Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1 Энтеровирусы: общая характеристика 13
1.1.1 Строение капсида и организация генома 13
1.1.2 Цикл репликации 14
1.1.3 Транскрипция генома 14
1.1.4 Трансляция генома пикорновирусов 15
1.1.5 Процессинг полипротеина 15
1.1.6 Функции неструктурных вирусных белков 16
1.1.7 Сборка вирусных частиц 17
1.2 Рецепторы энтеровирусов 18
1.2.1 Полиовирусный рецептор (PVR/CD155) 18
1.2.2 Рецептор вирусов Коксаки и аденовирусов (CXADR/CAR) 24
1.3 Механизм действия энтеровирусов 29
1.3.1 Ингибирование транскрипции и трансляции клеток-хозяев 29
1.3.2 Гибель клеток 30
1.3.3 Ответ иммунной системы на энтеровирусную инфекцию 31
1.4 Онколитические вирусы в терапии глиом 35
1.4.1 Онколитические вирусы на основе вакцинных и непатогенных или слабопатогенных для человека штаммов 38
1.4.2 Онколитические вирусы на основе патогенных вирусов животных 42
1.4.3 Онколитические вирусы на основе вирусов, патогенных для человека 45
1.5 Онколитические энтеровирусы 50
Глава 2. Материалы и методы исследования 55
2.1 Реактивы и расходные материалы 55
2.1.1 Реактивы 55
2.1.2 Штаммы Escherichia coli и плазмиды 56
2.1.3 Олиго- и полинуклеотиды 56
2.2 Вирусы и клетки 56
2.2.1 Вирусы 56
2.2.2 Культуры клеток 57
2.3 Оборудование 58
2.4 Методы 58
2.4.1 Конструирования лентивирусного вектора 58
2.4.2 Получение лентивирусных стоков 61
2.4.3 Лентивирусная трансдукция клеток и селекция на пуромицине 61
2.4.4 Конструирование плазмиды для нокаута гена интерферонового рецептора Ifnar1 и введение в клетки С6-PVR-BFP 62
2.4.5 Иммуноцитохимия, проточная иммуноцитометрия и сортировка клеток 62
2.4.6 Наработка и очистка вирусных стоков, определение титра 63
2.4.7 Анализ жизнеспособности клеток после инфицирования вирусами 64
2.4.8 Анализ вирусной репродукции в инфицированных клетках 64
2.4.9 Тест на обработку интерфероном 65
2.4.10 Оценка характеристики роста клеток в режиме реального времени с использованием клеточного анализатора xCELLigence 65
2.4.11 Выделение тотальной РНК и синтез кДНК 65
2.4.12 Определение относительного количества мРНК интерферона и методом ПЦР в режиме реального времени 65
2.4.13 Выделение геномной ДНК 67
2.4.14 Подготовка образцов и секвенирование 67
2.4.15 Моделирование и терапия подкожных ксенографтов 68
2.4.16 Моделирование ортотопической глиобластомы у крыс и магнитно резонансная томография (МРТ) 68
2.4.17 Завершение эксперимента на животных 69
2.4.18 Статистическая обработка 69
Глава 3. Результаты и обсуждение 70
3.1 Получение гуманизированной линии клеток глиомы С6 крысы, экспрессирующих гены PVR или CXADR человека 70
3.2 Исследование чувствительности гуманизированных линий глиомы С6 к непатогенным энтеровирусам человека 75
3.3 Исследование репродукции непатогенных штаммов энтеровирусов человека на гуманизированных линиях глиомы С6 крысы 80
3.4 Изучение зависимости онколитической активности непатогенных штаммов энтеровирусов человека от состояния сигнальных путей интерферонового ответа гуманизированных клеток глиомы С6 84
3.5 Сравнение динамики роста гуманизированных клеток глиомы C6 in vitro и in vivo на крысах при интракраниальной имплантации в мозг крыс 91
3.6 Оценка онколитической активности непатогенных штаммов энтеровирусов человека на модели подкожных ксенографтов гуманизированных клеток глиомы C6 на иммунодефицитных мышах 97
Заключение 101
Выводы 104
Благодарности 105
Список сокращений 106
Список литературы 108
- Полиовирусный рецептор (PVR/CD155)
- Онколитические энтеровирусы
- Получение гуманизированной линии клеток глиомы С6 крысы, экспрессирующих гены PVR или CXADR человека
- Оценка онколитической активности непатогенных штаммов энтеровирусов человека на модели подкожных ксенографтов гуманизированных клеток глиомы C6 на иммунодефицитных мышах
Полиовирусный рецептор (PVR/CD155)
Рецептор полиовируса принадлежит к большому суперсемейству молекул Ig, называемых нектинами и нектиноподобными белками, которые опосредуют клеточную адгезию, миграцию клеток и служат в качестве рецепторов для проникновения вирусов [56]. Рецептор полиовируса человека представляет собой трансмембранный гликопротеин, который содержит три Ig-подобных домена (D1-D2-D3), трансмембранный домен и C-концевой цитоплазматический домен. Эктодомен PVR опосредует присоединение клеток к молекуле внеклеточного матрикса витронектину, а его внутриклеточный домен взаимодействует с легкой цепью динеина 1 типа (Tctex/DYNLT1; англ. dynein light chain Tctexype 1). Ген CD155 человека экспрессируется в четырех сплайс вариантах , , и , два из которых ( и ) не имеют трансмембранного домена и высвобождаются из клетки после их синтеза. PVR- и PVR- изотипы различаются только цитоплазматическим доменом и могут функционировать как рецепторы PV [44,57]. PVR- локализуется только на базолатеральной мембране поляризованных эпителиальных клеток, тогда как PVR- локализуется и на базолатеральной и на апикальной мембранах [58].
Гомологи PVR человека встречаются только у приматов. Ген, кодирующий PVR, экспрессируется во время эмбриогенеза в мезенхимальных тканях и вентральных структурах центральной нервной системы (ЦНС). Транскрипционная регуляция гена CD155 жестко контролируется [48]. При эмбриогенезе экспрессия СD155 контролируется активностью промотера и ограничена вентральной пластинкой нервной трубки, нотохордом и передним стволом спинного мозга, что может являться причиной ограниченного тропизма полиовируса в отношении моторных нейронов переднего рога спинного мозга в постнатального период [59].
CD155 в первую очередь принимает участие в клеточной адгезии и контактном торможении. CD155 колокализован с V-интегрином, рецептором для многочисленных белков внеклеточного матрикса (ECM; англ. extracellular matrix), включая витронектин [60]. Белок витронектин связывает CD155 in vitro, опосредуя тем самым взаимодействие клеток с матриксом [61]. Активация интегринов приводит к сборке комплексов фокальной адгезии, которые стабилизируют клеточное взаимодействие с субстратом через внутриклеточную сигнализацию и перегруппировку актинового цитоскелета [62]. Хотя основными белками, опосредующими адгезию клеток, являются кадгерины и нектины, изначальный контакт между клетками начинается с гетерофильного взаимодействия между PVR на одной клетке и нектином-3 на соседней клетке. Это взаимодействие является временным и приводит к интернализации PVR путем эндоцитоза. Интернализация PVR и связанное с этим нарушение комплекса рецептор факторов роста/интегрин способствует контактному ингибированию клеточной пролиферации [63].
Утрата CD155 ингибирует миграцию и индуцирует клеточное распространение [64]. Предполагается, что CD155 может участвовать в модулировании взаимодействий интегрин/субстрат, что приводит к уменьшению адгезии или увеличению образования фокальных спаек. Было показано, что CD155 взаимодействует с нектином 3 [60], динеин-моторным белком Tctex-1 [65], а также связан с CD44 [66]. Эти взаимодействия играют важную роль в миграции раковых клеток [67].
Помимо участия PVR в адгезии и миграции, также показано его участие в иммунных реакциях. Однако, роль PVR в функционировании иммунной системы выяснена не до конца. Например, было показано, что PVR может участвовать в гуморальных иммунных ответах кишечника [68]. Также имеются данные, указывающие на то, что CD155 может быть использован для позитивной селекции MHC-независимых Т-клеток в тимусе [69].
PVR не только обеспечивает гетерофильные взаимодействия с другими членами семейства нектинов, таким как нектин 3 [60,70], но также он взаимодействует с молекулами из семейства Ig на лимфоцитах, такими как TIGIT, CD226 (DNAM-1) [71] и CD96 [56] для регулирования иммунных ответов [72]. Связывание PVR с данными молекулами индуцирует фосфорилирование ингибирующего мотива иммунорецепторов, содержащего тирозин (ITIM; англ. immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif) и вовлекает Src-киназы и SH2-доменные тирозинфосфатазы 2 типа [73,74]. Показано, что активация PVR с помощью TIGIT ослабляет иммунные ответы in vivo, преимущественно путем активации и фосфорилирования регулируемой внеклеточными сигналами киназы (Erk; англ. extracellular signal-regulated kinase) и индукции секреции противовоспалительного цитокина IL-10 дендритными клетками [73,75]. Натуральные киллеры (NK-клетки; англ. natural killer cells) человека способны распознавать PVR через рецептор DNAM-1, который инициирует активацию NK-клеток. Кроме этого, NK-клетки распознают PVR через дополнительный рецептор CD96, который способствует прикреплению NK-клеток к клеткам-мишеням, экспрессирующим PVR, стимулирует цитотоксичность активированных NK-клеток. Поскольку PVR экспрессируется на высоком уровне в некоторых опухолях, эти взаимодействия могут иметь решающее значение в способности NK-клеток обнаруживать опухолевые клетки [56,71,76].
Повышенная экспрессия CD155 наблюдается в ряде различных линий раковых клеток и первичных опухолей, что указывает на связь между CD155 и раком [77, 78]. Установлено, что фактор морфогенеза sonic hedgehog (Shh) и транскрипционные факторы GLI1 и GLI3 повышают экспрессию CD155 на поверхности многих опухолевых клеток. В норме Shh-зависимый сигнальный путь активен только в эмбриогенезе, однако, для многих карцином характерна его патологическая активация [79-82]. Лиганд Shh и транскрипционные фактору GLI вовлечены в онкогенез нейроэктодермальных опухолей [83]. Сообщается, что CD155 сверхэкспрессируется в опухолях колоректального тракта человека [78]. Также было показано, что TagE4 член семейства нектинов грызунов, недавно предложенный как истинный гомолог CD155 грызунов [84], сверхэкспрессирован в опухолях толстой и молочной железы у мышей [85]. Гиперэкспрессия CD155 является маркером для различных линий раковых клеток, в том числе для глиальных опухолей [42,86,87].
Доказательства экспрессии CD155 в нейроэктодермальных опухолях основаны, главным образом, на исследованиях линий нейроэктодермальных опухолевых клеток, восприимчивых к онколитическим полиовирусам [77]. Однако, систематический анализ экспрессии CD155 в тканях опухолей ЦНС не проводился. Определение уровней экспрессии CD155, как известно, затруднено из-за чрезвычайно низкой его продукции даже в клеточных линиях, обычно используемых для наработки полиовирусов, и в клетках, поражающихся при полиовирусной инфекции, таких как двигательные нейроны спинного мозга человека [88]. Анализ 6 случаев показал, что избыточная экспрессия CD155 обычно ассоциируется с высокой злокачественностью глиомы. Уровни продукции CD155 в опухолевых тканях соответствовали тем, которые были обнаружены в первичных тканевых культурах, полученных из опухолей. Кроме того, экспрессия CD155 в культурах эксплантов первичной глиомы была эквивалентна экспрессии CD155, обнаруженной в перевиваемых клеточных линиях глиомы, используемых в доклинических исследованиях онколитических рекомбинантов полиовируса [49].
Уровни мРНК PVR были повышены в тканях колоректального рака по сравнению со свободной от опухолевой ткани слизистой оболочкой. Иммуногистохимический анализ выявил повышенный уровень белка CD155 во всех изученных опухолевых образцах. Было показано, что относительная экспрессия различных транскриптов CD155 была сходной в разных тестируемых образцах нормальных и раковых клетках, что указывает на то, что повышенный уровень CD155 при злокачественных новообразованиях не связан с конкретным вариантом мРНК, генерируемым путем альтернативного сплайсинга гена CD155 [78].
Рецептор полиовируса был идентифицирован как один из белков-медиаторов инвазии опухолей, что, вероятно, связано с его ролью в миграции клеток. Нокдаун CD155 приводит к нарушению миграции клеток in vitro и выраженному изменению клеточной морфологии, клетки становятся более вытянутыми и нерегулярными по форме. CD155 локализуется на передней кромке мигрирующих опухолевых клеток, совместно с актином и v-интегрином [89,90].
CD155 проявляет промигрирующую активность путем трансдукции сигналов при связывании с белками ECM, или участия в кластеризации более крупных комплексов. Было показано, что сшивание экзогенно экспрессируемого CD155 подавляет фосфорилирование тирозина киназы фокальной адгезии (FAK; англ. focal adhesion kinase) и приводит к фосфорилированию паксиллина в клетках, что ведет к уменьшению адгезии клеток [91]. Сшивание CD155 также приводило к уменьшению адгезии с фибронектином, уменьшению числа очаговых спаек и увеличению миграции [91]. Возможно, что избыточная продукция CD155 в раковых клетках приводит к димеризации CD155 в отсутствие лиганда, что ведет к снижению адгезии и повышению миграции [67].
Было обнаружено, что CD155 по крайней мере частично усиливает пролиферацию ras-мутированных клеток за счет сокращения фазы G0/G1 клеточного цикла [81].
Проникновение полиовируса в клетку опосредуется за счет его взаимодействия с единственным рецептором PVR [92]. Полиовирус связывается с внеклеточным доменом D1 PVR, его сайт связывания включает в себя все три основных капсидных белка [93-95].
Известные механизмы эндоцитоза PV противоречивы. Есть данные, свидетельствующие о том, что PV проникает в клетки HeLa с помощью рецептор-опосредованного эндоцитоза в качестве интактной инфекционной частицы; вирусы заключены в везикулы, покрытые клатрином, через 10 мин после адсорбции. Интактные вирусные частицы могут быть извлечены из клеток в течение 30 минут после адсорбции [96]. Тем не менее, также было показано, что PV может и не требоваться клатриновый путь для проникновения в клетку. Альтернативная система эндоцитоза реализуется в клетках, экспрессирующих доминантно-негативный динамин [97]. Существуют также аргументы в пользу проникновения PV в культивируемые клетки путем слияния PV-частиц с поверхностными мембранами клеток, в этом случае в цитоплазму клетки-хозяина проникает только РНК [98]. Что касается проникновения в синапсы, считается, что преимущественно проникновение происходит путем эндоцитоза. Также возможен путь слияния, что приводит к переносу на большие расстояния РНК PV через аксоны [98].
На сегодняшний день неизвестно сколько PVR необходимо для включения PV в эндосомы, но точно показано, что PVR играет важную роль при проникновении в синапсы, поскольку этот процесс ингибируется моноклональными антителами против PVR, которые связываются с N-концевым доменом PVR и способны блокировать PV-инфекцию [99].
Онколитические энтеровирусы
Исследования энтеровирусов человека привели к идентификации более 100 типов энтеровирусов, которые используют более 10 рецепторов и/или факторов прикрепления, необходимых для связывания клеток и начала цикла репликации. Многие из этих «вирусных» рецепторов гиперэкспрессируются в раковых клетках. Связывание рецептора и способность к репликации в определенных клетках-мишенях определяют тропизм и патогенез энтеровирусов, поскольку клеточная инфекция часто приводит к цитолитическому разрушению клеток. Таким образом, вирусный тропизм и цитолитические свойства делают энтеровирусы перспективными кандидатами для онколитической виротерапии. Модификация геномов энтеровирусов привела к генерации энтеровирусных векторов со свойствами, полезными для терапии или в испытаниях вакцин, где чужеродные антигенные эпитопы экспрессируются на поверхности рекомбинантного вируса. Небольшой размер генома и компактная структура частиц, однако, ограничивают модификации генома энтеровируса [275].
Среди энтеровирусов в качестве антиглиомных агентов изучается только полиовирус, о нем подробно было описано выше (раздел 1.4.1.3). Ниже будет дан краткий обзор онколитических энтеровирусов, исследуемых в качестве агентов для терапии различных онкологических заболеваний.
Вирус Коксаки А21 (CVA21 штамм Kuykendall) является одним из наиболее изученных онколитических энтеровирусов. CVA21 использует ICAM-1 и DAF в качестве рецепторов для прикрепления и инфицирования клеток. По сравнению с нормальными клетками экспрессия этих рецепторов значительно выше в опухолях человека. Онколитические свойства CVA21 сначала оценивали на клеточных культурах in vitro и in vivo против ксенотрансплантатов злокачественных клеток меланомы человека [276]. Исследования in vitro показали, что клетки меланомы человека экспрессируют повышенные уровни рецепторов ICAM-1 и DAF и очень восприимчивы к инфекции CVA21. Однократное введение CVA21 приводило к уменьшению размера и скорости роста опухоли у мышей с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID; англ. severe combined immunodeficiency) с множественными подкожными ксенографтами меланомы. Дальнейшие исследования показали, что вирус заражает многие злокачественные миеломы in vitro, включая U266, RPMI-8226 и NCI-H929, которые экспрессируют ICAM-1 и DAF-рецепторы, но не PBMC (мононуклеарные клетки периферической крови), которые использовались в качестве контроля. Подобные эффекты были обнаружены в экспериментах ex vivo с клиническими образцами костного мозга. Было показано, что CVA21 эффективен в клеточных линиях рака молочной железы (BT-20, SK-BR-3, ZR-75-1, MDA-MB-231, -453, -157 и -361, MCF-7 и Т-47D) [277]. Кроме этого, внутривенная инъекция CVA21 приводила к значительному уменьшению размера первичных опухолей и уничтожению метастазируемых опухолей у мышей SCID.
Самые последние исследования онколитического CVA21 были выполнены с использованием адаптированного путем биоселекции на DAF-экспрессирующих и ICAM-1-отрицательных клетках рабдомиосаркомы RD мутанта CVA21-DAFv [278]. Сравнение родительского CVA21 с CVA21-DAFv показало, что последний способен лизировать линии клеток рака предстательной железы и обладает более эффективными онколитическими свойствами при более низкой дозе вируса для достижения литического разрушения [279]. Было показано, что CVA21-DAFv связывается только с рецептором DAF, что может объяснить его повышенный тропизм к раковым клеткам. Онколитический CVA21, который называется CAVATAK, изучается в клинических испытаниях фазы I и II; в настоящее время существует четыре завершенных клинических исследования, одно активное исследование и два на стадии набора пациентов [275]. Таким образом, CAVATAK представляет собой прекрасный пример онколитического энтеровируса, который не был генетически модифицирован, но был адаптирован для использования специфического рецептора клеточной поверхности для введения и уничтожения раковых клеток.
Геном CVA21, клонированный под контролем T7-промотора, транскрибировали in vitro, а вирусную РНК вводили в ксенотрансплантаты миеломы KAS6/1. Высокие титры инфекционных CVA21 вирионов были обнаружены в кровотоке через 48 ч после инъекции, что привело к быстрой регрессии опухоли. Исследования доза-эффект показали, что эффективная онколитическая инфекция может быть обеспечена как внутривенной, так и внутриопухолевой инъекцией инфекционной РНК. Результаты лечения были сопоставимы между внутриопухолевой инъекцией РНК и инфекционных частиц вируса CVA21 [280].
Miyamoto и соавт. [281] провели массивный скрининг-эксперимент для определения потенциальных онколитических штаммов среди энтеровирусов. Скрининг проводили на различных линиях раковых клеток человека, включая, немелкоклеточный рак легкого (А549, ЛК-87), рак толстой кишки (Caco-2, DLD-1), рак поджелудочной железы (AsPC-1, PANC-1) , рак почки (A-498 и Caki-1), рак молочной железы (MCF7), рак шейки матки (HeLa S3), рабдомиосаркома (RD), лейкоз Т-клеток (HuT 102) и линии клеток стромы костного мозга HS-5. Из 28 протестированных энтеровирусов (включая PV, CV-A21 и многие эховирусы) они обнаружили, что CV-B2 (штамм Ohio-1), CV-B3 (штамм Nancy) и CV-B4 (штамм JVB) оказались наиболее эффективными и были выбраны для второго этапа из-за их исключительных онколитических эффектов в клетках A549 и LK-87. На втором этапе эти вирусы тестировали в других клеточных линиях мелкоклеточного рака легкого (H1299, H460, PC-9, EBC-1, LK-2 и Sq-1), в двух клеточных линиях плоскоклеточной карциномы легкого (QG-56 и QG-95) и в двух линиях нормальных клеток легкого (фибробласты легких NHLF и MRC-5). CVB3 был единственным вирусом, который вызывал цитолиз во всех линиях раковых клеток, но не в клеточных линиях фибробластов легких. Однако, исследования in vivo у мышей Balb/c показали, что даже при подавлении роста опухоли, индуцированной A549 и EBC-1, и активации иммунных клеток против опухолей, вирусная инфекция также вызывает симптомы системной болезни. Поэтому CVB3 требует дополнительных генетических модификаций для ослабления цитотоксических эффектов в нормальных тканях при сохранении онколитических свойств.
EV1 является единственным энтеровирусом, который использует в качестве рецептора интегрин 21, который гиперэкспрессируется в линиях раковых клеток. Shafren и соавт. [282] изучали онколитические свойства на восьми клеточных линиях рака яичников и продемонстрировали, что EV1 способен заражать и уничтожать все типы раковых клеток. Было обнаружено, что онколитический эффект, вызванный EV1, сильнее, чем у CVA21 или EV7. Они также предположили, что, поскольку EV1 связывается с рецептором интегрина 21, который также используется коллагеном 1, он создает конкурентную ситуацию, которая приводит к предотвращению метастазирования раковых клеток. У SCID-мышей инъекция EV1 ингибировала рост опухолей. Было обнаружено, что EV1 проявляет литическую активность по отношению клеточных линий рака желудка (MKN-45, AGS, Hs746T и NCI-N87) [283], а однократная инъекция EV1 приводила к значительному уменьшению размеров опухолей у SCID мышей.
Israelsson и соавт. [284] исследовали онколитический потенциал эховирусов (EV12 Travis, EV15 Charleston, EV17 CHHE-29, EV26 Coronel и EV9 JV-10) на шести клеточных линиях рака толстой кишки (CaCo-2, HT29, LoVo, SW480, SW620 и T84). Клеточные линии SW480 и SW620 интересны тем, что они получены от одного и того же пациента. SW480 была получена из первичной аденокарциномы толстой кишки, а SW620 из метастазов лимфатических узлов через год. Результаты показали, что эховирусы индуцировали лизис клеток SW480 быстрее, чем SW620. Авторы предположили, что во время прогрессирования рака может существовать «скользящее терапевтическое окно», когда онколитический вирус наиболее эффективен. Таким образом, было показано, что эховирусы 12, 17 и 26 являются наиболее перспективными кандидатами для онколитической виротерапии против рака толстой кишки. Аналогично CVA21, другие вирусы видов Enterovirus C используют рецепторы ICAM-1 или DAF для распознования и инфицирования клеток. Онколитические свойства CVA13 штамма Flores, CVA15 штамма G-9 и CVA18 штамма G-13 изучались на линиях клеток меланомы in vitro и in vivo в сравнении со свойствами CVA21 [13]. Хотя в тестах in vitro CVA21 был более эффективен, некоторые из других исследованных вирусов хорошо себя показали в экспериментах in vivo. CVA18 вызывал регрессию опухоли в течение 48 дней в пяти из пяти случаев, CVA15 в двух из пяти, а CVA13 ни в одном случае [275].
Получение гуманизированной линии клеток глиомы С6 крысы, экспрессирующих гены PVR или CXADR человека
Клетки глиомы С6 крысы, экспрессирующие мРНК PVR или CXADR человека, получали с помощью метода лентивирусной трансдукции, как описано в разделе «Материалы и методы исследования». Далее проводили 3 раунда селекции клеток на среде с пуромицином. После селекции среди трансдуцированных клеток обнаруживались BFP-негативные клетки, поэтому BFP-позитивные клетки (пик эмиссии 457 нм) были отсортированы с помощью флуоресцентного клеточного сортера. Отобранные клетки С6-PVR-BFP и C6-CXADR-BFP культивировали в полной ростовой среде.
Отобранные трансдуцированные клетки анализировали с помощью проточной цитометрии на предмет BFP-флуоресценции и наличия рецепторов.
Для определения наличия полиовирусного рецептора клетки окрашивали антителами к PVR и вторичными антителами, меченными Alexa Fluor 633 (рисунок 5). Как видно на рисунке 5, количество BFP-позитивных клеток составило 93%, а клеток, окрашенных антителами к PVR – 71%. Несмотря на то, что клеток, окрашенных антителами против PVR, оказалось меньше, чем клеток с BFP-флуоресценцией, рисунок 6 иллюстрирует прямую зависимость между уровнем BFP-флуоресценции и уровнем экспрессии PVR (уровень флуоресценции Alexa Fluor 633), коэффициент корреляции Пирсона равен 0,986, р 0,05. Таким образом, мы подтвердили, что PVR слит с BFP.
Для подтверждения мембранной локализации PVR человека в клетках глиомы С6 было проведено иммуноцитохимическое окрашивание клеток. Как видно на рисунке 7, полиовирусный рецептор человека локализован в мембране клеток, причем интенсивность флуоресценции, опосредованная экспрессией PVR в клетках, варьируется.
Иммуноцитохимический анализ фиксированных клеток глиомы С6-PVR-BFP. А – визуализация BFP-флуоресценции, Б – окрашивание первичными антителами к PVR и вторичными антителами, меченными Alexa Fluor 633 (красная флуоресценция). Увеличение х400. Для подтверждения наличия рецептора CXADR клетки C6-CXADR-BFP окрашивали антителами двух производителей (против разных эпитопов): Abcam #ab153740 и Thermo Scientific #PA5-12476. По результатам окрашивания как антителами Abcam #ab153740, так и Thermo Scientific #PA5-12476 было выяснено, что использованные антитела имеют перекрестную реактивность к крысиному CXADR. На рисунке 8 (окраска антителами Thermo Scientific #PA5-12476) видно, что контрольные клетки С6 также окрашиваются антителами к CXADR, как и клетки C6-CXADR-BFP с введенным человеческим CXADR. Но, тем не менее, как видно на рисунке 8, в клетках C6-CXADR-BFP визуализируется tagBFP, а так как нами была введена генетическая конструкция CXADR, слитая с геном флуоресцентного белка tagBFP, то наличие в клетках BFP позволяет нам говорить о присутствии в этих клетках рецептора CXADR человека. Также для этой линии была проведена проточная цитофлуориметрия (рисунок 9), BFP-позитивные клетки составили 92% популяции.
Также стоит отметить, что полученные линии были гетерогенны по количеству рецептора в клетках. В клетках С6-PVR-BFP (рисунок 10A) наибольшая доля клеток глиомы С6 продуцирует среднее количество PVR, а в самую немногочисленную группу входят клетки с высоким уровнем PVR. Такая же картина характерна для клеток C6-CXADR-BFP по интенсивности BFP-флуоресценции в клетках (рисунок 10Б).
Стабильность экспрессии генов PVR и CXADR в клетках глиомы С6 оценивали по синтезу белка BFP в клетках путем повторного определения количества BFP-позитивных клеток через 10 и 20 пассажей, а также после разморозки клеток на 5 пассаже. Было установлено, что полученные гуманизированные линии С6-PVR-BFP и C6-CXADR-BFP стабильно экспрессировали введенные в их геном кДНК рецепторов, слитую с tagBFP; процент BFP-позитивных клеток составлял не менее 92%. Рисунок 10 – Проточная цитометрия клеток гуманизированных линий глиомы С6: А-PVR в клетках C6-PVR-BFP, окрашенных антителами к PVR; Б – BFP-флуоресценция в клетках С6-СXADR-BFP.
Таким образом, мы получили гуманизированные линии клеток глиомы С6, несущие на своей поверхности полиовирусный рецептор человека или рецептор Коксаки и аденовирусов, слитые с синим флуоресцентным белком. Полученные клеточные линии стабильно экспрессировали гены рецепторов человека и характеризовались гетерогенностью популяции по количеству рецептора в клетках.
Оценка онколитической активности непатогенных штаммов энтеровирусов человека на модели подкожных ксенографтов гуманизированных клеток глиомы C6 на иммунодефицитных мышах
Онколитический потенциал вакцинного штамма PV3 испытывали на модели подкожных ксенографтов на бестимусных мышах. Специфичность действия PV3 тестировали на ксенографтах клеток С6 и С6-PVR-BFP. Лечение проводили на 7 день после имплантации клеток, вирус вводили в хвостовую вену, животным контрольной группы вводили физраствор (рисунок 34). Как и предполагалось, введение PV3 не оказывало влияния на ксенографты из клеток С6 (рисунок 34Б).
Опухолевые узлы из клеток C6-PVR-BFP у мышей, получавших лечение PV3, имели меньший объем по сравнению с контролем (рисунок 34А). Достоверный тормозящий рост опухоли C6-PVR-BFP эффект PV3 был отмечен на 10, 15 и 18 день после начала терапии, при этом показатель эффективности T/С составил около 50%. Анализ скорости роста показал, что в опытной группе после вирусной терапии скорость роста ксенографтов (Vt/V0) была в 2 раза ниже по сравнению с контрольной группой, на протяжении всего времени проведения эксперимента: Vt3, 7, 10, 15, 18=2,2-4,2-7,5-13,4-20,5 против Vt3, 7, 10, 15, 18=3,7-8,1-14,8-27,2-41. Таким образом, онколитическое действие PV3 в отношение клеток глиомы C6-PVR-BFP реализуется на уровне Т/С=50%, с уменьшением скорости роста опухоли в 2 раза.
Не смотря на то, что после проведенной виротерапии наблюдается только замедление роста ксенографтов у мышей, полученные данные позволяют считать глиому C6-PVR-BFP чувствительной к противоопухолевому действию вакцинного штамма PV3, что делает ее пригодной в качестве экспериментальной модели для изучения механизмов энтеровирусного онколиза в доклинических испытаниях на животных моделях. А для достижения более выраженного онколитического эффекта PV3, вероятно, необходимо многократное введение вируса для поддержания эффективного распространения инфекции и полного уничтожения опухолевых клеток.
Помимо этого, было изучено влияние нокаута гена Ifnar1 в клетках глиомы С6 на противоопухолевую активность вакцинного PV3 на модели подкожных ксенографтов. Терапию PV3 животных с ксенографтами из клеток C6-PVR-BFP-IFNAR1 проводили по схеме, описанной выше. Результаты представлены на рисунке 35.
Как видно на рисунке 35, динамика роста ксенографтов из клеток C6-PVR-BFP-IFNAR1 отличается от таковой для клеток C6-PVR-BFP (рисунок 34). Ксенографты из клеток C6-PVR-BFP-IFNAR1 растут гораздо медленнее, чем из клеток C6-PVR-BFP. Что касается эффекта от терапии PV3 на модели ксенографтов из клеток C6-PVR-BFP-IFNAR1 с нокаутом гена Ifnar1, мы наблюдаем схожую картину с лечением ксенографтов из имплантированных клеток без нокаута гена Ifnar1. Таким образом, нокаут гена интерферонового рецептора первого типа в клетках C6-PVR-BFP-IFNAR1 не влияет кардинально на цитолитическую активность вакцинного PV3 в экспериментах in vivo, в отличие от экспериментов in vitro (Раздел 3.4). Отсутствие различий противоопухолевого эффекта между изученными моделями скорее всего связанно с тем, что однократное введение вируса не позволяет увидеть статистически значимых различий в связи с несколькими обстоятельствами. Во-первых, введение вируса проводилось при довольно больших объемах ксенографтов. Во-вторых, вероятно, необходимо использовать более совершенные способы доставки (введение вируса на клетках-носителях или прямое введение вируса в опухоль).