалось.
Важно отметить, что количество потенциальных сайтов связывания ORC в геноме всегда избыточно по отношению к активным ориджинам и зависит от размера генома, позволяя поддерживать в ходе эволюции постоянный размер репликона. Известно, что геном дрожжей содержит около 12 000 мотивов ARS, которые могут служить местами связывания ORC. Однако согласно последним данным, только 220-400 из них являются функциональными и связаны ORC (Belsky, MacAlpine et al. 2015). У высших эукариот количество сайтов связывания ORC по всему геному значительно выше: около 5000 у Drosophila (MacAlpine, Gordan et al. 2010) и около 52000 у млекопитающих (Miotto, Ji et al. 2016). Интересно, что в различных линиях клеток млекопитающих были выявлены более 80 000 активных ориджинов и примерно 35% из них были специфичны для определенных клеточных линий (Besnard, Babled et al. 2012). Таким образом, избыток потенциальных сайтов связывания ORC, верояно, важен для обеспечения высокой пластичности репликации.
Важно отметить связь ORC-комплекса с временнй организацией репликации различных участков ДНК. Для дрожжей S. cerevisiae показано, что все сайты репликации -можно подразделить на две группы – ранней репликации и поздней (Hoggard, Shor et al. 2013). Время репликации сайтов коррелирует со степенью сродства сайта с комплексом ORC. Так, к поздним относятся сайты с низким значением константы диссоциации комплекса ORC, а к ранним – с высоким, в этом случае взаимодействие ORC с сайтом репликации в большей степени зависит от хроматинового окружения (Hoggard, Shor et al. 2013). Таким образом, характер взаимодействия ORC с сайтами репликации может влиять на время начала репликации у S. cerevisiae.
В клетках многоклеточных организмов также можно выявить различия во времени репликации между разными участками генома. Первыми проходят репликацию области эухроматина, тогда как гетерохроматин реплицируется ближе к концу S-фазы (Ryba, Hiratani et al. 2011). Комплекс ORC имеет непосредственное влияние на время репликации различных участков хроматина. У D. melanogaster мутация ORC2 приводит к нарушению репликации эухроматина: время репликации сдвигается и эухроматин реплицируется позже участков гетерохроматина, а на некоторых участках репликация не успевает завершиться (Loupart, Krause et al. 2000). В результате возникает арест клеточного цикла на стадии митоза с нарушениями конденсации хромосом, фрагментации хромосом и частичным отсутствием связи между хроматидами. Схожие фенотипы клеток описаны у мутантов дрозофилы по Orc5, MCM4 и другим репликативным факторам (Loupart, Krause et al. 2000). Было отмечено, что в культуре клеток человека на время репликации оказывает влияние комплекс ORC и белка ORCA (ORC-associated) (Giri and Prasanth 2015; Wang, Khan et al. 2017). Комплекс белка ORCA с ORC играет важную роль в формировании гетерохрома в клетках человека (см. раздел 1.2.3.1.) (Wang, Khan et al. 2017). Истощение ORCA в клетке приводит к дефектам в хромосомной организации и вызывает изменение времени репликации гетерохроматина. Хотя механизм регуляции остается неясным, очевидно, что комплекс ORC влияет на время репликации хроматина и дальнейшую организацию гетерохроматина высшего порядка – митотических хромосом.
Несмотря на многочисленные факты, указывающие на участие ORC в регуляции времени репликации, долгое время оставалось неясным, действительно ли ORC участвует в координации работы ориджинов у высших эукариот. В последние годы благодаря анализу данных полногеномных исследований было выявлено несколько новых особенностей сайтов связывания ORC. В частности, показано, что сайты связывания комплекса ORC совпадают с сайтами гиперчувствительности к ДНКазе I и модификациями гистонов, характерными для активного хроматина (Bielinsky, Blitzblau et al. 2001; Chesnokov, Remus et al. 2001; Vashee, Cvetic et al. 2003; Remus, Beall et al. 2004; Cayrou, Coulombe et al. 2011; Liu, Zimmer et al. 2015), а большинство сайтов ORC совпадает с регуляторными элементами транскрипции, такими как промоторы и энхансеры (Miotto, Ji et al. 2016). Предпочтение ORC связываться с открытым хроматином также объясняет высокую корреляцию между сайтами связывания ORC и сайтами связывания различных факторов транскрипции, отмеченную ранее (Besnard, Babled et al. 2012; Cayrou, Coulombe et al. 2012; Gilbert 2012). Вполне вероятно, что в гетерохроматине ORC также связывается с локальными участками открытого хроматина. Например, у дрозофилы на участках гетерохроматина ORC связывается преимущественно с инсуляторами Su(Hw) (Vorobyeva, Mazina et al. 2013). Эта особенность связывания ORC с участками открытого хроматина приводит к тому, что в эухроматине сайты связывания ORC расположены гораздо ближе друг к другу и, следовательно, чаще, по сравненению с гетерохроматином.
В недавних исследованиях (Miotto, Ji et al. 2016) математическое моделирование репликации (во время S-фазы клеточного цикла) показало, что запуск репликации на ориджинах, скорее всего, является случайным процессом. Согласно этой модели, частое распределение сайтов связывания ORC в эухроматине приводит к частой инициации репликации именно на этих участках генома и, следовательно, к более ранней репликации всего региона по сравнению с областями гетерохроматина. Эта модель объясняет не только существование ранних и позднереплицирующих областей из-за нерегулярного распределения сайтов связывания ORC по всему геному, но и их корреляцию с участками эу- и гетерохроматина. Недавно было показано, что границы топологически ассоциированных доменов (TAD) определяют границы доменов репликации. В частности, области ранней репликации совпадают с TAD эухроматина, тогда как TAD гетерохроматина содержат области поздней репликации и переходные области (Miotto, Ji et al. 2016). Таким образом, местоположения TAD определяют разницу между ранними и поздними регионами репликации. В соответствии с современным представлением у млекопитающих ORC не регулирует время репликации каким-либо конкретным механизмом, а области ранней и поздней репликации зависят только от частоты связывания ORC.
Генно-инженерные конструкции
Бактерии рассевали штрихом на чашку со средой LB-агар, растили в течение ночи при 37oС, несколько колоний помещали в 40 мл среды YENB (0,75% Дрожжевого экстракта; 0,8% Nutrient Broth; 5,4 мМ NaOH) и растили на 37oС при постоянном перемешивании (220 об./мин.). Затем суспензию клеток охлаждали в ледяной бане в течение 10 мин и осадили центрифугированием (4500 об./мин., 10 мин., 4oC). Удаляли супернатант и промывали клетки стерильной водой при температуре 4oC дважды и один раз 10% стерильным раствором глицерина. Отмытые таким образом клетки суспендировали в 10% растворе глицерина, переносили по 100 мкл в стерильные пробирки и хранили на -70oС.
К аликвоте компетентных клеток добавляли 10-3 – 10-4 мкг плазмиды или лигазного материала, мягко перемешивали и помещали в ячейку для электропорации (BioRAD #1652089, зазор 0,1 см). Электропорацию проводили с помощью прибора MicroPulser BioRad с параметрами, рекомендованными производителем. После электропорации клетки вымывали из ячейки 1 мл среды 2YT, инкубировали в течение 30 минут при 37oC и рассевали на твердую селективную среду LB-агар, содержащую антибиотик ампицилин 0,1 мг/мл.
Колонию, выросшую на чашке, сеяли в 5 мл среды 2YT и растили 16 – 24 часа при 37oС. 3 мл культуры (последовательно по 1,5 мл) помещали в 1,7 мл пробирку, центрифугировали (13000 об./мин., 30 мин.), удаляли супернатант. Ресуспендировали осадок в 200 мкл раствора (50 мМ глюкозы; 25 мМ Трис-HCl, pH=8,0; 10 мМ ЭДТА). Добавляли 400 мкл раствора (0,2 Н NaOH; 1% SDS), мягко смешивали, инкубировали во льду 5 мин. Добавляли 200 мкл холодного 10 М СН3СООNH4, мягко смешивали, инкубировали во льду 15 мин, центрифугировали (13000 об./мин., 10 мин.). Супернатант переносили в пробирку с 500 мкл изопропанола, смешивали и выдерживали, помешивая, при комнатной температуре до образования осадка. Центрифугировали (13000 об./мин., 5 мин.). Растворяли осадок в 200 мкл 2М СН3СООNH4, центрифугировали (13000 об./мин., 5мин.). Супернатант переносили в пробирку с 200 мкл изопропанола, смешивали и выдерживали, помешивая, при комнатной температуре до образования осадка, центрифугировали (13000 об./мин., 10 мин.). Осадок промывали 70% этанолом, подсушивали 10 мин. При комнатной температуре и растворяли в 50 мкл воды.
Реакции рестрикции проводили с использованием эндонуклеаз, производства компании Thermo Fischer Scientific. В условиях, рекомендованных производителем, с использованием буферов, поставляемых с вместе с ферментами. Для рестрикции 1 мкг ДНК в реакцию добавляли 5 ед. активности фермента и инкубировали при температуре 37С от 30 мин. До 2 ч. Эффективность рестрикции проверяли с помощью электрофореза в агарозном геле (раздел 2.2.1.1.6.).
Реакцию проводили в лигазном буфере с АТФ (Fermentas) с добавлением 1-5 ед. ДНК-лигазы фага Т4 (Fermentas). На реакцию брали 1-7 мкг/мл ДНК. Соотношение молярных количеств вектора и вставки выбирали в соответствии с конкретным экспериментом. Реакцию вели в течение 2-4 ч при комнатной температуре или 12 ч при температуре 16С.
Для разделения фрагментов ДНК использовался агарозный гель концентрации от 0,5% до 2% в зависимости от размера фрагментов в эксперименте. Электрофорез проводили в однократном (1x) буфере ТАЕ (2М Трис-СН3СОО; 0,05М ЭДТА) в камере Sub-cell производства Bio-Rad при напряжении 80 В.
Для проведения ПЦР использовали Taq ДНК-полимеразу, производства компании Евроген, с соответствующими буферами и нуклеотидами, по рекомендациям производителя.
Для проведения количественного ПЦР в реальном времени использовали Taq ДНК-полимеразу горячего старта, производства компании Евроген, с соответствующими буферами и нуклеотидами, по рекомендациям производителя, для детекции сигнала в реакцию был добавлен интеркалирующий краситель SYBR Green I 100x до концентрации 0,2х (разведенный в 500 раз). В ходе работы использовали прибор MiniOpticon instrument (BioRad).
Препаративный ПЦР проводили с использованием фермента Phusion High Fidelity DNA Polymerase производства New England Biolabs, по протоколам производителя.
Для экспрессии белков, меченных специфичными эпитопами FLAG и HA, были использованы конструкции ранее созданные в нашей лаборатории на основе плазмидного вектора pAc5.1/V5-His B (Invitrogen). Нуклеотидные последовательности, кодирующие целевые белки (Orc1, Orc2, Orc3, Orc4, Orc5, Orc6, Xmas2, PCID2, ENY2, Nxf1) были амплифицированы ДНК-полимеразой Phusion (New England Biolabs) с библиотеки кДНК с помощью специфичных праймеров, содержащих сайты рестрикции и клонированы в промежуточный вектор pJET1.2, предварительно разрезанный эндонуклеазой EcoRV. После клонирования в вектор pJET1.2 правильность последовательности была проверена секвенированием (секвенирование осуществлялось в ЦКП «Геном», ИМБ РАН). Далее последовательности, кодирующие белки были вырезаны эндонуклеазами рестрикции из промежуточного вектора и клонированы в pcDNA3.1 вектор, содержащий эпитоп (FLAG или HA), заранее порезанный по соответствующим сайтам рестрикции. Полученные вектора pcDNA3.1, содержащие последовательность целевого белка и соответствующего эпитопа FLAG или HA использовали для экспрессии белков в S2 клетках дрозофилы.
Аналогичным образом были клонированы последовательности для экспрессии эпитопов при получении антител. Последовательности были амплифицированы с библиотеки кДНК с использованием специфичных праймеров и клонированы в промежуточный вектор pJET1.2. После проверки правильности вставки секвенированием, последовательности были переклонированы по рестриктным сайтам в плазмидный вектор pET22b или pET28a для экспрессии в клетках E.coli.
Для получения констукций необходимых для синтеза фрагментов мРНК был использован вектор pBlueScript II SK+. Клонирование проводили по сайтам EcoRV, с использованием специфичных праймеров, отбор клонов проводили с помощью сине-белого теста. Для проведения теста использовали твердую среду LB-агар, содержащую антибиотик ампицилин 0,1 мг/мл, X-Gal 0.1 мМ, IPTG 0.2 мМ. После клонирования в вектор pBlueScript II SK+ правильность последовательности была проверена секвенированием с использованием специфичных праймеров.
Ко-локализация субъединиц комплекса ORC с комплексом ядерной поры в S2 клетках D. melanogaster
Полученные нами результаты свидетельствуют, что истощение белка Xmas-2 в S2 клетках, вызванное его РНК-интерференцией, приводит не только к серьезному падению уровня осаждения мРНК самим белком Xmas-2, но и к существенному снижению уровня ассоциации с мРНК белка Orc3 и несколько менее значительному падению уровня ассоциации Orc4 и Orc5. В свою очередь, истощение белка Orc5 в клетках также приводит к снижению уровня осаждения мРНК белками ORC-комплекса, однако не оказывает значительного влияния на ассоциацию Xmas-2 с мРНК. Необходимо отметить, что для белка Orc3 нами было зафиксировано наиболее сильное падение уровня ассоциации с мРНК в обоих экспериментах, указывая на обособую роль Orc3 во взаимодействии комплекса ORC с мРНК.
Таким образом, можно сделать вывод, что TREX-2 действительно принимает участие в ассоциации комплекса ORC с мРНК. Однако судить о непосредственной роли TREX-2 в этом процессе сложно. Истощение TREX-2 не приводит к полной потере взаимодействия ORC с мРНК, указывая на то, что за ассоциацию ORC с мРНК могут отвечать другие факторы или ORC может непосредственно взаимодействовать с мРНК. Интересно, что ассоциация TREX-2 с мРНК не зависит от его взаимодействия с ORC и, вероятно, взаимодействие TREX-2 с мРНК предшествует ассоциации ORC с мРНП-частицей. Несомненно, механизм ассоциации ORC с мРНК и его роль в формировании мРНП-частицы представляет большой интерес и требует дополнительных исследований.
Так как ранее в работе было показано, что ORC непосредственно взаимодействует с мРНК и комплексом TREX-2, было решено проверить взаимодействие ORC-комплекса с другими белковыми компонентами мРНП-частицы и комплексом ядерной поры.
Для решения этой задачи на первом этапе было проведено изучение распределения субъединиц комплекса ORC в S2 клетках D.melanogaster методом иммуноокрашивания. Бльшая часть Orc3, Orc4 и Orc5 локализуются в виде точек на периферии и внутри ядра, что совпадает с ранее полученными данными (Royzman, Austin et al. 1999; Giri, Chakraborty et al. 2016). Интересно, что субъединицы ORC-комплекса распределены в клетке сходным с Xmas-2 образом, характерным для других компонентов комплекса TREX-2 (Kurshakova, Krasnov et al. 2007). Кроме того, белки Orc3, Orc4 и Orc5 ко-локализуются с комплексом ядерной поры – NPC. Ко-локализацию с комплексом ядерной поры можно отнести к характерным чертам белков, принимающих участие в экспорте мРНП-частиц. Небольшое количество белков Orc3, Orc4 и Orc5 было также детектировано в цитоплазме клеток.
Далее нами была проведена проверка взаимодействий субъединиц комплекса ORC с компонентами пути экспорта мРНП-частицы в экспериментах по ко - 102 -иммунопреципитации. В частности, нами не было детектировано взаимодействие ORC с компонентами комплекса TREX белками Thoc5 и Hpr1. Однако было обнаружено и впоследствии подтверждено в in vitro экспериментах, что белок Orc3 непосредственно взаимодействует с рецептором ядерной поры Nxf1. Интересно, что по результатам аналогичных экспериментов, белок Orc5 взаимодействует c Nxf1 явно слабее, чем Orc3. Найденное ранее взаимодействие субъединиц ORC и рецептора ядерной поры Nxf1 было также подтверждено в экспериментах in vivo. Так, в S2 клетках дрозофилы нами обнаружено значительное перекрывание распределений белков Orc3 и Orc4 с Xmas-2 и Nxf1, как внутри ядер, так и на их периферии.
Белок Nxf1 является компонентом гетеродемера Nxf1-Nxt1 (у дрожжей Mex67p-Mtr2p), основного рецептора ядерной поры у D.melanogaster, поэтому полученные результаты о его взаимодействии с субъединицами ORC, вызвали у нас большой интерес. Из литературных источников известно, что у дрожжей с одной мРНП-частицей, взаимодействуют сразу несколько гетеродемеров Mex67p-Mtr2p (Valencia, Dias et al. 2008). В частности, белок Mex67p, гомолог Nxf1, может взаимодействовать с мРНП-частицей через один из компонентов комплекса THO – белком Hpr1p (Hobeika, Brockmann et al. 2009). Кроме того, Mex67p взаимодействует с белком Sac3 (гомолог Xmas-2) комплекса TREX-2 (Fischer, Strasser et al. 2002; Lei, Stern et al. 2003), считается, что Sac3 участвует в высвобождении Mex67p из мРНП-частицы на конечном этапе экспорта мРНК.
Поэтому найденное в рамках работы взаимодействие субъединиц комплекса ORC и рецептора ядерной поры Nxf1 послужило основанием для проверки участия ORC в ассоциации Nxf1 с мРНК. С этой целью были поставлены эксперименты по иммунопреципитации мРНК гена ras2 белком Nxf1 при истощении комплекса ORC, Результаты экспериментов показали, что истощение ORC отрицательно влияет на связь рецептора ядерной поры Nxf1 с мРНК. Так, истощение Orc5 – структурной субъединицы комплекса, значительно снижает уровень ассоциации белка Nxf1 с мРНК и позволяет сделать вывод об участии комплекса ORC в ассоциации Nxf1 с мРНК. Важно отметить, что уровень связанного с мРНК ras2 белка Thoc5 оставался неизменным, что свидетельствует о том, что наблюдаемый эффект взаимодействия Nxf1-мРНК не является результатом снижения уровня TREX.
Так как ранее было известно об участии белка Hpr1 в ассоциации Mex67p/Nxf1 с мРНП-частицей, мы попытались сравнить вклады комплексов ORC и TREX в ассоциацию Nxf1 с мРНК. Для этого была проведена иммунопреципитация мРНК гена ras2 белками Nxf1, Xmas-2, Orc3-5 при истощении белка Hpr1. Наши результаты подтверждают, что истощение белка Hpr1 действительно вызывает значительное снижение уровня -ассоциации белка Nxf1 с мРНК гена ras2. Однако нокдаун Hpr1 также вызывает сильное падение ассоциации белков Xmas-2 и Orс3 с мРНК ras2 и несколько менее существенное снижение для других субъединиц ORC. Вероятно, этот эффект связан с тем, что истощение Hpr1 приводит к нарушению работы комплекса TREX в элонгации транскрипции и формировании мРНП-частицы на ранних этапах.
Из всех выше описанных результатов можно сделать вывод, что комплекс ORC действительно взаимодействует с мРНК и белковыми компонентами мРНП-частицы и, более того, участвует в ассоциации Nxf1 с мРНК. Поэтому нами было сделано предположение, что ORC-комплекс может непосредственно участвовать в экспорте мРНК. Методом флуоресцентной гибридизации in situ мРНК гена ras2 при нокдауне Orc3 или Orc5 в клеточной линии S2 D.melanogaster мы выявили, что истощение субъединиц ORC вызывает накопление значительной части мРНК ras2 в ядре. Таким образом, мы подтвердили наше предположение о зависимости ядерного экспорта мРНК от комплекса ORC на примере мРНК гена ras2.
Поэтому в последующих экспериментах нами была проведена проверка влияния ORC на общий экспорт мРНК двумя альтернативными подходами. Было проанализировано влияние истощения белков ORC на общий экспорт мРНК методом флуоресцентной гибридизации in situ с использованием меченого Cy3 олиго-dT-зонда и на экспорт новосинтезированной РНК методом включения 5-этинилуридина во вновь синтезированную РНК. Оба использованных подхода показали сходные результаты. Действительно, истощение компонентов ORC (Orc3 или Orc5) приводило к значительным дефектам экспорта, как мРНК, так и новосинтезированной РНК в S2 клетках D.melanogaster.
Таким образом, в рамках диссертационной работы показано, что комплекс ORC принимает участие в экспорте мРНК и его субъединицы способствуют сборке комплекса мРНП-частицы у D. melanogaster. В частности, ORC взаимодействует с факторами экспорта мРНК, такими как комплекс TREX-2 и рецептором ядерной поры — Nxf1. Кроме того, истощение субъединиц ORC оказывает влияние на взаимодействие Nxf1 с мРНК и приводит к нарушению экспорта мРНК из ядра в цитоплазму.