Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 11
1.1. Белок врожденного иммунитета Tag7 11
1.2. Пептидогликан-распознающие белки 11
1.3. Моноциты, макрофаги и дендритные клетки 16
1.4. Адаптивный иммунный ответ 19
1.5. Активация Т-лимфоцитов 20
1.6. Роль цитокинов в индукции иммунного ответа 22
1.7. Программируемая клеточная смерть 28
1.7.1. Апоптоз 28
1.7.2. Некроптоз 31
1.8. Механизм избегания иммунного ответа 35
2. Материалы и методы 37
2.1. Получение и очистка белков 37
2.2. Культивирование трансформированных клеточных линий 37
2.3. Выделение лимфоцитов из лейкомассы 38
2.4. Выделение моноцитов, NK, CD4+ и CD8+ лимфоцитов 38
2.5. Измерение цитотоксичности 39
2.6. Ингибирование 39
2.7. Проточная цитофлуориметрия 40
2.8. Электрофорез и вестерн-блоттинг 40
2.9. Биотинилирование пептидов 41
2.10. MALDI 41
2.11. Хроматография 41
2.12. ИФА 42
2.13. Количественный ПЦР 42
2.14. Пептиды 43
2.15. Статистический анализ 44
3. Результаты и обсуждение 45
3.1. Инкубация РВМС с белком врожденного иммунитета Tag7 приводит к формированию цитотоксических лимфоцитов 45
3.2. Инкубация Tag7 с РВМС приводит к формированию 3 цитотоксических субпопуляций лимфоцитов: NK (CD16+CD56+), CD3+CD4+, CD3+CD8+ 51
3.3. Сравнение действия Tag7, Tilorone и IL2 на формирование цитотоксических субпопуляций лимфоцитов 59
3.4. Tag7-активированные лимфоциты способны индуцировать 2 типа клеточной смерти: апоптоз и некроптоз 72
3.5. Определение минимальных структурных фрагментов белка врожденного иммунитета Tag7, необходимых для связывания и активации TREM1 79
Заключение 86
Выводы 89
Список используемой литературы 90
- Пептидогликан-распознающие белки
- Некроптоз
- Инкубация Tag7 с РВМС приводит к формированию 3 цитотоксических субпопуляций лимфоцитов: NK (CD16+CD56+), CD3+CD4+, CD3+CD8+
- Определение минимальных структурных фрагментов белка врожденного иммунитета Tag7, необходимых для связывания и активации TREM1
Пептидогликан-распознающие белки
PGRPs впервые были найдены в гемолимфе насекомых как белки, связывающие пептидогликан клеточной стенки бактерий и активирующие антимикробный иммунный ответ [4].
Клонирование генов PGRPs позволило определить их у насекомых, моллюсков и позвоночных, при этом гены подобных белков у нематод и растений найдены не были. Например, у Drosophila обнаружено 13 генов, кодирующих 19 видов PGRPs. Стоит отметить, что у каждого белка семейства есть по крайней мере один консервативный домен, похожий на N-acetylmuramyl-alanine amidases: бактериальные амидазы и лизоцимы бактеориофагов, что может указывать на происхождение этой группы белков [5].
PGRPs насекомых классифицируют по длине транскриптов: экстраклеточные PGRP-S (короткая форма) и PGRP-L длинная форма. Связывание PGN клеточной стенки бактерий приводит к активации Imd- или Toll- сигнальных путей. Активация Imd – пути происходит в ответ на бактериальную инфекцию и вызывает синтез антимикробных пептидов, в частности дипте-рицина. Взаимодействие с грамположительными бактериями и грибами приводит к запуску Toll-пути и секреции дрозомицина [6]. Связывание пептидогликана всегда является только первым шагом в активации сигнальных путей. Например, связывание PGRP-SA с пептидоглика-ном грамположительных бактерий (Lysype PGN) запускает каскад серино-вых протеаз, которые переводят лиганд Толл-рецептора proSptzle в активную форму Sptzle (Spz) [7].
Активация Imd – пути зависит от участия трансмембранных белков PGRP-LC и PGRP –LE, которые распознают пептидогликан грамотрицатель-ных бактерий экстраклеточными доменами и передают сигнал на Imd, используя внутриклеточные домены [8].
У человека обнаружены 4 формы PGRPs: PGLYRP1, PGLYRP2, PGLYRP3 и PGLYRP4. PGLYRP1 (20кДа) имеет сигнальный пептид и один PGRP домен. PGLYRP1, PGLYRP3 и PGLYRP4 обладают прямым бактерицидным действием против грамположительных и грамотрицательных бактерий. PGLYRP2 – фермент с пептидогликан - аминогидролазной активностью.
Ген PGLYRP1 или PGRP-S (Tag7) экспрессируется преимущественно в костном мозге и полиморфонуклеарных клетках и их предшественниках, белок обнаруживается в секреторных гранулах. Сравнительно низкий уровень экспрессии PGLYRP1 характерен для многих не иммунных клеток, в частности, для эпителиальных клеток и фибробластов [5,9].
PGLYRP2 экпрессируется клетками печени, где он секретируется в кровь. Но его экспрессия может быть индуцирована также в эпителиальных клетках и фибробластах в ответ на бактериальную инфекцию [10].
Белки PGLYRP3 и PGLYRP4 обнаружены в клетках эпидермиса кожи, волосяных фолликулах, потовых и сальных железах, эпителии рта и ЖКТ [11].
Анализ кристаллической структуры PGLYRP1 и PGLYRP3 показал, что PGRP домен несет лиганд-связывающую петлю, которая узнает специфическую последовательность пептидогликана, связывая тетра- и пента- пептиды GlcNAc- MurNAc с высокой аффинностью и при этом не взаимодействует с димером или пептидом без MurNAc [12–14].
Мыши с нокаутом гена PGRP-S (PGRP-S - / -) обладают повышенной восприимчивостью к внутрибрюшинной инфекции грамположительными бактериями с низкой патогенностью, но не с более патогенными грамполо-жительными или грамотрицательными бактериями. Мыши PGRP-S - / - демонстрируют нормальные воспалительные реакции и продукцию фактора некроза опухоли альфа (TNF) и интерлейкина 6 (IL6). Нейтрофилы от мышей PGRP-S - / - обладают нормальным фагоцитарным поглощением бактерий, но имеют дефекты при внутриклеточном уничтожении и переваривании относительно непатогенных грамположительных бактерий. Следовательно, PGRP-S млекопитающих принимает участие во внутриклеточном уничтожении бактерий. Таким образом, от насекомых до млекопитающих сохраняется только распознавание бактерий PGRP-S, но не его эффекторная функция [15].
Механизм действия PGRPs остается до конца не изученным. Очевидно, что PGRPs способны встраиваться в клеточную стенку бактерий и запускать разные виды стресса (оксидативный, тиоловый и металл-индуцированный), которые приводят к гибели чужеродной клетки. Оксидативный стресс наступает при блокировании дыхательной цепи в результате гиперпродукции H2O2. PGRPs также увеличивают концентрацию внутриклеточных ионов Zn2+ и способствуют уменьшению количества тиола в цитозоле.
Механизм бактерицидной активности PGRPs отличается от активности антибиотиков, ингибирующих синтез пептидогликана, РНК или ДНК и отличается от противомикробных пептидов, пермеабилизирующих мембрану и ферментов, гидролизующих клеточную стенку.
При контакте с грамположительными бактериями, PGRPs связывают пептидогликан бактериальной клеточной стенки в сайте ферментативного гидролиза (LytE LytF B. Subtilis). У грамотрицательных бактерий распознавание происходит по всей мембране [15–17]. Взаимодействие PGRPs – PGN, возможно, индуцирует олигомеризацию в ленточные структуры и активируют двухкомпонентную систему: деполяризация мембраны, продукция ОН, ингибирование главных внутриклеточных процессов биосинтеза [18,19]. Последовательность, возможно, инициируется истощением энергетических ресурсов, таких как АТФ, накопление которого зависит от мембранного потенциала [20,21].
Функционирование группы пептидогликан-распознающих белков не ограничивается бактерицидным действием: показана роль PGLYRP1 в противоопухолевом иммунитете.
PGLYRP1(Tag7) способен образовывать комплекс с белком теплового шока Hsp70 в молярном соотношении 1:1. Полученный комплекс вызывает гибель HLA(-) опухолевых клеток, путем индукции в них двух видов программируемой клеточной смерти: апоптоза и некроптоза. При этом, Tag7 не проявляет никакой цитотоксической активности. В экспериментах in vitro показано, что Tag7- Hsp70 комплекс связывается с TNFR1 – рецептором на поверхности опухолевых клеток и индуцирует сигнальные каскады, которые приводят к гибели клетки. Было также установлено, что один из компонентов комплекса - Tag7, может связываться с TNFR1, блокируя последующее цито-токсическое действие Tag7- Hsp70 или TNF- [22]. Одним из источников Tag7- Hsp70 комплекса являются цитотоксические Т-лимфоциты. В частности, было показано, что в PBMC здоровых доноров, инкубированных в течение 6 суток с IL2, появляется субпопуляция цитотоксически активных лимфоцитов, которые секретируют данный комплекс после взаимодействия с К562 клетками [23]. Интересно, что формирование комплекса Tag7- Hsp70 происходит при межклеточном контакте. Экспериментально доказано, что Tag7 может быть экспрессирован на поверхности цитотоксических Т-лимфоцитов, и способен распознавать белок теплового шока Hsp70 на мембране опухолевых клеток. Такое взаимодействие является важным элементом узнавания цитотоксическим лимфоцитом клетки-мишени и необходимо для дальнейшей индукции клеточной смерти [24].
В системе in vivo используют трансфицированные геном Tag7 опухолевые клетки. Опухолевые клетки, полученные от больных с меланомой и метастатическим почечно-клеточным раком, трансфицировали геном Tag7, облучали и вводили каждые 3 недели. Прививки хорошо переносились всеми пациентами без клинически значимых признаков токсичности. Гиперчувствительность замедленного типа наблюдалась в 48% случаев. Противоопухолевый иммунный ответ наблюдался у 95% пациентов. Не было никаких полных или частичных ответов; однако, у одного пациента с почечно-клеточным раком был достигнут незначительный ответ. Стабилизация опухолевого заболевания наблюдалась у восьми пациентов (семь с злокачественной меланомой и один с почечно-клеточным раком). Среднее время до прогрессирования опухоли было 3 месяца [25].
В данном случае механизм противоопухолевого иммунного ответа до конца не изучен и требует дальнейших исследований.
Действие Tag7 не ограничивается проявлением его цитотоксической активности против опухолевых клеток. Было показано, что он способен связываться с белком Mts1/S100A4, который характерен для некоторых метастази-рующих опухолей, а также выделяется в среду лимфоцитами. Образованный Tag7-Mts1 комплекс обладает хемоаттрактивной активностью по отношению к некоторым субпопуляциям лимфоцитов, в большей степени к натуральным киллерам. Стоит также отметить, что между тремя белками: Tag7, Hsp70 и Mts1 имеет место быть конкурентное связывание, иными словами, наличие в среде Mts1 может разрушать цитотоксический комплекс Tag7- Hsp70, инги-бируя его активность [26].
Недавно обнаружена еще одна функция Tag7 – его способность связываться с TREM1 рецептором на поверхности моноцитов/макрофагов и нейтрофилов [2].
Некроптоз
Опухолевые клетки способны подавлять апоптотические каскады, стимулируя клетку к выживанию и дальнейшему делению. Последние исследования демонстрируют, что ПКС не ограничивается каспаз-зависимым апоптозом, но включает и некроптоз, форму некротической смерти, при которой активируются RIP1 (Receptor-Interacting Protein 1), RIP3 и MLKL (Mixed Lineage Kinase Domain-Like). Некроптоз служит альтернативным способом уничтожения клеток в ответ на сильный стресс и блок апоптоза, но может быть вызван и воспалительными цитокинами или химиотерапевтиче-скими препаратами. В отличие от апоптоза, некроптоз вызывает более сильный иммунный ответ, который может функционировать как защитный механизм, устраняя вызывающие опухоль мутации и вирусы. Кроме того, несколько классов противоопухолевых агентов, находящихся в настоящее время в стадии клинической разработки, таких как миметики SMAC и BH3, могут способствовать некроптозу в дополнение к апоптозу [77].
Некроптотические клетки имеют несколько морфологических особенностей некроза, таких как ранняя потеря целостности плазматической мембраны, полупрозрачный цитозоль и набухание митохондрий.
На молекулярном уровне некроптоз не зависит от каспаз и передает сигналы через RIP1, RIP3 и MLKL, в то время как апоптоз требует активации каспазы и опосредуется взаимодействием белков семейства Bcl-2 или активацией рецепторов смерти. Другой ключевой особенностью некроптоза является то, что проницаемость плазматической мембраны может привести к высвобождению так называемых Damage-Associated Molecular Patterns (DAMPs), таких как белок группы 1 высокой подвижности (HMGB1) и мито-хондриальной ДНК, которые могут вызвать сильный иммунный ответ и воспаление [17,78,79]. Напротив, следы апоптотических клеток поглощаются, а затем растворяются в процессе фагоцитоза [80]. Индукция некроптоза происходит через семейство рецепторов смерти. После стимуляции лиганда происходит взаимодействие доменов смерти с RIP1 и рекрутирование ингибиторных белков апоптоза (cIAPs), таких как cIAP1 и cIAP2, с образованием комплекса, ассоциированного с плазматической мембраной, что приводит к активации сигнального каскада выживания NF-B/MAPKs. В ходе этого процесса RIP1 полиубиквитинилируется cIAPs и другими E3 убиквитин-лигазами. Аутоубиквитинилирование и последующая деградация cIAPs, которая стимулируется SMAC или малыми молекулами -миметиками SMAC (также известными как ингибиторы IAP) [81–83], способствует деубиквитинилированию RIP1 деубиквитиназами, включая CYLD и A20 [84,85]. Связывание RIP1 с FADD рекрутирует прокаспазу 8 [82], что приводит к активации каспазы 8 и индукции апоптоза. Активированная кас-паза-8 ингибирует некроптоз, расщепляя основные регуляторы некроптоза, такие как RIP1 и RIP3 [86,87]. Если активность каспазы-8 снижается ингибиторами каспазы или генетическим нокаутом, способ гибели клеток переключается на некроптоз. RIP3 и RIP1 связываются друг с другом через домены RHIM с образованием функционального сигнального комплекса [88]. Сборка комплекса приводит к автофосфорилированию RIP3 по серину 227 и последующему привлечению псевдокиназы MLKL [89]. Важно отметить, что в отличие от RIP3, которая постоянно элиминируется, RIP1 является плеотроп-ным белком и может как позитивно, так и негативно регулировать некроптоз и активность RIP3. Например, было показано, что RIP1 подавляет спонтанную активацию RIP3 в цитозоле.
MLKL обычно неактивен в качестве мономера в цитоплазме, благодаря своему киназ-подобному домену. После активации, RIP3 связывается с MLKL через свой киназный домен, чтобы стимулировать фосфорилирование MLKL по остаткам треонина 357 и серина 358 , что дестабилизирует мономерную структуру MLKL и способствует его олигомеризации [89,90]. Олигомеризованный MLKL, который имеет сродство к фосфатидилинозитоль-ным липидам и кардиолипину, транслоцируется из цитозоля в мембраны, где он нарушает ее целостность, способствуя смерти от некроптоза.
Было предложено несколько различных механизмов для объяснения того, как олигомеризованный MLKL вызывает гибель клеток. Например, было высказано предположение, что олигомеризованный MLKL может способствовать притоку кальция через белок TRPM7 кальциевого канала или притоку натрия, способствуя гибели клеток [91,92]. Тем не менее, остается вопрос о том, является ли наблюдаемый приток ионов в некроптотических клетках следствием или причиной гибели клеток [93]. Продукция активных форм кислорода (АФК) из-за нарушения целостности митохондриальной мембраны с помощью MLKL также может способствовать смерти от некроптоза [94].
Увеличение количества АФК связывают с последующей гиперполяризацией мембраны митохондрий, пермеабилизацией мембраны лизосом, оксида-тивным взрывом и разрушением целостности плазматической мембраны. RIP1 ингибирует активность митохондриальной ANT (АДФ/АТФ транслока-зы), уменьшая уровень АТФ в клетке [95].
Есть и другие модуляторы некроптоза: PAR полимеры, PARP1, NADPH-оксидаза, способные активировать RIP киназы, усиливать продукцию АФК и кальпаинов (осуществляют Са2+ - зависимую деструкцию цитоскелета) [96]. Ингибиторы RIP-киназ - некростатины, впервые описаны и изучены Degterev et al. В частности, Nec-1 (Necrostatin-1) связывает RIP 1 и оставляет ее в неактивной форме, некроптоз блокируется [97].
Активация TNF –рецептора изначально может инициировать апоптоз, но накапливается больше АФК, проницаемость мембран митохондрий увеличивается, поэтому происходит переключение на некроптоз.
Инкубация Tag7 с РВМС приводит к формированию 3 цитотоксических субпопуляций лимфоцитов: NK (CD16+CD56+), CD3+CD4+, CD3+CD8+
Как продемонстрировано выше (Рис.2В), мы наблюдаем два пика цито-токсической активности: на 4 и 6 сутки после добавления Tag7. Нашей задачей было выяснить, какие популяции присутствуют в РВМС и какие из них реализуют цитотоксическую функцию. Классическими цитотоксическими клетками в контексте иммунной защиты являются Т-, В- лимфоциты, NK, макрофаги. При инкубации РВМС с Tag7 появляются лимфоциты, которые способны элиминировать опухолевые клеточные линии. Способность распознавать трансформированные клетки организма характерны для Т-клеток и NK. Макрофаги демонстрируют антибактериальную активность, а В-лимфоциты реализуют свои функции посредством секреции антител. В нашей системе мы наблюдаем смерть клеток-мишеней после инкубации с активированными Tag7 РВМС, поэтому нашей задачей было исследовать лимфоциты, которые могут распознавать мишень и индуцировать гибель клетки контактным путем, а также реализовать свою цитотоксическую активность без предварительной презентации антигена.
Используя метод проточной цитофлуориметрии мы определили процентное соотношение эффекторных лимфоцитов после добавления Tag7. На 4 сутки в системе детектируются три типа клеток: NK, CD4 и CD8, на 6 сутки - CD4 и CD8 (Рис.6А). Мы показали, что количество NK (CD16+CD56+) достигает максимума на 3-4 сутки, после чего стремительно падает. Для определения активных субпопуляций лимфоцитов на 4 и 6 сутки мы использовали метод магнитной сепарации, с помощью которого на 4 и 6 сутки после инкубации с Tag7 были выделены чистые субпопуляции NK, CD4 и CD8. Как видно из результатов, представленных на (А) Соотношение клеток в РВМС после добавления Tag7 на 3-6 сутки измеряли методом проточной цитометрии, используя конъюгированные антитела CD16-FITC, CD56-PE, CD3-FITC, CD4-PE, CD8RITC. (B) Цитотоксическая активность Tag7-активированных лимфоцитов на 4 и 6 сутки, очищенные методом магнитной сепарации, против К562 клеток
Цитотоксическая функция NK – клеток, прежде всего, связана с активирующими рецепторами, которые способны распознавать специфические ли-ганды на поверхности вирус-инфицированных или трансформированных клетках. Наиболее изученный активирующий рецептор – NKG2D, который распознает неклассический мотив МНС – MicA.
Используя метод проточной цитометрии, мы установили, что количество NK клеток достигает максимума уже через 3 дня после добавления Tag7 (Рис.7).
Соотношение измеряли методом проточной цитометрии используя конъюгированные антитела CD16-FITC, CD56-PE При инкубации Tag7 с РВМС на 4 сутки появляется цитотоксически активная субпопуляция NK- клеток, которая способна убивать К562 клетки классическим способом за счет секреции перфоринов и гранзимов (Рис.8). Далее мы предположили, что для активации цитотоксической функции NK необходимо участие моноцитов, так как последние являются акцептором для взаимодействия с Tag7. С помощью магнитной сепарации выделяли пул моноцитов из общей фракции и активировали оставшиеся лимфоциты Tag7 в течение 4 дней. Как видно из представленных результатов на Рис.8, цитоток сическая активность не развивалась.
Так как для активации NK - клеток не требуется презентации антигена, мы предположили, что ключевая роль в развитии цитотоксичности принадлежит цитокинам. Известно, что для созревания NK – клеток требуется определенный спектр цитокинов, в частности IL2 и IL12. Мы показали, что моноциты стимулируют выработку цитокинов, а также рост секреции цитокина IL2 в течение 3-х дней после добавления Tag7 (Рис.3В).
Основным источником IL2 являются CD4+ лимфоциты, которые выделяют его как фактор созревания цитотоксических Т-клеток, а также для ауто-регуляции собственных функций. Чтобы определить участие CD4+ лимфоцитов в созревании NK и реализации цитотоксической функции, с помощью магнитной сепарации удалили популяцию CD4+ лимфоцитов и активировали оставшиеся лимфоциты Tag7. Как видно из результатов, показанных на Рис.8, не наблюдалось никакой цитотоксической активности. Чтобы выяснить роль IL2 в развитии цитотоксичности NK, полученные методом магнитной сепарации NK инкубировали в течение 3-х дней с рекомбинантным IL2 и оценивали способность индуцировать гибель клеток-мишеней (Рис.9). После 3 дней инкубации с IL2 наблюдается цитотоксическая активность NK.
Таким образом, мы можем определить ключевые моменты активации цитотоксической функции NK-клеток. При добавлении Tag7 к РВМС происходит активация моноцитов и CD4+ лимфоцитов, которые начинают секре-тировать цитокины, в частности IL2. Уровень IL2 растет уже ко вторым суткам и сохраняет тенденцию к росту в течение 6 суток. В то же время, процентное соотношение NK в РВМС также увеличивается в течение 4 дней. Наличие цитокинов в среде, по-видимому, стимулирует созревание цитоток-сических NK. Tag7-активированные лимфоциты на 4 сутки способны индуцировать клеточную смерть в опухолевых клетках. Следует отметить, что ключевым цитокином, участвующим в реализации цитотоксической функции NK является IL2. Нам также важно было понять, как передается сигнал активации от Tag7 к эффекторным T-лимфоцитам. Как было нами показано ранее, удаление моноцитов не приводит к развитию цитотоксических субпопуляций лимфоцитов на 6 сутки. Приведенные выше результаты демонстрируют, что удаление моноцитов из фракции РВМС не приводит к активации NK белком Tag7. Было выдвинуто предположение, что цитокины, секретируемые CD4-лимфоцитами (в частности IL2), являются ключевыми факторами, необходимыми для активации цитотоксических Т-лимфоцитов. Мы показали, что удаление CD4-лимфоцитов из фракции РВМС, и последующая активации РВМС CD4(-) фракции белком Tag7 не приводит к формированию цитотоксических субпопуляций Т-клеток на 6 сутки (Рис.10А). По-видимому, сигнал активации поступает от интерлейкинов, секретируемых CD4-лимфоцитами. В доказательство нашего предположения, выделенные методом магнитной сепарации CD4 и CD8 лимфоциты инкубировали в течение 6 суток с рекомбинант-ным IL2, для CD8-лимфоцитов дополнительно использовали IL15 в концентрации 10-9М. Как видно из результатов, представленных на Рис. 10А, лимфоциты, активированные цитокинами способны запускать программируемую клеточную смерть в опухолевой клеточной линии К562. В качестве контроля Tag7 инкубировали с очищенными CD4+ и CD8+ лимфоцитами и не наблюдали цитотоксической активности (Рис. 10А). Полученные данные свидетельствуют о том, что при достаточном количестве IL2 и IL15 в среде (10-9М) может происходить неспецифическая активация цитотоксической функции Т-лимфоцитов. Следует отметить, что для активации CD4-лимфоцитов может быть достаточно только IL2. Активированные IL2 CD8-лимфоциты демонстрируют цитотоксическую активность на уровне 12 %. Увеличение ци-тотоксической активности CD8-лимфоцитов наблюдается при инкубации с комплексом цитокинов: IL2 и IL15. По-видимому, для формирования цито-токсической активности CD8-лимфоцитов достаточно IL2, но действие IL15 повышает эффективность функционирования
Определение минимальных структурных фрагментов белка врожденного иммунитета Tag7, необходимых для связывания и активации TREM1
Мы показали, что взаимодействие Tag7 с рецептором врожденного иммунитета TREM1 приводит к формированию ветви иммунного ответа, эффективного против трансформированных клеток. Мы определи ключевые этапы развития цитотоксических лимфоцитов. Далее фундаментальной задачей нашего исследования было подробно изучить, какие участки Tag7 отвечают за связывание и активацию TREM1-рецептора. Мы подвергли Tag7 частичному ферментативному расщеплению под действием трипсина. Полученные фрагменты разделяли с помощью HPLC на колонке Superdex Peptide и отбирали пептиды с молекулярными массами от 0,5 до 5 кДа. В результате были выбраны 24 фракции фрагментов белка, которые тестировали на способность индуцировать сигнал активации в РВМС. Как видно из результатов, представленных в Таблице 2, 15 фракция демонстрировала наибольшую ци-тотоксическую активность.
Последовательность пептида была определена с помощью анализа MALDI TOF и состояла из 24 аминокислот RYVVVSHT AGSSCNTPASCQQQAR, которые соответствуют положению на N-конце белка Tag7. Таким образом, достаточно только 24 аминокислот для передачи активационного сигнала и формирования цитотоксических субпопуляций лимфоцитов. Далее мы использовали синтетический пептид, который соответствует RYVVVSHTAGSSCNTPASCQQQAR последовательности, названный при синтезе как 0-1 активирующий пептид. Используя рекомбинантный TREM1, иммобилизованный на CNBr-сефарозе, мы показали связывание активирующего пептида 0-1 с рецептором. (Рис.25).
На следующем этапе мы определили минимальную и оптимальную концентрации пептида, при которых возможна передача активационного сигнала. На (Рис.26) показано, что цитотоксическая активность РВМС при инкубации с 0-1 пептидом при концентрации больше 10-10 М не изменяется и достигает значения 24±3%, в отличие от Tag7, которого необходимо в 10 раз больше (Рис.2А).
РВМС инкубировали с разными концентрациями 0-1 активирующего пептида в течение 6 суток. Цитотоксическую активность измеряли против К562 клеток после 3-х часов инкубации. Далее мы проводили поиск ингибиторов, препятствующих взаимодействию с TREM1. Используя полученные фракции пептидов, мы проверяли их на возможность блокировать связывание различных активаторов с TREM1 – рецептором. Для этого мы предынкубировали каждую фракцию пептидов с РВМС в течение 1 часа, после чего добавляли Tag7. В результате был выбран пептид, который ингибировал передачу сигнала от Tag7 на TREM1 (Таблица 3).
Фракция 21 содержала пептид, последовательность которого была определена на MALDI TOF: RNVQHYHMKT, и также соответствовал положению в N-концевой последовательности белка Tag7. При синтезе пептид был обозначен как 17.0. Мы продемонстрировали способность пептида 17.0 связываться с TREM1- рецептором (Рис.27). Рисунок 27. Связывание биотинилированного пептида 17.0 с TREM-1. 1 – Элюция с колонки с иммобилизованным TREM1, 2 – контроль биотинилированной фракции.
Было показано, что 17.0 пептид способен блокировать связывание рецептора TREM1 не только с Tag7, но и с активирующим пептидом 0-1 (Рис. 28А). Мы определили, что для блокирования связывания Tag7REM1, инги-бирующая концентрация пептида 17.0 составляет IC50=0,1nM, в то время как для 0-1 пептида IC50=1nM (Рис.28В).
Цитотоксическая активность РВМС, активированных пептидом 0-1 (0,1 nM), Tag7 (1nM) в присутствии ингибиторного пептида 17.0. Лимфоциты инкубировали в течение 6 суток с 0-1 пептидом, в концентрации 10-10 М или Tag7 (10-9M) . Ингибиторный пептид добавляли за 1 час до активатора. Цитоток-сическую активность измеряли после 3 ч инкубации с К562 клетками.
Анализируя полученные данные, а также последовательное положение пептидов на 3D-структуре белка Tag7 можно сделать вывод, что фрагмент Tag7, которому соответствует пептид 17.0, отвечает за связывание и закрепление белка на рецепторе TREM1. Аминокислотная последовательность 17.0 пептида принимает конфигурацию -спирали и располагается рядом с фрагментом, который соответствует пептиду 0-1. Участок 0-1 пептида, который располагается рядом с последовательностью пептида 17.0 и соответствует альфа-спирали, возможно, отвечает за связывание с TREM1-рецептором, в то время как аминокислотная последовательность -листа необходима для активации рецептора (Рис.29). Рисунок 29. Локализация пептидов 0-1(красный), 17.0(фиолетовый) на 3D-структуре белка Tag7. PDB-1YCK.
Таким образом, фрагменты Tag7 могут быть потенциально использованы в качестве ингибитора для связывания с TREM1(17.0) или как новый ли-ганд (0-1), инициирующий передачу сигнала и формирование иммунного ответа.