Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1 Ишемический инсульт 9
1.1.1. Этиология и патогенез заболевания 9
1.1.2. Ядро инфаркта и зона пенумбры 10
1.2 Каскады ишемического повреждения 11
1.2.1. Нарушение энергетического метаболизма 11
1.2.2. Эксайтотоксичность 12
1.2.3. Оксидантный (окислительный) стресс 12
1.2.4. Усиление проницаемости гематоэнцефалического барьера в условиях ишемии
1.3 Генная экспрессия в условиях ишемии 15
1.4 Иммунный ответ и процессы постишемического воспаления
1.4.1. Воспаление: классическое представление 18
1.4.2. Микроглия и ее роль в постишемическом воспалении 19
1.4.3. Медиаторы воспаления 21
1.4.4. Цитокины и их функции в ЦНС 22
1.4.5. Хемокины и их функции в условиях ишемии 23
1.4.6. Каскад системы комплемента – важный путь иммунного ответа 24
1.4.7. Рекрутинг лейкоцитов в условиях ишемического повреждения тканей головного мозга 27
1.4.8. Лимфоциты в ЦНС в условиях ишемического повреждения 29
1.4.9. Дендритные клетки и их роль в постишемических событиях
1.5 Постишемическая иммунодепрессия 35
1.6 Пептидный нейропротекторный препарат семакс
1.6.1. Синтетический гептапептид семакс 37
1.6.2. АКТГ как прототип нейропептида семакс 39
1.6.3. Ноотропные и нейропротективные свойства семакса 40
1.6.4. Индукция генной транскрипции при ишемии: сложности интерпретации 41
Глава 2. Материалы и методы 43
2.1.Этапы организации эксперимента 43
2.1.1. Объект исследования 43
2.1.2. Моделирование фокальной церебральной ишемии 43
2.1.3. Формирование экспериментальных групп животных 43
2.2. Получение образцов для исследования 44
2.2.1. Используемые реактивы: растворы, буферы 44
2.2.2. Выделение суммарной РНК 45
2.2.3. Спектрофотометрическое определение концентрации РНК в суспензии 46
2.2.4. Проверка качества РНК с помощью электрофоретического разделения суммарной РНК в агарозном геле 46
2.2.5. Синтез одноцепочечной кДНК 47
2.3 Анализ экспрессии генов семейства ангиогенных факторов роста VEGF 48
2.3.1. Праймеры для реакции ПЦР в реальном времени 48
2.3.2. Реагенты для метода ПЦР в реальном времени. 48
2.3.3. Выполнение ПЦР в реальном времени 49
2.3.4. Статистический анализ данных 51
2.4 Анализ экспрессии генов семейства факторов роста с помощью панелей «RTІ
Profiler PCR Arrays» 52
2.4.1. Описание панелей генов факторов роста 52
2.4.2. Реагенты для метода ПЦР в реальном времени 53
2.4.3. Постановка ПЦР в реальном времени 53
2.4.4. Статистическая обработка данных по генной экспрессии 55
2.5 Анализ данных полногеномных микрочипов 55
2.5.1. Получение данных с чипов 55
2.5.2. Способы сравнения данных, выбор контрольных групп 55
2.5.3. Функциональный анализ полученных с микрочипов данных по изменению экспрессии генов 56
2.5.4. Доступ к данным исследования в интернете 57
Глава 3. Результаты 58
3.1. Влияние семакса и PGP на экспрессию генов семейства VEGF и их рецепторов в условиях перманентной фокальной ишемии мозга крыс 58
3.2. Изменение экспрессии генов факторов роста в мозге крыс под действием пептидов
3.2.1. Предмет анализа 60
3.2.2. Анализ экспрессии генов через 3ч после окклюзии СМА 61
3.2.3. Анализ экспрессии генов через 24ч после окклюзии СМА 63
3.2.4. Анализ экспрессии генов через 72ч после окклюзии СМА 65
3.3. Полногеномный анализ влияния пептидного препарата семакс на экспрессию генов при сравнении данных первым способом (см. 2.5.3.) 67
3.3.1. Изменение экспрессии генов под действием семакса 67
3.3.2. Определение молекулярной функции белковых продуктов генов, изменивших экспрессию в исследуемых условиях 68
3.3.3. Биологические процессы, статистически достоверно ассоциированные с генами, изменившими уровень экспрессии в ответ на введение семакса 71
3.4. Полногеномный анализ действия трипептида PGP на экспрессию генов при
сравнении данных первым способом 77
3.4.1. Определение функций белковых продуктов генов 77
3.4.2. Биологические процессы, ассоциированные с генами, уровень экспрессии которых меняется в ответ на введение PGP 81
3.5. Анализ транскрипционных профилей клеток коры головного мозга крыс под действием пептидов семакса и Pro-Gly-Pro в условиях ишемии с применением второго способа сравнения данных (24ч vs. 3ч) (см. 2.5.2.) 85
3.5.1. Сравнение данных, полученных при анализе транскриптомов мозга крысы в условиях ишемии и при воздействии семакса и PGP 85
3.5.2. Влияние ишемии и пептидов семакс и PGP на транскрипцию генов, белковые продукты которых определены как участники когнитивных функциях 87
3.5.3. Воздействие ишемии и пептидов семакс и PGP на ткани головного мозга 89
3.5.4. Действие семакса на гены, участвующие в ответе на стресс 91
3.5.5. Влияние пептидов на гены, кодирующие рибосомные белки 92
3.5.6. Воздействие пептидов на транскрипцию генов хемокинов в условиях ишемии 92
3.5.7. Семакс усиливает эффект, оказываемый ишемией на экспрессию генов интерферон-сигнального пути 95
3.5.8. Семакс воздействует на экспрессию генов, ассоциированных с гуморальным иммунным ответом и синтезом иммуноглобулинов, спустя сутки после окклюзии СМА 97
3.5.9. Выборочная проверка полученных с чипов данных методом ПЦР в реальном времени 100
Глава 4. Обсуждение 101
4.1. Выбор временных точек для анализа экспрессии генов 101
4.2. Изменение экспрессии генов семейства VEGF в экспериментальных условиях 101
4.3. Воздействие семакса и PGP на экспрессию генов факторов роста
4.3.1. Воздействие ишемии на экспрессию генов факторов роста 105
4.3.2. Изменение экспрессии генов факторов роста под воздействием семакса после окклюзии СМА 107
4.3.3. Эффекты PGP на экспрессию генов факторов роста после окклюзии СМА 110
4.4. Полногеномный транскриптомный анализ влияния семакса на экспрессию генов,
кодирующих белки иммунной и сосудистой систем (сравнение данных относительно
ишемии) 111
4.4.1. Различие профилей экспрессии генов через 3 и 24ч после окклюзии СМА при введении семакса 111
4.4.2. Отклик иммунной системы на введение семакса 112
4.4.3. Ответ сосудистой системы на введение нейропептида семакс 115
4.5. Трипептид PGP влияет на экспрессию генов в условиях фокальной ишемии мозга крыс 116
4.5.1. Изменение экспрессии генов и определение функций их белковых продуктов 116
4.5.2. Биологические процессы, ассоциированные с генами, уровень экспрессии которых меняется в ответ на введение PGP 118
4.6. Новые эффекты действия семакса и PGP на биологические процессы и сигнальные пути 120
4.6.1. Сравнение транскриптомных профилей «ишемия», «ишемия+семакс» и «ишемия+PGP» 120
4.6.2. Влияние ишемии и пептидов семакс и PGP на транскрипцию генов, белковые продукты которых определены как участники когнитивных функций 121
4.6.3. Снижение клеточной гибели в тканях головного мозга под действием семакса в условиях окклюзии СМА 122
4.6.4. Действие семакса на гены, участвующие в ответе на стресс 124
4.6.5. Сравнение влияния ишемии и семакса в условиях ишемии на транскрипцию генов, кодирующие рибосомные белки 125
4.6.6. Введение пептидов меняет набор экспрессирующихся при ишемии генов, кодирующих хемокины 126
4.6.7. Нейропротективный механизм действия интерферонов и его участие в эффектах семакса 128
4.6.8. Усиление активности гуморального иммунного ответа под воздействием семакса в течение первых суток после окклюзии СМА 130
Заключение 132
Выводы 136
Список сокращений 138
Словарь терминов 139
Список литературы 141
- Нарушение энергетического метаболизма
- Формирование экспериментальных групп животных
- Полногеномный анализ влияния пептидного препарата семакс на экспрессию генов при сравнении данных первым способом (см. 2.5.3.)
- Воздействие семакса и PGP на экспрессию генов факторов роста
Нарушение энергетического метаболизма
Эксайтотоксичность – это явление, относящиеся к вторичным повреждениям при инсульте. Как описано выше, эксайтотоксичные нейротрансмиттеры, в особенности глутамат, накапливаются в межклеточном пространстве. Увеличение количества глутамата ведёт к раздражению и активации глутаматных рецепторов, представляющих гетерогенную популяцию: -амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазол пропионовые (АМРА) и N-метил-D-аспарагиновые (NMDA) рецепторы глутамата. Их усиленная активация ведёт к увеличению потока ионов (Na+, Cl- и Ca2+) сквозь каналы, контролируемые вышеуказанными рецепторами. Увеличивающаяся концентрация внутриклеточного Ca2+, действующего как универсальный мессенджер, вызывает последующую массивную активацию фосфолипаз и протеаз, разрушающих мембрану и белки, необходимые для поддержания клеточной целостности, и генерации активных форм кислорода (ROS) [19]. Образование свободных радикалов и активация ферментов деградации приводит к гибели клеток посредством некроза, однако механизмы эксайтотоксичности могут инициировать молекулярные события, ведущие к апоптозу [9].
Внутриклеточные перегрузки ионами Ca2+ также вызывают деполяризацию мембран митохондрий, их разрушение, высвобождение цитохрома C и, как следствие, смерть нейронов [20]. Кроме того, следуя за ионами, внутрь клеток пассивно поступает вода, вследствие чего образуется цитотоксический отёк.
Окислительный стресс возникает, когда количество свободных радикалов в клетке превышает способность этой клетки производить антиоксиданты для защиты. В физиологических условиях кислородные радикалы возникают в звеньях аэробного дыхания в клетках и утилизируются антиоксидантной системой (супероксиддисмутаза; глутатион; глутатион-пероксидаза; витамины A, C, E, K; флавоноиды и т.д.) [21]. Но каскадные процессы ишемического инсульта нарушают этот баланс. Активные формы кислорода (ROS) и молекулы азота, окисляя макромолекулы клетки и взаимодействуя с сигнальными путями, наносят вред тканям при остром ишемическом инсульте [22, 23].
Ферментативные реакции, запущенные избытком ионов Ca2+ внутри клетки, разрушают клеточную мембрану и мембрану внутриклеточных органелл и высвобождают молекулы арахидоновой кислоты, метаболизм которой сопряжен с образованием реактивных свободных радикалов. Столь резкое усиление окислительных процессов в тканях на фоне недостаточности антиоксидантов и является началом окислительного стресса [2]. Таким образом, ишемия головного мозга способствует возникновению избыточного количества супероксида (O2 –), который, в свою очередь, является основным радикалом для образования перекиси водорода (H2O2). При этом перекись водорода является источником гидроксил-радикала (OH), особенно активного оксиданта, окисляющего белки и повреждающего структуру нуклеиновых кислот [24].
Ещё один важный свободный радикал – радикал оксида азота (NO), период полураспада которого всего несколько секунд. Он образуется из L-аргинина тремя видами азотных синтаз оксида (NOS). Свободнорадикальное соединение NO так же вследствие ряда реакций способено образовывать гидроксил-радикал (OH) [24].
Свободные радикалы являются причиной различных внутриклеточных эффектов, таких как инактивация ферментов, денатурация белка, перекисное окисление липидов, разрушение цитоскелета и повреждение ДНК [25, 26]. Также свободными радикалами нарушаются митохондриальные функции вследствие нарушения целостности мембран и окисления белков, участвующих в транспорте электронов и производстве молекул АТФ. Цитохром C попадает из митохондрий в цитоплазму клетки и запускает процессы апоптоза [25]. Помимо клеточных нарушений, окислительный стресс повышает проницаемость гематоэнцефалического барьера посредством активации маталлопротеиназ (MMPs), особенно MMP-2 и MMP-9, и разрушения белков плотных контактов клеток эндотелия сосудов [27]. Кроме того, свободные радикалы влияют непосредственно на мозговое кровообращение: они вызывают расширение просвета сосудов, опосредованное открытием калиевых каналов и эндотелиальным повреждением [28] [29]. В дополнение к этому они увеличивают агрегацию тромбоцитов [29].
Формирование экспериментальных групп животных
Через 3ч после начала эксперимента под воздействием ишемии изменили экспрессию 17 генов факторов роста (Табл.5). Из них девять генов (Il 18, Gdnf; Bmp 5, Bmp 10; Inh a; Inh bB; Cxcl 12; Bdnf; Fgf 2) увеличили свою экспрессию по сравнению с уровнем экспрессии соответствующих генов у ложнооперированных крыс. Наиболее заметно - в четыре раза - вырос уровень транскрипта гена Il 18. В то же время после окклюзии СМА экспрессия восьми генов (Ereg; Fgf 1, Fgf 10; Tdgf 1; Nodal; Lefty1; Il 1b, Il 2) снизилась в два и более раза по сравнению с контролем (Табл.5).
На фоне ишемии под действием семакса изменили уровень экспрессии 12 генов относительно влияния самой ишемии. Пептид не оказал воздействие на гены, экспрессия которых была увеличена в ответ на ишемию, но при этом статистически значимо повысил уровни транскриптов четырёх генов: Artn; Bmp8a; Inh bA; Spp1. В условиях ишемии под действием гексапептида снизилась экспрессия восьми генов. В ответ на окклюзию СМА уровень транскриптов пяти из их числа (Fgf3, Fgf 13, Hgf, Lep, Ntf3) не изменился, тогда как три гена (Ereg, Tdgf1 и Fgf 10) снизили свою экспрессию еще сильнее (Табл.5).
Под действием PGP через 3 ч после окклюзии СМА относительно действия ишемии статистически значимо увеличилась экспрессия 5 генов: в два раза возросла экспрессия генов Bdnf, Fgf , Igf 2, Zfp9, в пять раз - гена Inh bA. В тоже время снижение экспрессии было выявлено только для одного гена: экспрессия гена Сsf3 была снижена более чем в три раза по сравнению с контролем. Следует отметить, что в этой временной точке воздействие PGP на ген Spp1, вызывающий протективный эффект, было аналогично воздействию семакса, однако среднее значение изменения уровня его экспрессии не достигло 2.0 (Табл.5).
Табл.5 Изменение экспрессии генов факторов роста при фокальной ишемии в присутствии физиологического раствора, а также под действием семакса и трипептида PGP в мозге крыс через 3 часа после окклюзии левой СМА.
Примечание. Анализ экспрессии генов проводиди методом ОТ-ПЦР в реальном времени. Контролем для животных группы «ишемия» являлись ложнооперированные животные, для групп «ишемия+семакс» и «ишемия+PGP» - группа ишемизированных животных. Жирным шрифтом выделены статистически достоверные изменения экспрессии генов, в два и более раза отличающиеся от экспрессии соответствующих генов у контрольных животных. Направление стрелок и указывает на статистически значимые увеличения или снижения экспрессии генов относительно контроля. 3.2.3. Анализ экспрессии генов через 24ч после окклюзии СМА
Через сутки после коагуляции СМА под воздействием ишемии изменили экспрессию 26 генов факторов роста (Табл.6). При этом уровень экспрессии 5 генов (Spp 1, Igf 2, Lep, Clcf 1 и S100a6) по сравнению с уровнем экспрессии этих же генов у ложнооперированных животных вырос в несколько раз, тогда как остальные гены факторов роста (21 ген) снизили экспрессию от 2 до 4 раз (Табл.6).
Семакс через 24ч после операции воздействует на экспрессию 11 генов факторов роста, 3 из которых (Spp 1, Lep, Lif) существенно изменили экспрессию под воздействием ишемии. Так, ишемия привела к увеличению уровня транскриптов генов Spp 1 (8.43) и Lep (5.99), к снижению -транскриптов Lif (0.40) (Табл.6). На фоне повышения уровня экспрессии, которое мы наблюдали при ишемии, под воздействием семакса еще значительнее увеличилась экспрессия гена Spp 1 (2.28), тогда как экспрессия генов Lep и Lif была снижена при этом в три и четыре раза соответственно (Табл.6). Семакс не оказал воздействия на большинство генов, экспрессия которых была снижена при ишемии, но в тоже время снизил уровень транскрипции восьми генов: Cxcl1; Fgf 2, Fgf 3, Fgf 8; Ereg; Tdgf1; Ntf 3 и Il 3 (Табл.6).
Спустя сутки после операции PGP оказал влияние всего на 4 гена факторов роста по сравнению с животными группы «ишемия», получавшими физиологический раствор (Табл.6). По сравнению с контролем трипептид увеличил экспрессию гена Spp 1 в два раза, оказав тем самым эффект, схожий с действием семакса. Также PGP оказал понижающий эффект на уровень транскрипции генов Il6 и Csf3, а также – на экспрессию гена Il 11, который уже был снижен под действием ишемии (Табл.6). Под действием трипептида также зафиксировано статистически достоверное снижение экспрессии гена Lif, однако среднее значение изменения экспрессии данного гена не привысило двух раз (0.62) (Табл.6, Рис.1). Табл.6 Изменение экспрессии генов факторов роста при фокальной ишемии в присутствии физиологического раствора, а также под действием семакса и трипептида PGP в мозге крыс через 24 часа после окклюзии левой СМА
Спустя 72ч после окклюзии СМА в мозге крыс изменили экспрессию 24 гена (Табл.7). Для половины генов из их числа выявлено увеличение уровня экспрессии от двух до пяти раз, для оставшихся – снижение экспрессии по сравнению с ложнооперированными животными. Наиболее заметно, более чем в 9 раз, вырос уровень транскрипции гена Spp 1, тогда как наиболее заметное снижение (в пять раз), выявлено для транскриптов гена Il 4 (Табл.7). Под воздействием семакса через 72ч после окклюзии изменилась экспрессия 32 генов (Табл.7). Периодическое введение пептида привело к увеличению экспрессии 12 генов факторов роста, из них наиболее сильное изменение (в 10 и более раз) было показано для четырёх генов: Il 6, Artn, Csf3 и Il 1b (Табл.7). Под влиянием семакса мы наблюдали снижение экспрессии 20 генов факторов роста (Табл.7). На 7 генов из их числа (Il 1b; Csf3; Fgf 1, Fgf 14; Cxcl 12; Bmp 5, Bmp 6) воздействие семакса было противоположно действию ишемии. Эффект препарата на остальные гены преимущественно совпадал с изменениями, вызванными ишемией (Табл.7).
Через 72ч после начала ишемии PGP изменил уровни транскриптов 15 генов (Табл.7). В этой временной точке действие трипептида заметно перекрывается с действием семакса (Табл.7). При действии PGP увеличение экспрессии генов факторов роста относительно уровня экспрессии генов у ишемизированных животных было обнаружено лишь для двух генов: Artn и Gdf 8, снижение экспрессии более чем в 10 раз наблюдали у гена Gdnf. Противоположный эффект семакс и PGP оказали на гены Il 11 и Gdf 8: семакс увеличил уровень транскриптов гена Il 11 (2.52) и снизил экспрессию гена Gdf 8 (0.29); действие трипептида на эти два гена было обратным (Табл.7). Также PGP продемонстрировал эффект, отличный от действия семакса, на несколько генов IL-6 подобных цитокинов (Il 6, Il 11, Lif), представленных на используемой нами панели (Рис.7).
Полногеномный анализ влияния пептидного препарата семакс на экспрессию генов при сравнении данных первым способом (см. 2.5.3.)
Гены факторов роста уже долгое время являются предметом исследования в моделях ишемии головного мозга. Данные об изменении экспрессии генов факторов роста при церебральной ишемии существенно различаются. В основе этого лежат отличия как в постановке вариантов моделей (способ и длительность окклюзии сосудов, используемые анестетики т.д.), так и в методах получения образцов и времени, прошедшего после начала эксперимента [199].
На основе данной модели фокальной ишемии мозга ранее было показано воздействие семакса и трипептида PGP на экспрессию генов нейротрофинов [165]. Поэтому мы продолжили изучение воздействия семакса и PGP на экспрессию других генов факторов роста в условиях фокальной ишемии. По нашим данным спустя 3ч после необратимой окклюзии СМА достоверно изменили экспрессию 17 генов факторов роста, при этом число генов, увеличивших и снизивших уровни транскрипции, мало отличается (Табл.5). Уровни изменения экспрессии генов варьируют при этом от 2.0 до 2.5 раз относительно контроля. В числе генов, увеличивших транскрипцию, наряду с геном провоспалительных медиаторов (Il 18) [200, 201], присутствуют гены факторов роста с нейропротективными свойствами (Gdnf, Bdnf, Fgf2) [202–204]. Транскрипция генов с разнонаправленным эффектом в этот момент времени, возможно, объясняется тем, что основным типом клеток, секретирующих эти два вида медиаторов (про- и противовоспалительные) на ранних стадиях ишемии, является микроглия. Недавние исследования показали, что в первые часы ишемии микроглия представлена своим нейропротективным фенотипом М2, но с течением времени её клетки постепенно трансформируются в провоспалительный фенотип М1. При этом процессы изменения фенотипа клеток микроглии направляются ишемизированными нейронами [65].
По мере развития ишемического процесса, спустя 24ч после окклюзии СМА, мы наблюдаем преимущественно снижение экспрессии генов факторов роста: 21 из 26 генов, достоверно изменивших экспрессию, снизил свою транскрипцию (Табл.6). Однако при этом значительно увеличивается уровень экспрессии нескольких генов (Igf2, Spp1, Lep), продукты которых, по данным литературы, участвуют в регуляции постишемических патогенных и иммунных процессов [205, 206].
Через 72ч ишемия достоверно оказала воздействие на уровень транскриптов 24 генов, среди которых увеличение и снижение экспрессии наблюдается у равного числа генов факторов роста (Табл.7). В этот период времени в секреции факторов роста участвуют как активные резидентные (микроглия и астроциты), так и иммунные клетки. При этом также изменяется уровень экспрессии генов, кодирующих как провоспалительные, так и противовоспалительные медиаторы, которые, в свою очередь, причастны к сложным межклеточным взаимодействиям [68]. Существенно увеличенный уровень экспрессии генов Spp1 и Csf1 в этот момент времени участвует, по-видимому, в процессах восстановления поврежденных тканей мозга (Табл.7). По данным литературы протективные свойства этих факторов роста были выявлены в нейродегенеративных условиях, включая церебральную ишемию [68, 207– 212]. В таблице Доп.Табл.1 представлен ряд данных, полученных и опубликованных большим числом исследователей, свидетельствующих о нейропротективных свойствах (стимуляции ангиогенеза, снижение размера очага повреждения и улучшении состояние пациентов, перенёсших инсульт) ряда факторов роста, кодируемых исследуемыми нами генами.
В ответ на введение семакса изменение экспрессии отдельных генов факторов роста детектируется во все исследованные промежутки времени после окклюзии СМА, однако наиболее заметный эффект пептида -снижение уровня транскриптов 20 генов и увеличение экспрессии 12 генов факторов роста - наблюдается спустя 72ч после начала ишемии. Хорошо известно, что спустя трое суток после окклюзии СМА, на фоне замедления роста пенумбры активированная микроглия индуцирует и поддерживает воспалительную реакцию в очаге ишемии. Снижение экспрессии большого числа генов факторов роста, обнаруженное нами под воздействием семакса спустя 72ч после окклюзии СМА, возможно, отражает угнетение микроглии, торможение глиальных реакций воспаления. Интересно, что в исследованные интервалы времени мы не обнаружили заметного воздействия препарата на экспрессию генов, изменивших ее в ответ на ишемию у животных, получавших физраствор. Пептид преимущественно воздействовал на экспрессию генов, на которые ишемическое повреждение не оказало заметного эффекта (Табл.5-7). Можно предположить, что воздействие семакса запускает дополнительные протективные механизмы в клетках, затронутых повреждением, либо активизирует группы клеток, еще не подвергшихся воздействию ишемией. Под воздействием семакса спустя 72ч после окклюзии СМА был выявлен выраженный ответ генов Csf3, Artn, а также генов цитокинов Il 1b и Il 6, экспрессия которых под действием препарата была увеличена в 10 и более раз. Согласно данным литературы, продукты генов Csf3 и Artn оказывают нейропротективный эффект (Доп.Табл.1). Что касается цитокинов, то долгое время по направленности воздействия их разделяли на два типа: противовоспалительные (или протективные) и провоспалительные (оказывающие отрицательный эффект на клетки мозга). Однако в настоящее время стало понятно, что такое разделение достаточно условно, поскольку не отражает все свойства определенных цитокинов, которые гораздо шире и сложнее, чем представлялось ранее. Ярким примером таких цитокинов является Il 1b. В нашем исследовании спустя 3 суток после начала ишемии под действием семакса был существенно увеличен уровень экспрессии гена Il 1b. На сегодняшний день большое число исследований данного интерлейкина описывают противоречивые эффекты, оказываемые им. Ряд работ свидетельствует об его участии в патогенезе ишемического повреждения головного мозга [213–215]. Являясь важным медиатором воспалительного ответа, Il 1b участвует в активации таких процессов как пролиферация, Дифференцировка и апоптоз. В исследованиях на экспериментальных моделях было показано, что блокирование его связывания с рецептором значительно сокращает повреждение ЦНС [216]. По данным литературы Il 1b усиливает чувствительность нейронов к гипоксии и эксайтотоксичности [214].
Воздействие семакса и PGP на экспрессию генов факторов роста
Основным различием экспрессии генов Интерферон-сигнального пути в группах «ишемия» и «ишемия+семакс» является небольшое увеличение экспрессии гена Ptpn2 в первой группе. Белок Ptpn2 – это ключевой регуляторный элемент в сети, поскольку является лимитирующим звеном данного сигнального пути (Рис.15). Ptpn2 осуществляет отрицательную регуляцию белков Jak1 и Jak3, они же, в свою очередь, передают сигнал от интерферонов (IFN) I типа (IFN- И IFN-) [291, 292]. Введение семакса предотвращает увеличение экспрессии гена Ptpn2, запущенное ишемией, что, вероятно, наряду с сигналом IFN- усиливает и сигнал от интерферонов I типа. Имеются данные, что IFN- предотвращает инфильтрацию нейтрофилов и уменьшает разрушение ГЭБ [293]. На модели тромбоэмболической церебральной ишемии применение IFN- дало положительный результат [294], однако клинические испытания IFN- не увенчались успехом [295]. Предполагается существование нейропротективного механизма, в основе которого лежит передача сигнала интерферонами I типа. В воздействии на данный механизм заложен большой потенциал для разработки подходов лечения пациентов, перенесших инсульт [296].
В данной работе все ДЭГ трех групп, принимающие участие в Интерферон-сигнальном пути, свою экспрессию увеличили (Рис.15). Хорошо известно, что Ifi47 относится к белкам (Immunity-Related GTPase Family), индуцируемым IFN-, которые представляют одну из самых сильных систем иммунного противостояния внутриклеточным возбудителям заболеваний у грызунов. Однако данная система защиты отсутствует у человека [297]. В соответствии нашим данным ишемия и семакс оказали воздействие на ген Irf7. Его белковый продукт является транскрипционным фактором, участвующим в противовирусной иммунной реакции, и необходим для индукции интерферонов I типа [298]. В глиальных клетках в ответ на повреждение ЦНС увеличивается экспрессии гена Irf7, а также гена интерферона Irf9, что, помимо прочего, указывает на их причастность к неинфекционному ответу иммунитета [299]. Показано, что Mx1 также вовлечен в интерферонный сигнальный путь и является следствием запуска интерферонов I типа в астроцитах [300]. Информационная РНК гена Mx1, как и его белок, являются надежными маркерами биологической активности IFN типа I, в частности IFN- [301]. Возможно, семакс на фоне ишемии, воздействуя на описанные гены, усиливает сигнал от интерферонов I типа, инициирующий нейропротектцию, что может быть одной из составляющих механизма действия пептида.
Введение семакса оказало заметное воздействие на экспрессию генов, ассоциированных с Антигенпредставляющим сигнальным путем. Это означает, что была затронута экспрессия генов, участвующих в представлении антигенов на поверхности CD4+ и CD8+ T-клеток. При этом высокий бал, присвоенный данному сигнальному пути при ранжировании, говорит о том, что под действие семакса попали его ключевые гены.
В группах «ишемия» и «ишемия+семакс» с достаточной степенью значимости изменили экспрессию гены, относящиеся к синтезу иммуноглобулинов (Ig) класса G, хотя список ДЭГ в обоих случаях совпадает лишь частично. Как было отмечено выше, мы наблюдали увеличение экспрессии генов, кодирующих иммуноглобулины, под воздействием семакса через 24ч после окклюзии СМА относительно их экспрессии при ишемии в этой же временной точке.
Молекулы иммуноглобулинов класса G (IgG) являются наиболее распространенной группой антител как у человека, так и у грызунов. Это семейство молекул состоит из четырех подклассов (IgG1-IgG4 у человека; IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 у грызунов), необходимых организму для борьбы с инфекциями и токсинами [302]. Однако помимо этого, была описана противовоспалительная активность IgG [302]. Препарат IVIg (IntraVenous Immunoglobulins), состоящий из смеси IgG, собранных у тысячи здоровых доноров и вводимый внутривенно, имеет клиническое применение: IVIg используются для подавления патологических иммунных реакций, которые возникают при аутоиммунных заболеваниях и заболеваниях со сложной иммунной составляющей [240, 303, 304]. Считается, что применение IVIg является одной из концепций лечения острого инсульта [305]. Событию, когда молекулы иммуноглобулина, способствующие патологии в иммунологическом заболевании, используются в противовоспалительном лечении того же самого заболевания, дали название «иммуноглобулинового парадокса» [306].
Интересно, что в группе «ишемии+семакс» было обнаружено значительное увеличение уровня транскрипта гена Igh-1a, кодирующего тяжёлую цепь иммуноглобулинов G подкласса IgG2a. В последнее время неоднократно было показано, что IVIg проявляет защитные свойства тканей головного мозга и снижает выраженность последующего неврологического дефицита в исследованиях церебральной ишемии [307– 310]. Механизмы положительного воздействия IgG на ишемизированные ткани головного мозга доподлинно неизвестны. IVIg увеличивает количество периферических иммуносупрессорных клеток Treg и усиливает их функции [311]. Воздействие на пролиферацию Treg клеток, используя Fc-фрагменты тяжёлой цепи (кодируемой у грызунов геном Igh-1a), является одним из предполагаемых механизмов защитного действия IVIg [312]. Увеличение под действием семакса синтеза тяжёлой цепи иммуноглобулина класса G (Igh-1a) в несколько десятков раз может иметь схожие с введением IVIg противовоспалительные последствия в условиях разрушительных процессов, следующих за ишемическими повреждениями тканей головного мозга, и быть частью молекулярного механизма, осуществляющего нейропротективный эффект семакса в условиях ишемии.