Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 8
1. Морфология основных структурных элементов рибосомы 11
2. Структурные домены 50S субчастицы рибосомы 17
3. Структурные домены 30S рибосомной субчастицы 20
4. Элонгационный цикл и различные конформационные состояния рибосомы 4.1. Межсубъединичные мостики 27
4.2. Функциональные центры рибосомы
4.2.1. Центр декодирования 31
4.2.2. Пептидилтрансферазный центр 36
4.2.3. Центр, ассоциированный с ГТФ-азной активностью факторов элонгации 38
4.3. Транслокация 48
4.3.1. Интермедиатные состояния рибосомы и взаимодействие EF-G с рибосомой 51
4.3.2. Вклад гидролиза ГТФ на факторах элонгации в формирование транслокацинных интермедиатов рибосомы 63
4.3.3. Подвижность структурных элементов рибосомы при EF-G-зависимой транслокации 66
4.3.4. Обратная транслокация 71
4.4. Подвижность L1-выступа и его роль в функционировании рибосомы 73
4.4.1. Роль L1-выступа в транслокации 75
4.4.2. Характеристика рибосомного белка L1 и его взаимодействий с РНК 79
4.4.3. Взаимодействие L1-выступа с фактором элонгации Р 84
Заключение 85
ГЛАВА II. Результаты и их обсуждение 87
1. Взаимодействие рибосомного белка S8 с рРНК 88
1.1. Кристаллическая структура изолированного рибосомного белка S8 88
1.2. Выбор минимального участка специфического связывания S8 на 16S рРНК 90
1.3. Кристаллическая структура комплекса рибосомного белка S8 со специфическим фрагментом 16S рРНК 93
1.4. Анализ РНК-белковых взаимодействий в S8-16S рРНК комплексах 98
1.5. Анализ РНК-белковых взаимодействий в S8-мРНК комплексе 103
2. Взаимодействия рибосомного белка L1 с РНК 104
2.1. Конформации белка L1 104
2.2. Кристаллическая структура L1-выступа 110
2.2.1. Комплекс архейного рибосомного белка L1 из Sulfolobus acidocaldarius со специфическим фрагментом 23S рРНК T.thermophilus длиной 55
нуклеотидов 110 2.2.2. Комплекс TthL1 со специфическим фрагментом 23S рРНК T.thermophilus длиной 80 нуклеотидов 114
2.3. Кристаллические структуры комплекса рибосомного белка L1 со
специфическими фрагментами мРНК разной длины 119
2.3.1. Структура регуляторного комплекса белка L1 из M. jannaschii 123
2.3.2. Структура комплекса TthL1-мРНК и сравнительный структурный анализ с комплексом TthL1-рРНК 126
2.4. Структурно-кинетический анализ взаимодействий рибосомного белка L1 и его мутантных форм c мРНК и рРНК 131
2.4.1. Особенности взаимодействия р-белка L1 со специфическими фрагментами мРНК и рРНК 131
2.4.2. Роль домена I рибосомного белка L1 во взаимодействии белка c РНК 133
2.4.3. Исследование роли консервативных водородных связей во взаимодействии рибосомного белка L1 c РНК 137
2.4.3.1. Замены Thr217 в белке TthL1 на аланин и валин 138
2.4.3.2. Замена Met218 в белке TthL1 на лейцин 142
2.4.3.3. Замена Gly219 в белке TthL1 на валин 143
2.4.3.4. Кинетический анализ взаимодействий мутантных форм рибосомного белка L1 со специфическим фрагментом 23S рРНК 145
2.4.4. Роль N-концевой спирали белка TthL1 в РНК-белковых взаимодействиях 150
2.4.5. Влияние электростатических взаимодействий на формирование и стабильность комплексов рибосомного белка L1 c РНК 154
2.5. Исследование свойств домена I рибосомного белка L1: встраивание в рибосому и регуляция экспрессии L1-оперона 158
2.5.1. Регуляторные свойства домена I рибосомного белка L1 в системе транскрипции-трансляции in vitro 159
2.5.2. Домен I рибосомного белка L1 способен встраиваться в рибосому in vivo 160
Заключение 163
Выводы 164
ГЛАВА III. Экспериментальная часть 166
1. Материалы 166
1.1. Химические реактивы, ферменты и другие лабораторные материалы 166
1.2. Буферы и другие растворы 167
1.3. Бактериальные штаммы, векторы и рекомбинантные плазмиды 169
2. Методы 170
2.1. Методы генной инженерии, молекулярной биологии и микробиологии 170
2.1.1. Получение плазмид, несущих гены рибосомных белков и их мутантных форм 170
2.1.2. Получение плазмид, несущих гены специфических фрагментов РНК 176
2.1.3. Экспрессия генов рекомбинантных белков S8, L1 и мутантных форм L1 в клетках Е. coli 179
2.1.4. Конструирование плазмид и штаммов для экспериментов в системе in vivo 180
2.1.5. Анализ ингибирования синтеза белка MvaL1 в сопряженной системе транскрипции-трансляции in vitro 181
2.2. Методы аналитической и препаративной биохимии 182
2.2.1. Выделение и очистка рекомбинантных белков и мутантных форм белка L1 из штаммов-продуцентов 182
2.2.2. Получение специфических фрагментов рРНК 183
2.2.3. Электрофоретический анализ нуклеиновых кислот, белков и РНК-белковых комплексов в ПААГ или агарозе 185
2.2.4. Анализ встраивания in vivo белка L1 и его домена I в рибосомы L1 штамма E. coli 187
2.2.5. Эксперименты по связыванию белка S8 cо специфическими фрагментами рРНК на нитроцеллюлозных фильтрах 188
2.2.6. Анализ РНК-белковых взаимодействий методом поверхностного плазмонного резонанса 189
2.3. Кристаллизация рибосомных белков S8 и L1, мутантных форм белка L1 и РНК-белковых комплексов 191
Список сокращений 200
Список литературы 201
- Элонгационный цикл и различные конформационные состояния рибосомы 4.1. Межсубъединичные мостики
- Выбор минимального участка специфического связывания S8 на 16S рРНК
- Роль домена I рибосомного белка L1 во взаимодействии белка c РНК
- Анализ ингибирования синтеза белка MvaL1 в сопряженной системе транскрипции-трансляции in vitro
Введение к работе
Актуальность проблемы. Биосинтез белка, проходящий на рибосомах,
является основным процессом жизнедеятельности живой клетки. Определение
принципов структурной организации рибосомы и молекулярных механизмов
трансляции является одной из актуальных проблем молекулярной биологии.
Для детального понимания механизма биосинтеза белка необходимо детальное
знание структуры компонентов рибосомы и взаимодействий между ними.
Структурные исследования рибосомы и её комплексов с лигандами являются
необходимым этапом в исследовании функционирования рибосомы.
Определение в начале текущего тысячелетия кристаллических структур бактериальной и архейной рибосом и их субчастиц стало важной вехой в исследовании механизма биосинтеза белка. При определении структуры рибосомы были использованы полученные ранее данные по специфическому взаимодействию рибосомных белков с фрагментами рибосомных РНК и структуры изолированных рибосомных белков и их комплексов со специфическими фрагментами рРНК. Большой вклад в определение структур рибосомных белков и их комплексов с РНК был внесён работами, проводившимися в Институте белка РАН. Вписывание известных структур рибосомных белков и их комплексов с РНК в модель рибосомы позволило получить достоверную картину расположения рибосомных белков (р-белков) на субчастицах, а также детально описать их взаимодействие с рРНК.
Известно, что некоторые рибосомные белки являются регуляторами своего синтеза и синтеза белков, находящихся с генами этих белков в одном опероне. К таким белкам относятся и белки S8 и L1, исследования которых описаны в представляемой диссертации. В данной работе впервые был проведён детальный анализ РНК-белковых взаимодействий в рибосомном и регуляторном комплексах р-белка L1 и определены структурные элементы, ответственные за регуляторные свойства белка и РНК.
Определённые нами структуры комплексов белков S8 и L1 с рРНК
использовались для интерпретации электронных карт рибосомы, а
сравнительный структурный анализ регуляторных и рибосомных комплексов белка L1 позволил определить структурные основы регуляции экспрессии гена белка L1 в бактериях и археях. В данной диссертационной работе разработан новый подход к исследованию РНК-белковых взаимодействий рибосомных белков, заключающийся в совмещении анализа структур с кинетическим анализом взаимодействий методом поверхностного резонанса плазмонов.
Цель диссертационного исследования – определение структур и
исследование РНК-белковых взаимодействий в комплексах рибосомных белков с РНК с использованием комбинированного структурно-кинетического метода.
Для выполнения данной работы были поставлены следующие задачи:
– определение структур рибосомных белков L1 и S8 в свободном
состоянии и в комплексе со специфическими фрагментами РНК;
– проведение сравнительного структурно-кинетического анализа
комплексов р-белка L1 и его мутантных форм со специфическими
фрагментами рРНК и мРНК; – исследование роли доменов рибосомного белка L1 в выполнении им
регуляторных свойств и в функционировании рибосомы.
Научная новизна и практическая значимость работы. Объектами исследо
ваний в данной работе являются бактериальные и архейные р-белки S8 и L1, их
структуры с высоким разрешением были определены в комплексе со
специфическими фрагментами РНК, что позволило детально исследовать РНК-
белковые взаимодействия. Структура комплекса р-белка S8 со специфическим
фрагментом рРНК, определённая с разрешением 2,6, была использована для
уточнения структуры 30S рибосомной субчастицы, определённой с
разрешением 3 в группе В. Рамакришнана (Кембридж, Англия). L1-выступ,
вследствие своей подвижности, долгое время не был виден на моделях
рибосомы. Модель структуры изолированного архейного р-белка L1,
определённая в рамках данной работы, была использована в группе Т.Стейца
(Йель, США) для позиционирования в карту электронной плотности большой
рибосомной субчастицы галобактериальной археи. Структура
реконструированного комплекса L1-рРНК, определённая нами с разрешением 2,65, была вписана в модель структуры большой рибосомной субчастицы, что позволило заполнить пробел в структуре рибосомы. К настоящему времени, двухдоменный белок L1 — единственный рибосомный белок-регулятор для которого представлен детальный сравнительный структурно-кинетический анализ рибосомного и регуляторного комплексов. В наших исследованиях, проведённых в системах in vitro и in vivo, показана ведущая роль домена I белка L1 во взаимодействиях белка как с рРНК, так и с мРНК. Полученные результаты вносят существенный вклад в понимание особенностей структурной организации рибосомы, а также структурных основ регуляции экспрессии генов рибосомных белков и могут быть квалифицированы как научное достижение.
Поскольку рибосома является мишенью для многих антибиотиков и токсинов, исследования её структуры имеет не только фундаментальное, но и прикладное значение.
Публикации и апробация работы. Материалы диссертационной работы опубликованы в 26 статьях в российских (6 статей) и международных (20 статей) рецензируемых журналах, представлены на международных и российских конференциях (25 тезисов): First international workshop on “Structure research of the ribosome and its functional complexes” (Гестхахт, Германия, 1998), International conference “The ribosome. Structure, function, antibiotics and cellular interactions” (Хельсинор, Дания, 1999), RNA Annual Meeting (Берлин, Германия, 2008), 13th International Conference on the Crystallization of Biological Macromolecules (Дублин, Ирландия, 2010), 36th FEBS Congress (Турин, Италия, 2011), III Национальной конференции по применению рентгеновского, синхротронного излучений, нейтронов и электронов для исследования материалов (Москва, Россия, 2001), Международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова (Москва, Россия, 2009), Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, Россия, 2004-2009), Зимней молодёжной научной школе (Пущино, Россия, 2004-2010), International conference on “Protein biosynthesis, structure and function” (Пущино, Россия, 2007), IV Российский симпозиум «Белки и пептиды» (Казань, Россия, 2009), V Российский симпозиум «Белки и пептиды» (Петрозаводск, Россия, 2011).
Личный вклад автора. Результаты работы получены лично автором, под его руководством или при его непосредственном участии в планировании и проведении экспериментов. Структуры рибосомных белков и их комплексов с РНК были определены и проанализированы совместно с группой структурных исследований рибосомных белков Института белка РАН.
Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 228 страницах, состоит из введения, обзора литературы (1-я глава), результатов исследования и их обсуждения (2-я глава), описания материалов и методов (3-я глава), заключения, выводов и списка цитируемой литературы (322 ссылки). Работа иллюстрирована 103 рисунками и 24 таблицами.
Основные результаты исследования, выносимые на защиту.
Высококонсервативные рибосомные белки S8 и L1, пространственная структура и свойства которых исследованы в данной работе, являются первично-связывающимися р-белкам, так как они связываются с рибосомными РНК специфично и независимо от связывания других белков. В E.coli эти р-белки являются также белками-регуляторами своего собственного синтеза и синтеза белков, гены которых расположены в том же опероне. Определение структур этих белков, как в изолированном, так и в связанном с рРНК состоянии, приведенное в данной работе, способствовало уточнению структуры рибосомы и детальному исследованию РНК-белковых взаимодействий.
Основное внимание уделено РНК-белковым комплексам, формируемым белком L1. Сравнительный структурно-кинетический анализ комплексов L1-рРНК и L1-мРНК позволил определить структурные элементы бактериального р-белка L1, обеспечивающие регуляторные свойства белка, и влияние консервативных и неконсервативных взаимодействий на формирование и стабильность комплексов. Детально исследована роль межмолекулярных взаимодействий в комплексах, образованных мутантными формами р-белка L1 и РНК. В частности, показано, что РНК-связывающая поверхность белка, измененная мутацией, при образовании комплекса с РНК может принимать форму, соответствующую белку дикого типа с сохранением Ван-дер-Ваальсовых контактов и водородных связей между белком и РНК. В то же время мутации достаточно сильно уменьшают сродство белка к рРНК, что не позволяет использовать количество межмолекулярных контактов как единственную величину, характеризующую взаимодействие молекул белка L1 и РНК. Впервые показано, что домен I бактериального р-белка L1 способен in vitro выполнять регуляторную функцию целого белка и встраиваться в рибосомы in vivo.
Элонгационный цикл и различные конформационные состояния рибосомы 4.1. Межсубъединичные мостики
Получение обширной информации с использованием сшивок (бис-(2 хлороэтил)метиламин, 2-иминотиалан, метил-p-азидофенилацетимидат и др.) позволило локализовать многие р-белки на 16S рРНК и 23S рРНК. Так, в лаборатории Бримакомба было локализовано большинство РНК-связывающих белков 50S cубчастицы [23,24]. В лаборатории Виттманн-Лейболд исследовались рРНК-белковые взаимодействия, как в малой, так и большой рибосомных субчастицах с использованием сшивок ультрафиолетом (УФ-сшивок) и 2 иминотиаланом. Наиболее известны работы лаборатории Ноллера по исследованию методами химического пробинга с использованием модифицирующих агентов (диметилсульфоксид и кетоксаль, Fe(II)EDTA) мест взаимодействия р-белков c 16S рРНК и конформационных состояний специфических фрагментов рРНК. Были определены участки связывания белков S4 [25], S20 [26] и S17 [27]. В лаборатории Эресманна с помощью УФ-сшивок исследовалось взаимодействие с 16S рРНК белков S4 и S20 [28], а гидроксил-радикальным пробингом – белка S8 [29]. Метод сшивок использовался и при исследовании взаимодействия рибосомных белков 50S субчастицы с транспортными РНК в А- или Р-участках [30]. В лаборатории Богданова с помощью химических сшивок было определено белковое окружение мРНК на рибосоме [31]. Для исследования расположения белков на рибосомной РНК применялся метод нейтронного рассеяния [32,33].
Тем не менее, наиболее достоверную информацию о структуре биологических объектов (в частности, рибосом) можно получить лишь при определении их пространственной структуры методами криоэлектронной микроскопии (криоЭМ) и рентгеноструктурного анализа (РСА). КриоЭМ - электронная микроскопия c использованием трехмерной реконструкции изображений замороженных объектов.
В 1995 году методом электронной микроскопии были получены модели структуры рибосомы из E. coli с разрешением около 25 [34,35]. В данных моделях рибосомы видна большая межсубъединичная полость, форма и размер которой позволяла расположить там три молекулы тРНК в А, Р и Е- участках, соответственно. Кроме того, имелось несколько каналов, один из которых начинался в нижней части межсубъединичной полости большой рибосомной субчастицы и выходил на обратной стороне 50S субчастицы. А. Йонат в 1987 г. предположила, что по этому каналу растущий полипептид выходит из рибосомы [36].
В районе головки 30S субчастицы в составе рибосомы была обнаружена бороздка, в которой могла располагаться мРНК в процессе трансляции. Полученная позднее электронно микроскопическая модель 30S рибосомной субчастицы с разрешением 23 [37], подтвердила, что бороздка на 30S частице действительно является местом локализации мРНК, и что три главных структурных домена (головка, платформа и тело) обладают независимой подвижностью. Такая подвижность отдельных доменов 30S субчастицы хорошо соответствовала данным по структурным изменениям рибосомы при трансляции [38–40]. Позже были получены модели рибосомы в двух состояниях: претранслокационном и посттранслокационном [35], которые подтвердили, что синтез белка действительно происходит в области межсубъединичного пространства.
Развитие кристаллографических методов позволило добиться определения моделей структур при высоком атомарном разрешении. Рибосомы долгое время считались некристаллизуемым объектом, поскольку обладают большим размером, ассиметрической природой, внутренней подвижностью и функциональной гетерогенностью. Первыми в начале 80-х годов были получены кристаллы большой рибосомной субъединицы из термофильной бактерии Bacillus stearothermophilus (Вst50S) [41,42]. Несколькими годами позже закристаллизована большая рибосомная субъединица из экстремальной галофильной бактерии Halobacterium marismortui (Нma50S) [43,44]. В 1987 получены пригодные для РСА малая рибосомная субчастица [45] и целая рибосома [46] из экстремально термофильной бактерии Thermus thermophilus (Tth30S и Tth70S, соответственно).
В 1998 году в лаборатории Стейца была определена первая модель структуры Нma50S [47] с довольно высоким разрешением 9 , уже год спустя было сделано уточнение структуры до 5 [48]. На картах электронной плотности с разрешением 9 была чётко видна лишь плотность, соответствующая 23S рРНК (рис. 3). В модель были вписаны определённые ранее кристаллические структуры 10 рибосомных белков, сарцин-рициновой петли (SRL) 23S РНК, участка рРНК, связывающегося с белком L11 и фрагмента 5S рРНК. В уточнённой модели структуры Нma50S с разрешением 5 видны отдельные фрагменты рРНК и белки. Кроме того, в рамках данной модели, была предложена модель взаимодействия факторов трансляции с рибосомой. Структура Нma50S с наилучшим разрешением на сегодняшний день – 2,4 была определена пятнадцать лет тому назад [49], боковые выступы в этой модели полностью отсутствовали (рис. 3, 4а). Причиной трудностей детальной визуализации боковых выступов явилась их высокая подвижность. Рис. 3. Модели структуры Нma50S, определённые с разным разрешением: 9 (а), 5 (б) и 2,4 (в). Рисунок взят из [50].
Структура Tth30S была определена в том же году с разрешением 3,0 в лаборатории Рамакришнана [51]. В лаборатории Йонат была определена структура 50S субчастицы из мезофильного организма Deinococcus radiodurans (Dra50S) с разрешением 3,1 [52].
В группе Ноллера в 2001 году была определена структура Tth70S рибосомы в комплексе с мРНК и тремя тРНК с разрешением 5,5 [53]. Анализируя полученные в начале 2000-х годов модели рибосомы и рибосомных субчастиц можно было заключить следующее. Во-первых, рибосомные белки располагаются преимущественно на обращенной к растворителю поверхности рибосомы, а между субчастицами белки практически отсутствуют. Во-вторых, большинство рибосомных белков имеют глобулярную конформацию, однако некоторые содержат вытянутые нерегулярные участки, которые могут приобретать упорядоченную третичную структуру при связывании с рРНК. В-третьих, спирали рРНК соединены петлями, которые часто представляют собой нерегулярные участки А-спиралей РНК, и взаимодействуют между собой малыми желобками. Очень часто такие взаимодействия стабилизированы внедрением консервативного аденина в малый желобок спирали рРНК.
Для дальнейших исследований функционирующей рибосомы необходимо было обладать структурными данными о взаимодействии рибосомы с факторами трансляции. В течение длительного времени не удавалось получить кристаллы рибосомы в комплексе с фактором элонгации G (EF-G), однако в группе Рамакришнана удалось найти оригинальный подход, который позволил появиться целому ряду статей, посвящённых структурному анализу взаимодействия EF-G с рибосомой в различных транслокационных состояниях. В кристаллической структуре рибосом и 50S субчастиц имеется выступающий из субчастицы рибосомный белок L9, взаимодействующий с близлежащей 30S субчастицей в кристаллической ячейке (рис. 4), что стерически затрудняет связывание факторов трансляции. В группе Рамакришнана для кристаллизации рибосом был использован штамм, в геноме которого удалена часть гена, кодирующая С-концевую часть белка L9, которая выступает из субчастицы. Полученный штамм позволил закристаллизовать рибосомы, связанные как с ЕF-G [54], так и с фактором элонгации Tu (EFu) [55].
Во всех случаях белок L9 отсутствовал в структуре рибосомы целиком, видимо, вследствие того, что N-концевой фрагмент белка был слишком нестабилен и деградировал в растворе. Получение такой кристаллической формы позволило совершить прорыв в структурных исследованиях взаимодействий рибосом с ГТФазами – факторами трансляции. В моделях структур таких мутантных рибосом, связанных с EF-G и фусидовой кислотой, а также с мРНК и тРНК в Р-участке впервые удалось с разрешением 3,6 детализировать L1-выступ и увидеть часть L12-выступа [54]. Эти выступы ранее были не видны в составе рибосомы и изолированной 50S субчастицы. В опубликованных позднее работах удалось получить кристаллические структуры элонгаторных комплексов с более высоким разрешением [57,58].
Выбор минимального участка специфического связывания S8 на 16S рРНК
Для узнавания и связывания «правильной» тРНК в А-участке важны универсально консервативные нуклеотиды G530, A1492, A1493 16S рРНК [107] (рис. 11). Формирование Уотсон-Криковской пары во втором положении антикодона стабилизируется изменением конформации (от syn к anti) основания нуклеотида G530. Напомним, что syn и anti конформации определяются торсионным углом между основанием и кольцом рибозы. Изменение конформации G530 позволяет осуществлять его взаимодействие с А1492, который, в свою очередь, контактирует со второй парой нуклеотидов кодон-антикодоновой спирали. Считается, что контакты, которые формируются между нуклеотидами A1492, A1493, G530 и парами нуклеотидов кодон-антикодоновой спирали возможны только при формировании Уотсон-Криковских пар и невозможны при wobble-спаривании.
В группе Юсупова был предложен несколько иной механизм декодирования, основанный на шести кристаллических структурах Tth70S, определённых с разрешением 3,1-3,4 и моделировании состояний декодирующего центра на стадии коррекции тРНК [93]. Рибосома содержала 30-нуклеотидную мРНК с AUG кодоном и инициаторную тРНКfmet в Р-участке, в А участке находилась тРНКTyr. В эксперименте тРНКTyr была связана с родственным кодоном, однако дополнительно было проведено моделирование структуры рибосомы с неродственным кодоном мРНК. Матричная РНК формирует петлю между кодонами в Р и А-участках, которая стабилизирована как антикодоном тРНК в Р-участке, так и участком 16S рРНК. Результаты молекулярно динамических расчётов свидетельствовали о том, что 30S cубчастица подвергается одинаковым конформационным изменениям как при связывании «правильной» тРНК, так и при связывании «чужой» тРНК. Структурные изменения малой субчастицы фиксируют декодирующий центр, удерживая мРНК в таком положении, при котором первые два нуклеотида кодона формируют Уотсон-Криковские пары с антикодоновой петлёй тРНК. Когда в первой или второй кодон-антикодон позициях формируются неправильные пары U-G и G-U (wobble-спаривание), структурные изменения декодирующего центра способствует адаптации конформации этих пар к геометрии канонических G-C пар. Такое искажение кодон-антикодоновой мини-спирали и антикодоновой петли является причиной того, что «чужая» тРНК диссоциирует с рибосомы. Таким образом, движение структурных элементов 30S субчастицы может и не зависеть от природы тРНК в А-участке.
Позднее в группе Юсупова структурный взгляд на природу декодирования, предлагающий объяснение ошибочного включения аминокислот при трансляции, был развит на основе 11 моделей кристаллических структур рибосом [108]. Подтверждено, что при связывании аа-тРНК, не соответствующей кодону, происходит образование таутомерных форм оснований, допускающих геометрию, изостерическую Уотсон-Криковской. Так же как в процессе транслокации тРНК, при декодировании наблюдается движение домена «плеча» малой субчастицы. При незанятом DC «плечо» 30S cубчастицы «закрыто», при связывании близкородственной тРНК происходят этапы селекции и аккомодации, сопровождающиеся движением «плеча» примерно на 2 по направлению от «головки» и переходом его в «открытое» состояние. При связывании в А-участке родственного кодона тРНК формируется дополнительный межсубъединичный мостик между белком L31 и белками S13 и S19, который отсутствует при взаимодействии с неродственной тРНК, что может приводить к диссоциации такой тРНК с рибосомы.
Согласно «аллостерической трёх-сайтовой модели», предложенной в группе Ниерхауза, считалось, что присутствие или отсутствие деацилированной тРНК в Е-участке влияет на энергию активации, которая требуется для связывания тройственного комплекса в А-участке рибосомы [109]. Позднее кинетические данные c использованием пуромициновой реакции, полученные в той же группе, показывали, что тРНК в Е-участке освобождается после стадии декодирования, но перед гидролизом ГТФ на EFu и аккомодацией тРНК в А-участке [110]. Вероятно, аллостерическая связь между Е- и А-участками влияет на декодирующий центр 30S субчастицы, но не на скорость формирования пептидной связи. Пептидная связь формируется при наличии пустого Е-участка (POST-состояние), причём, аллостерическое взаимодействие А и Е-участков характерно для целой рибосомы, а не для изолированной 50S субчастицы.
В пептидилтрансферазном центре рибосомы осуществляется пептидил-трансферазная реакция (транспептидации) – перенос С-конца пептида на аа-тРНК. Это реакция нуклеофильного замещения, в которой атакующей группой является аминогруппа аминокислоты, находящейся в А-участке. Скорость переноса пептида во много раз превышает скорость связывания аа-тРНК с А-участком. Моделью пептидилтрансферазной реакции является пуромициновая реакция, основанная на том, что антибиотик пуромицин представляет собой низкомолекулярный аналог аминоацил-тРНК и может вступать в реакцию.
Структурные данные свидетельствуют о том, что конформационные изменения тРНК в большой субчастице в изолированном состоянии и в составе рибосомы практически не отличаются [111]. Рибосома (также как и 50S субчастица) увеличивает скорость транспептидации в 105 раз [112]. Для пептидилтрансферазной реакции необходимо сведение ССА-концов аминоацил и пептидил-тРНК, что происходит в том случае, когда рибосома находится в классическом (закрытом) состоянии. Анализ кристаллической структуры Hma50S в комплексе с аналогами тРНК показал, что PTC образован доменом V 23S рРНК [113]. Причём, практически все контакты тРНК с нуклеотидами 23S рРНК, определённые методом РСА, были ранее обнаружены в группе Ноллера с помощью различных химических модификаций [114]. При связывании аминоацил-тРНК с А-участком на рибосоме индуцируются конформационные изменения как в PTC, так и в пептидил-тРНК [115], что способствует взаимодействию EF-G с рибосомой после окончания пептидилтрансферазной реакции.
В непосредственной близости от РТС находятся два белка - L27 и L16. В бактериях, в отличие от архей, с молекулами тРНК контактирует N- концевая часть белка L27 [56,111], достигая А76 молекулы пептидил-тРНК в Р-участке (рис. 13). При связывании аа-тРНК с А-участком этот участок белка может опосредованно менять свою конформацию. Известно, что делеция целого L27 или его N-концевой части приводит к уменьшению петидилтрансферазной активности [116]. На эффективность транслокации влияет также белок L16.
L16 взаимодействует с акцепторной частью тРНК в А-участке и находится вблизи от тРНК в Р-участке. Тем самым, белок позиционирует транспортные РНК в А и Р-участках рибосомы. При делеции гена белка L16 происходит дефектное связывание тРНК в А-участке и уменьшается скорость петидилтрансферазной реакции [117,118]. Таким образом, по крайней мере, в бактериях, белки L27 и L16 играют важную роль в катализе на рибосоме, способствуя правильной ориентации субстратов пептидилтрансферазной реакции. Подвижная петля белка L5 облегчает плавное скольжение тРНК через Р-участок (рис. 12).
Роль домена I рибосомного белка L1 во взаимодействии белка c РНК
Реконструкция методом криоЭМ структуры рибосомы в PRE-состоянии в комплексе с EF-G-GDPNP с пустым А-участком позволила впервые визуализировать P/E конфигурацию тРНК [87,88]. Сравнительный анализ двух криоЭМ реконструкций элонгаторных комплексов в присутствии и отсутствии ЕF-G-GDPNP обнаружил три главных отличия в конформациях рибосомы.
Было наглядно показано, во-первых, передвижение деацилированной тРНК из P/P участка в P/E участок, во-вторых, переход консервативного и высокодинамичного L1-выступа из открытой в закрытую конформацию и его передвижение на расстояние 20 (рис. 34), в-третьих, храповиково-подобное движение 30S субчастицы относительно 50S субчастицы. Движение L1-выступа из открытой в закрытую конформацию было зафиксировано также методом smFRET с использованием донорных и акцепторных флуорофоров, присоеденённых к рибосомным белкам L1 и L9 [182], L1 и L33 [214], L1 и тРНК [73], а также в S6(S11) и L9 [175]. функциональным состояниям E-участка рибосомы. (а) Открытое положение L1-выступа с пустым E-участком; (б) промежуточное положение L1-выступа с тРНК в классическом E/E участке; (в) полностью закрытое положение L1-выступа с тРНК в гибридном P/E состоянии. Деацилированная тРНК показана красным цветом; положение промежуточного E/E состояния показано штриховым зеленым контуром. Рисунок взят из [214]. L1-выступ бактериальной рибосомы является одним из главных объектов диссертационной работы. В заключительной главе литературного обзора будет подробно описана структурная организация и функционирование этого важного участка рибосомы.
В рамках главы, посвящённой транслокации, рассмотрим особенности структурных перемещений на рибосоме в нестандартных условиях блокировки синтеза белка (обратная транслокация).
Иногда на рибосоме транслокация транспортных РНК может быть ошибочной, что приводит к остановке белкового синтеза и блокированию связывания других рибосом с мРНК. Добавление к таким рибосомам in vitro деацилированной тРНК, родственной кодону мРНК в Е-участке, может индуцировать обратную транслокацию рибосомы из POST- в PRE-состояние [177,215]. Однако in vivo такого взаимодействия деацилированной тРНК с рибосомой не наблюдалось.
Был идентифицирован фактор элонгации 4 – EF4 (LepA), который катализирует движение транспортных РНК в условиях, когда рибосома блокирована и проходит обратная транслокация. ЕF4 in vitro взаимодействует с «запертыми» рибосомами в PRE- или POST-состоянии и способствует их возвращению в элонгационный цикл, этот фактор найден практически во всех бактериях, митохондриях и хлоропластах, но отсутствует в археях и цитоплазме эукариот.
Структура EF4 похожа на структуру EF-G, но есть и специфические домены (рис. 35). Оба фактора содержат домен I, однако, в EF4, так же как в EFu, отсутствует G -субдомен, но имеются домены II, III и V, которые ответственны за связывание факторов с рибосомой и ГТФазную активность. Важным отличием EF4 является также отсутствие домена IV и наличие уникального С-концевого домена (CTD). Домен IV EF-G, предположительно, может играть роль в блокировке обратной трансляции мРНК на рибосоме, его домен IV поворачивается по направлению к А-участку рибосомы и функционирует как «стоппер» [54]. EF4, так же как другие факторы, связывается с рибосомой в районе L12-выступа [216]. В результате, транспортные РНК возвращаются назад, в Р и А-участки, тем самым, давая рибосоме шанс для осуществления правильной транслокации.
В модели структуры рибосомы в комплексе с EF4 деацилированная тРНК уже находится в Р/Р участке, а пептидил-тРНК в, так называемом, А/L участке [216], в котором «локтевая» часть тРНК смещена на 14 по направлению к L12-выступу (рис. 36). Специфический СTD EF4 может удерживать пептидил-тРНК в А-участке, перетаскивая её «локтевую» часть в А/L позицию. Когда EF4 уходит с рибосомы, пептидил-тРНК возвращается в А/А участок.
Биохимические данные подтвердили роль СTD EF4 (последних 44 аминокислотных остатков) в функциональной активности фактора [217].
В заключительной части литературного обзора вернёмся к детальному рассмотрению структурно подвижного L1-выступа рибосомы, исследование РНК-белковых взаимодействий в котором является одной из основных задач диссертационной работы.
Предполагается, что рибосома функционирует на основе броуновского движения, причём, сопряжённые спонтанные конформационные изменения переводят тепловую энергию в направленное движение структурных элементов. Транспортные РНК во время их транслокации на рибосоме проходят последовательные интермедиатные состояния, включающие разрывы и формирование контактов с рибосомой. Некоторые рибосомные элементы, такие как спирали 38, 69 23S рРНК, центральный протуберанец и L1-выступ во время транслокации могут перемещаться совместно с тРНК на значительные расстояния (от 8 до 40 ). Перемещение тРНК в Е-участок рибосомы и её последующее удаление осуществляется при непосредственном участии L1-выступа. L1-выступ, как часть консервативного Е-участка рибосомы, был обнаружен в бактериях, археях [218], у низших [219] и высших эукариот [220]. Этот боковой выступ принимает активное участие в транслокации, взаимодействуя с тРНК в гибридном Р/Е и классическом Е-участках. Кроме того, предполагается, что белок L1 способствует удалению фактора EF-P с рибосомы [221].
Высокоподвижный L1-выступ образован р-белком L1 и спиралями 76, 77 и 78 23S рРНК [56,83,176,182,186,214]. Конформация этого выступа меняется в зависимости от присутствия тРНК в Е-участке рибосомы.
Отсутствие белка L1 в рибосомах E. coli приводит к снижению в два раза их белоксинтезирующей активности [222]. Кроме того, было показано, что такие рибосомы имеют пониженное сродство тРНК к Р-участку и сниженную EF-G-зависимую ГТФазную активность [223].
L1-выступ может перемещаться на значительное расстояние по направлению к межсубъединичной полости [84], так, он способен вращаться примерно на 30 вокруг своей базовой точки (основание спирали 76). Известно, что в кристаллической структуре Dra50S [52] L1-выступ находится под углом 30 по сравнению с его ориентацией в кристаллической структуре Tth70S [53]. В работах, посвящённых исследованию структуры прокариотической рибосомы и опубликованных до 2009 года, определялась лишь часть L1-выступа (спираль 76), а в качестве целого L1-выступа использовалась модель структуры, определённого нами изолированного комплекса [224]. Кристаллизация бактериальной рибосомы с отсутствующим L9 и в комплексе с EF-G позволила впервые определить структуру рибосомы с упорядоченной областью L1-выступа [54]. Структура 70S рибосомы в комплексе с фактором элонгации Р (EF-P) подтвердила, что L1-выступ способен поворачиваться более чем на 30 относительно H76 без какого-либо разрыва РНК-белкового интерфейса [221].
Анализ ингибирования синтеза белка MvaL1 в сопряженной системе транскрипции-трансляции in vitro
Изначально, кристаллы белка L1 T. thermophilus в комплексе с 55-нуклеотидным фрагментом 23S рРНК T. thermophilus отражали рентгеновские лучи хуже, чем кристаллы гибридного комплекса образованного белком SacL1. Чтобы улучшить качество кристаллов бактериального комплекса, мы варьировали длину фрагмента РНК. Наилучшие кристаллы были получены для комплекса TthL1 с 80-нуклеотидным фрагментом 23S рРНК T. thermophilus, содержащим полноразмерную спираль 78 (рис. 68б). Наличие полноразмерной Н78 обеспечило дополнительные РНК-РНК и РНК-белковые контакты, которые стабилизировали кристаллическую структуру и позволили получить модель более высокого разрешения.
Структура этого комплекса была определена с разрешением – 2 , что дало нам уникальную возможность детального анализа РНК-белковых контактов [240].
Специфические фрагменты 23S рРНК T. thermophilus. а) Минимальный фрагмент (55 н.о.), необходимый для связывания белком L1. б) 80-нуклеотидный фрагмент, содержащий полную спираль H78. Красным цветом показаны нуклеотиды, участвующие в образовании консервативных контактов с рибосомным белком L1.
Рибосомный белок TthL1 в комплексе с рРНК имеет открытую конформацию подобную конформации архейных белков L1, взаимное расположение доменов аналогично взаиморасположению доменов в архейных гомологах (рис. 69б, 70б).
Фрагмент 23S рРНК в составе реконструированного полноразмерного L1-выступа рибосомы включает полные спирали 77 и 78, укороченный вариант спирали 76, петли А и В на концах спирали 77 и петлю С, замыкающую спираль 78.
Короткая часть Н78 состоит из трех канонических пар оснований (G2127-C2161, C2128-G2160, C2129-G2159) и завершается нуклеотидом U2130 (рис. 70д). Длинная часть спирали Н78 начинается с трех неканонических пар, где основания G2133 и А2158 образуют стекинг.
Компоненты комплекса TthL1-рРНК. а) Аминокислотная последователь ность белка L1 T. thermophilus. Аминокислотные остатки, входящие в домен I показаны на розовом фоне, остатки, взаимодействующие с рРНК, помещены в рамку; -спирали отмечены красными цилиндрами, -тяжи показаны синими стрелками. б) Модель структуры белка TthL1. в) Комплекс TthL1-рРНК. Белок показан в малиновом (домен I) и голубом (домен II) цветах, сахаро-фосфатный остов РНК обозначен оранжевым цветом. г) Третичная структура 80 нуклеотидного фрагмента 23S рРНК T. thermophiles. д) Вторичная структура 80 нуклеотидного фрагмента 23S рРНК T. thermophilus. Нуклеотидная последовательность пронумерована в соответствии с нумерацией E. coli 23S рРНК. Нуклеотиды, взаимодействующие с белком, помещены в рамку.
Петля С, замыкающая спираль 78, находится вблизи средней части спиралей 76-77 (рис. 70г). Фосфатные группы U2109 и G2110 проникают в малый желобок спирали 78 и формируют прямые, а также опосредованные (через молекулу воды) водородные связи с основаниями и остатками рибозы в спирали 78.
Наложение модели данной структуры на модель структуры L1-выступа в составе Tth70S рибосомы с разрешением 3,6 [54] показало, что r.m.s. отклонение составляет 1,02 для всех атомов фосфора рРНК, и 0,92 для всех С атомов молекулы белка, что означает, что структура комплекса TthLl-рРНК может быть использована для детального анализа РНК-белковых взаимодействий в L1-выступе рибосомы.
В формировании комплекса TthLl-рРНК принимает участие 1450 2 поверхности белка и 1483 2 поверхности РНК. Взаимодействие так же, как в случае SacLl-рРНК, осуществляется двумя доменами. Со стороны домена I белка TthL1 поверхность контакта сформирована спиралью ос1, которая присутствует лишь в бактериальных р-белках L1, петлей ос2-р1, тяжом p1 и петлями (37-Э8 и (39-р10 (рис. 70а, б). Со стороны рРНК с белком контактирует практически вся спираль 77, нуклеотиды 2169-2173 петли В (взаимодействие с доменом II белка) и нуклеотиды 2127-2132 спирали Н78 (рис. 70д). Площадь контакта домена II TthL1 с рРНК значительно меньше, чем в комплексе SacL1-рРНК.
Спираль 78 23S рРНК взаимодействует с N-концевой частью спирали осі белка, формируя несколько межмолекулярных водородных связей, большая часть которых доступна растворителю. Основная и наиболее консервативная часть поверхности РНК-белкового взаимодействия сформирована Р-листом TthL1 с принадлежащими ему петлями и спиралью 77 23 S рРНК. Данная область контактирующей поверхности комплекса стабилизирована восемью вкладом Thr217.
Исследования рибосом, осуществленные ранее с помощью различных методов показали [56,75,84 недоступными для растворителя межмолекулярными водородными связями. Три из них образованы основаниями нуклеотидов (табл. 6) и, по-видимому, зависят от последовательности нуклеотидов рРНК. Все эти связи присутствуют и в SacL1 117 рРНК комплексе [224]. Пять из восьми консервативных водородных связей образованы строго консервативной триадой Thr217-Met218-Gly219 с преобладающим,88,191,214], что существует, по крайней мере, 3 различных ориентации L1-выступа относительно 50S субчастицы: полностью закрытое, полузакрытое и открытое. Полученная нами структура была использована для моделирования различных конформационных состояний рибосомы. Наложение структуры TthL1-рРНК на структуру рибосомы с L1-выступом, находящимся в закрытом положении, показало, что «локтевой» изгиб тРНК проникает в междоменную полость белка L1 и может взаимодействовать с Pro133 в петле 5-6 домена II и со спиралью 76 рРНК. Эти же контакты найдены и в L1-выступе, находящимся в полузакрытом состоянии, что свидетельствует о роли домена II белка L1 в удалении тРНК из рибосомы. При моделировании открытой конформации L1-выступа с использованием структур свободной рибосомы, TthL1-рРНК и белка L9 было показано, что малый желобок спирали 78 может взаимодействовать c С–концевым доменом L9. Возможно, этот контакт также способствует удалению деацилированной тРНК из рибосомы.
Кристаллические структуры комплекса рибосомного белка L1 со специфическими фрагментами мРНК разной длины
Известно, что рибосомный белок L1 в клетке является не только составной частью L1-выступа, но и регулятором трансляции белков своего оперона по принципу обратной связи. При недостатке рибосомной 23S РНК белок L1 связывается специфически с определенным участком в последовательности своей мРНК и мешает ее трансляции.
Наиболее подробно изучена регуляция L11 оперона E. coli [276] и L1 оперона архей рода Methanococcus [273,277]. В E. coli белок L1 связывается с участком перед первым геном L11 оперона, а в археях M.vannielii и M.jannashii регуляторный участок на мРНК располагается в начале кодирующей последовательности первого гена L1 оперона (рис. 71).