Исследование механизмов инсуляции и защиты от «эффекта положения» у высших эукариот Гасанов Низами Бадрудинович

Содержание к диссертации

Введение

Список использованных сокращений и терминов 5

1 Введение 6

1.1 Актуальность работы 6

1.2 Цель и задачи исследования 8

1.3 Научная новизна и практическая значимость работы 9

1.4 Положения, выносимые на защиту 10

1.5 Степень достоверности и апробация результатов 10

2 Обзор литературы 12

2.1 Векторные конструкции, используемые для получения клеточных линий, экспрессирующих целевые белки 13

2.2 Промоторы и энхансеры, используемые для получения клеточных линий-продуцентов целевых белков 17

2.3 Перспективы использования инсуляторов для повышения эффективности экспрессии целевого гена в клеточных линиях-продуцентах 20

2.4 Повышение уровня экспрессии трансгена с помощью А/Т-богатых последовательностей, ассоциированных с белками ядерного матрикса (S/MAR) 28

2.5 Повышение уровня экспрессии трансгена в культурах клеток с помощью регуляторных элементов, содержащих сильные промоторы генов «домашнего хозяйства» 32

2.6 Повышение уровня экспрессии трансгена в культурах клеток с помощью регуляторных элементов, защищающих от НР1-зависимой репрессии 35

3 Материалы и методы 37

3.1 Объекты 37

3.2 Общие методы работы с бактериями Escherichia coli

3.2.1 Приготовление музея штамма 37

3.2.2 Приготовление компетентных клеток 37

3.2.3 Трансформация компетентных клеток E.coli DH5 38

3.3 Методы работы с ДНК 38

3.3.1 Выделение плазмидной ДНК в большом объеме (Maxiprep) 38

3.3.2 Выделение плазмидной ДНК в маленьком объеме (Miniprep) 39

3.4 Методы генетической инженерии 40

3.4.1 Горизонтальный гель-электрофорез ДНК и выделение фрагментов ДНК из агарозного геля

3.4.2 Переосаждение ДНК из раствора 41

3.4.3 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 41

3.4.4 Создание трансгенных конструкций 41

3.5 Работа с культурой клеток S2 43

3.5.1 Ведение культуры клеток S2 43

3.5.2 Трансфекция культуры клеток S2 43

3.6 Работа с культурой клеток СНО-К1 44

3.6.1 Ведение культуры клеток СНО-К1 44

3.6.2 Получение трансфецированных клеточных линий CHO-K1 44

3.6.3 Поддержание пулов трансфецированных клеток 45

3.6.4 Получение индивидуальных клонов 45

3.7 Определение уровня экспрессии репортерных генов 46

3.7.1 Двойной люциферазный анализ 46

3.7.2 Выделение ДНК, РНК, обратная транскрипция 46

3.7.3 Количественная ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени 46

3.7.4 Цитофлуориметрический анализ клеток СНО-К1 47

4 Результаты и обсуждение 48

4.1 Создание модельной системы для тестирования терминаторов на повышение стабильности и уровня экспрессии репортерного гена в CHO-клетках 48

4.2 Исследование стабильности и эффективности экспрессии EGFP в тотальной популяции трансфецированных клеток 50

4.3 Исследование стабильности и эффективности экспрессии EGFP в стабильных клеточных линиях полученных после 30 дней трансфекции 52

4.4 Исследование стабильности и эффективности экспрессии EGFP в стабильных клеточных линиях полученных после 90 дней трансфекции 54

4.5 Активность энхансера мобильного элемента copia зависит от выбранной клеточной линии дрозофилы 57

4.6 Активность энхансера не зависит от количества copia-элементов, которые содержатся в клеточной линии 60

4.7 Энхансер copia индуцирует транскрипцию в двух направлениях с эффективностью, сравнимой с базовой активностью hsp70-промотора 62

4.8 Инсулятор из ретротранспозона МДГ4 незначительно влияет на активность энхансера copia в положении перед промотором. 63

4.9 Две копии инсулятора, окружающие энхансер, полностью инактивируют его активность. 66

4.10 Транскрипция с энхансера не влияет на активность инсулятора МДГ4. 70

5 Выводы 73

6 Благодарности 74

7 Список литературы 75

• Научная новизна и практическая значимость работы
• Перспективы использования инсуляторов для повышения эффективности экспрессии целевого гена в клеточных линиях-продуцентах
• Горизонтальный гель-электрофорез ДНК и выделение фрагментов ДНК из агарозного геля
• Исследование стабильности и эффективности экспрессии EGFP в стабильных клеточных линиях полученных после 90 дней трансфекции

Введение к работе

Актуальность работы

В настоящее время все большее число лекарственных препаратов производится в биореакторах, основанных на культурах клеток, и, прежде всего, в культуре клеток яичника китайского хомячка (СНО) (Hacker et al., 2009; Kim et al., 2012). Однако основной проблемой при производстве рекомбинантных белков в культурах клеток является крайне высокая себестоимость продукта. Одним из способов оптимизации производства является усовершенствование векторов для получения трансгенов, что позволяет значительно снизить затраты в процессе выведения и поддержания эффективных клеточных линий-продуцентов.

С целью увеличения эффективности трансфекции и повышения стабильности
экспрессии трансгена с начала 90-х годов широко используются

последовательности ДНК, обычно А/Т-богатые, которые, как было показано в экспериментах in vitro, взаимодействуют с фракцией ядерного матрикса (MAR, matrix attachment region) (Kim et al., 2004; Girod et al., 2005; Harraghy et al., 2008). Также используются инсуляторы, и прежде всего HS4-инсулятор (1.2 т.п.н.), найденный на границе -глобинового домена в геноме курицы (Recillas-Targa et al., 2004; Kwaks et al., 2006; Максименко и др., 2013). Инсуляторы - особый класс регуляторных элементов, способных регулировать взаимодействия между энхансерами и промоторами в геноме высших эукариот. В некоторых случаях используют комбинации известных MAR и HS4-инсулятора, либо мультимеризуют его коровую последовательность (500 п.н.) (Recillas-Targa et al., 2004). Было найдено, что промоторы генов «домашнего хозяйства» (UCOE) (Antoniou et al., 2003; Palazzoli et al., 2011) и регуляторные элементы, блокирующие распространение гетерохроматина (Kwaks et al., 2003; Palazzoli et al., 2011), также эффективно повышают экспрессию трансгенов в стабильно трансфицированных культурах клеток.

Однако все вышеперечисленные элементы действуют эффективно только в определенных клеточных линиях. Пока не найдены универсальные регуляторные элементы с понятным механизмом действия, которые можно было бы эффективно использовать в составе всех типов векторных конструкций, предназначенных для получения высокопродуктивных клеточных линий-продуцентов различных белков. Очевидно, что даже для самых сильных промоторов должны существовать механизмы супрессии «чрезмерной» транскрипции. Одним из таких механизмов ограничения транскрипции является РНК-интерференция (Martianov et al., 2007; Saxena and Carninci, 2011). Часто репрессионные эффекты при встройке трансгена связаны с транскрипцией, проходящей через трансген. Например, транскрипция через энхансер приводит к инактивации его активности (Erokhin et al., 2007). Длинные некодирующие РНК могут также рекрутировать на регуляторные элементы репрессионные комплексы (Khalil et al., 2009). Поскольку транскрипция, проходящая через регуляторные элементы, оказывает негативное влияние на экспрессию трансгена, можно предположить, что прерывание транскрипции на границах трансгена должно положительно влиять на стабилизацию его экспрессии. Следует заметить, что далеко не все известные инсуляторы способны эффективно терминировать транскрипцию (Silicheva et al., 2010). В настоящее время механизмы действия инсуляторов остаются исследованными лишь частично, что во многом связано с отсутствием удобных модельных систем.

В представленной диссертационной работе показано, что регуляторные ДНК-элементы, включающие в свой состав известные терминаторы транскрипции, либо одновременно терминатор транскрипции и инсулятор, способствуют стабилизации и значительному увеличению уровня экспрессии трансгена в культуре клеток китайского хомячка CHO. Использование таких регуляторных ДНК-элементов при создании генноинженерных конструкций предоставляет возможность увеличения стабильности и уровня экспрессии целевых белков в клеточных линиях. Также в работе усовершенствована модельная система, позволяющая исследовать функциональные свойства различных инсуляторов в культуре клеток дрозофилы.

Цели и задачи исследования

Целью данной работы было изучение способности цис-регуляторных элементов изолировать гены от влияния окружающего хроматина. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Исследовать влияние хорошо охарактеризованных терминаторов транскрипции на стабильность и уровень экспрессии репортерного гена в течение длительного периода культивирования клеточных линий CHO-K1.

2. Изучить влияние инсулятора совместно с последовательностями терминаторов на стабильность и уровень экспрессии репортерного гена в течение длительного периода культивирования клеточных линий CHO-K1.

3. Исследовать функционирование энхансера мобильного элемента copia при
транзиентной экспрессии в разных клеточных линиях дрозофилы.

4. Создать новую транзиентную модель с инсулятором МДГ4 на кольцевых
плазмидах для исследования основных свойств инсуляторов.

Научная новизна, теоретическая и практическая значимость работы

В данной работе показано, что последовательности терминаторов транскрипции, обрывающие геномные транскрипты и изолирующие трансген от транскрипционных сигналов, обладают способностью поддерживать уровень транскрипции трансгена на стабильно высоком уровне на протяжении достаточно длительного периода культивирования клеточных линий CHO-K1. Также полученные результаты демонстрируют, что терминатор является более эффективным защитным элементом по сравнению с инсулятором в поддержании стабильного уровня экспрессии трансгена в клонах CHO-K1. Более того комбинация терминатора транскрипции и инсулятора обладает аддитивным эффектом, усиливающим и стабилизирующим экспрессию трансгена в клеточных линиях CHO-K1. Таким образом, терминаторы транскрипции могут быть использованы для получения культур клеток млекопитающих с высоким и стабильным уровнем наработки целевого белка.

В связи с тем, что в первой части работы было показано, что комбинация терминатора транскрипции и инсулятора обладает аддитивным эффектом, усиливающим и стабилизирующим экспрессию трансгена в клеточных линиях CHO-K1, нами было продолжено исследование модельной системы для исследования механизмов работы и основных свойств инсуляторов. В новой транзиентной модели на кольцевых плазмидах в эмбриональных культурах клеток дрозофилы наиболее хорошо исследованный инсулятор МДГ4 сохраняет свои основные свойства, описанные при изучении в модельных систем на основе трансгенных линий дрозофилы (Kyrchanova et al., 2013). Одна копия инсулятора

только частично блокирует активность энхансера, в то же время две копии инсулятора, окружающие либо энхансер, либо репортерный ген, приводят к полной инактивации энхансера.

В результате проведенного исследования была доработана модельная система для исследования активности инсуляторов в эмбриональных клеточных линиях дрозофилы. Таким образом, в культуре клеток дрозофилы можно исследовать основные свойства инсуляторов, что дает дополнительные возможности для исследования функциональной роли новых инсуляторных белков не только дрозофилы, но и млекопитающих.

Методология и методы исследования

Работа выполнена с использованием современного оборудования и методов молекулярной и клеточной биологии (методы генетической инженерии, работа с культурами клеток дрозофилы, работа с культурой клеток млекопитающих, методы определения уровня экспрессии репортерных генов).

Положения, выносимые на защиту

1. Показано, что последовательности терминаторов транскрипции SV40, - и
-глобиновых генов человека обладают способностью увеличивать уровень
экспрессии репортерного гена в клеточных линиях CHO-K1 эффективнее по
сравнению сдвумя копиями коровой части куриного инсулятора HS4.

2. Продемонстрировано, что комбинация терминатора транскрипции и двух
копий коровой части куриного инсулятора HS4 обладает аддитивным эффектом,
усиливающим и стабилизирующим экспрессию трансгена в клеточных линиях
CHO-K1.

3. Показано, что энхансер copia обладает свойствами слабого двустороннего промотора, который функционирует только в некоторых эмбриональных клеточных линиях дрозофилы.

4. Показано, что в транзиентной модели на кольцевых плазмидах, трансфицированных в Sg4-клетки дрозофилы, наиболее хорошо исследованный инсулятор МДГ4 сохраняет свои основные свойства, ранее описанные на модельных системах в трансгенных линиях дрозофилы.

Степень достоверности и апробация результатов работы

Результаты работы были опубликованы в виде трех научных публикаций в рецензируемом научном журнале и представлены на научной конференции (см. перечень в разделе «Список работ, опубликованных по теме диссертации»).

Личный вклад соискателя

Автор внёс существенный личный вклад в получение изложенных в
диссертации новых научных данных. Им выполнен основной объём работ:
создание генетических конструкций, получение трансфицированных клеточных
линий CHO-K1, получение индивидуальных клонов CHO-K1 из пулов
трансфицированных клеток, трансфекция культуры клеток S2 и Sg4, определение
уровня экспрессии репортерных генов, проведение экспериментов по

количественному измерению продуктов транскрипции.

Структура и объем работы

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, а также выводов, благодарности и списка литературы. Работа изложена на 94 страницах машинописного текста, включая 10 рисунков и 1 таблицы. Список цитируемых литературных источников включает 192 наименований.

Научная новизна и практическая значимость работы

Целью данной работы было изучение способности цис-регуляторных элементов изолировать гены от влияния окружающего хроматина.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Исследовать влияние хорошо охарактеризованных терминаторов транскрипции на стабильность и уровень экспрессии репортерного гена на время длительного периода культивирования клеточных линий CHO-K1.

2. Изучить влияние инсулятора совместно с последовательностями терминаторов на стабильность и уровень экспрессии репортерного гена на время длительного периода культивирования клеточных линий CHO-K1.

3. Исследовать функционирование энхансера мобильного элемента copia при транзиентной экспрессии в разных клеточных линиях дрозофилы. 4. Создать новую транзиентную модель с инсулятором МДГ4 на кольцевых плазмидах для исследования основных свойств новых инсуляторов.

В данной работе показано, что последовательности терминаторов транскрипции, обрывающие геномные транскрипты и изолирующие трансген от транскрипционных сигналов, обладают способностью поддерживать уровень транскрипции трансгена на стабильно высоком уровне на протяжении достаточно длительного периода культивирования клеточных линий CHO-K1. Также полученные результаты демонстрируют, что терминатор является более эффективным защитным элементом по сравнению с инсулятором в поддержании стабильного уровня экспрессии трансгена в клонах CHO-K1. Более того комбинация терминатора транскрипции и инсулятора обладает аддитивным эффектом, усиливающим и стабилизирующим экспрессию трансгена в клеточных линиях CHO-K1. Таким образом, терминаторы транскрипции могут быть использованы для получения культур клеток млекопитающих с высоким и стабильным уровнем наработки целевого белка.

В связи с тем, что в первой части работы было показано, что комбинация терминатора транскрипции и инсулятора обладает аддитивным эффектом, усиливающим и стабилизирующим экспрессию трансгена в клеточных линиях CHO-K1, нами было продолжено исследование модельной системы для исследования механизмов работы и основных свойств инсуляторов. В новой транзиентной модели на кольцевых плазмидах в эмбриональных культурах клеток дрозофилы наиболее хорошо исследованный инсулятор МДГ4 сохраняет свои основные свойства, описанные при изучении в модельных систем на основе трансгенных линий дрозофилы [29]. Одна копия инсулятора только частично блокирует активность энхансера, в то же время две копии инсулятора, окружающие либо энхансер, либо репортерный ген, приводят к полной инактивации энхансера.

В результате проведенного исследования была доработана модельная система для исследования активности инсуляторов в эмбриональных клеточных линиях дрозофилы. Таким образом, в культуре клеток дрозофилы можно исследовать основные свойства инсуляторов, что дает дополнительные возможности для исследования функциональной роли новых инсуляторных белков не только дрозофилы, но и млекопитающих. 1.4 Положения, выносимые на защиту 1. Показано, что последовательности терминаторов транскрипции SV40, - и -глобиновых генов человека обладают способностью увеличивать уровень экспрессии репортерного гена в клеточных линий CHO-K1 эффективнее, чем две копии коровой части куриного инсулятора HS4. 2. Продемонстрировано, что комбинация терминатора транскрипции и двух копий коровой части куриного инсулятора HS4 обладает аддитивным эффектом, усиливающим и стабилизирующим экспрессию трансгена в клеточных линиях CHO-K1. 3. Показано, что энхансер copia обладает свойствами слабого двустороннего промотора, который функционирует только в некоторых клеточных линиях дрозофилы, полученных из эмбрионов. 4. Показано, что в транзиентной модели на кольцевых плазмидах, трансфецированных в Sg4-клетки дрозофилы, наиболее хорошо исследованный инсулятор МДГ4 сохраняет свои основные свойства, которые были ранее описаны на модельных системах в трансгенных линий дрозофилы.

Перспективы использования инсуляторов для повышения эффективности экспрессии целевого гена в клеточных линиях-продуцентах

Такой механизм действия инсуляторов был продемонстрирован с помощью искусственно созданных инсуляторов, состоящих из сайтов связывания для белков, способных эффективно взаимодействовать друг с другом и образовывать стабильные хроматиновые петли [90, 91], и в трансгенных линиях дрозофилы [29]. Этот механизм эффективно проявляется только в том случае, когда инсуляторы расположены в непосредственном соседстве с блокируемыми элементами (энхансерами и промоторами). При увеличении размеров хроматиновой петли, формируемой инсуляторами, блокирование энхансера по такому механизму не происходит [92]. Второй, более общий механизм, основан на установлении прямых контактов между белками, связанными с инсулятором, и энхансер-промоторным комплексом. Например, в трансгенных линиях дрозофилы было показано, что инсуляторы могут непосредственно взаимодействовать с промоторами и энхансерами [29, 93]. В данной ситуации, когда инсулятор находится между энхансером и промотором, инсуляторные белки мешают установлению правильных контактов между транскрипционными комплексами, собранными на энхансере и промоторе, в результате это приводит к частичной или полной неспособности энхансера стимулировать транскрипцию с промотора.

Механизмы, определяющие барьерную функцию инсуляторов, в настоящее время для дрозофилы и млекопитающих описаны достаточно подробно. В частности, было показано, что ИАБ помогают рекрутировать на инсуляторы белковые комплексы, которые отвечают за ремоделирование и модификации нуклеосом [94-98], что в результате приводит к созданию зон открытого хроматина. Одновременно некоторые инсуляторы могут привлекать белковые комплексы, непосредственно принимающие участие в стимуляции транскрипции [95] . За счет создания свободных от нуклеосом участков ДНК и рекрутирования транскрипционных комплексов инсуляторы блокируют распространение репрессионного хроматина, что, тем не менее, не исключает и возможности прямого взаимодействия инсуляторов с сайленсерами, инициирующими гетерохроматизацию хроматина.

У позвоночных пока описан только один инсуляторный ДНК связывающий белок, CTCF, [27, 73, 99], что, вероятно, связано с отсутствием удобных модельных систем для изучения инсуляторов. Было показано, что CTCF способен поддерживать дистанционные взаимодействия между удаленными участками хроматина [27, 81, 99, 100]. Таким образом, CTCF является первым описанным архитектурным белком в геноме млекопитающих [61, 99]. Несмотря на описанную ключевую роль в формировании архитектуры хроматина, домены белка CTCF остаются слабо изученными, и до сих пор не охарактеризован механизм функционирования CTCF в процессе поддержания дистанционных взаимодействий. В центральной части белка расположены 11 цинковых пальцев (ZF) C2H2-типа, из них только четыре (с 4 по 7) необходимы для узнавания корового ДНК-мотива [101]. Предполагается, что остальные цинковые пальцы также способны узнавать определенные последовательности ДНК, тем самым стабилизируя связывание CTCF с ДНК. Наиболее логично предположить, что белок, поддерживающий дистанционные взаимодействия, способен к эффективной ди- или мультимеризации. Действительно, было показано, что CTCF способен гомодимеризоваться, однако домен, ответственный за эту активность, не был локализован [102]. Также были получены данные, согласно которым С-концевой домен белка CTCF взаимодействует напрямую со своими цинковыми пальцами [103]. Однако такое взаимодействие не может быть высокоспецифичным, так как цинковые пальцы CTCF взаимодействуют со многими транскрипционными факторами: CHD8, Sin3A, YB-1 [104-106].

Предполагается, что существенную роль в организации дистанционных взаимодействий играет когезиновый комплекс [81, 99, 107-108], непосредственно взаимодействующий с CTCF [109]. Когезиновый комплекс рекрутируется на хроматин с помощью CTCF и способствует установлению дистанционных взаимодействий между геномными CTCF-сайтами. Такая модель согласуется с данными полногеномных исследований, демонстрирующих высокую степень ко-локализации CTCF и когезиновых субъединиц [110, 111]. Однако в экспериментах по инактивации CTCF происходит совсем незначительное снижение уровня связывания когезинов с хроматином, что предполагает участие и других транскрипционных факторов в рекрутировании когезинового комплекса на хроматин [111-113]. Более того, инактивация CTCF и когезинов приводит к разным нарушениям архитектуры хроматина [114, 115], что можно объяснить независимым функционированием этих белков.

В биотехнологии используется наиболее хорошо изученный инсулятор позвоночных, HS4, размером 1200 п.н., расположенный на 5 -конце глобинового локуса кур [116, 117] (рисунок 2). В этом инсуляторе выявлен коровый участок длиной в 250 п.н., обладающий полной инсуляторной активностью и содержащий 5 фрагментов (FI, FII, FIII, FIV, FV), каждый из которых имеет функциональное значение. В участке FII был идентифицирован сайт связывания для белка CTCF, являющегося необходимым и достаточным для проявления энхансер-блокирующей активности HS4-инсулятора [118]. За способность создавать границу между активным хроматином и гетерохроматином отвечают белки USF1 и USF2, которые связываются в виде гетеродимера с FIV-районом [119]. Было показано, что USF рекрутирует белковые комплексы, которые отвечают за модификации гистонов, стимулирующих транскрипцию [119, 120]. С другими районами HS4-инсулятора (FI, FIII, FV) связывается белок BGP1/Vezf1, который имеет ДНК-связывающий домен, состоящий из цинковых пальцев [121]. Было показано, что белок BGP1/Vezf1 защищает GC-богатые последовательности инсулятора от метилирования, которое приводит к нарушению связывания инсуляторных белков с ДНК, и как следствие, к инактивации инсулятора. Согласно существующей модели, BGP1/Vezf1 терминирует слабую транскрипцию из гетерохроматинового района, что может играть важную роль в защите бета-глобинового локуса от распространения неактивного хроматина [122].

Горизонтальный гель-электрофорез ДНК и выделение фрагментов ДНК из агарозного геля

Культура клеток CHO-K1 культивировалась на среде DMEM, содержащей 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМа L-глутамина, 35 мг/л L-пролина, а также коммерческий антибиотик Mycokill-AB (PAA Laboratories) в рабочей концентрации. Пересев клеток производился 1 раз в 5 дней при концентрации клеток 105 клеток на см2, с разведением 1:20. Клетки культивировали при температуре 37C, в атмосфере 5%-го CO2 и высокой влажности.

Культура клеток CHO-K1 была трансфецирована полученными рекомбинантными плазмидами. Для более эффективной интеграции трансгенной конструкции в геном, плазмиды были линеаризованы при помощи рестриктазы ApaLI. Трансфекция проводилась согласно следующему протоколу. Клетки в количестве 70-80% от монослоя (8 104 клеток на см2) промывались культуральной средой, не содержащей сыворотки. Подготавливалась трансфекционная смесь: 3-4 мкг линеаризованной плазмидной ДНК смешивались с 375 мкл культуральной среды, не содержащей сыворотки. В отдельной пробирке с таким же количеством аналогичной среды смешивался коммерческий трансфецирующий реагент Lipofectamine 2000, количество которого определялось соотношением 3 мкл реактива на 1 мкг плазмидной ДНК. После этого полученные растворы объединялись и инкубировались при комнатной температуре в течение 30-40 минут. Полученная трансфекционная смесь наслаивалась на промытые клетки. Через 4 - 6 часов после начала трансфекции трансфекционная смесь заменялась на культуральную среду DMEM с сывороткой. Анализ уровня экспрессии репортерного гена оценивался по интенсивности флуоресценции на вторые сутки после трансфекции (36-48 часов) при помощи проточной цитофлуориметрии на приборе MACSQuant Analyzer VYB (Miltenyi Biotec). В качестве отрицательного контроля использовались нетрансфецированные клетки линии CHO-K1.

После проведения трансфекции полученные пулы культивировались согласно описанному выше протоколу. Для того чтобы избавиться от клеток, не содержащих трансген, производилась селекция полученных пулов трансфецированных клеток при помощи коммерческого антибиотика Geneticin (Invitrogen), вводимого в концентрации 800 мкг/мл. Так как в результате подавления транскрипционной активности трансгена наработка продукта гена устойчивости к антибиотику с течением времени снижается, после 77 суток культивирования концентрация антибиотика была постепенно снижена до 200 мкг/мл.

Культивируемые пулы снимались с планшетов и разводились в 10 мл культуральной среды. После этого концентрация клеток подсчитывалась при помощи автоматического счетчика Scepter (Millipore) и производились дополнительные разведения таким образом, чтобы концентрация клеток составляла 2-3 клетки на миллилитр среды. Полученная суспензия переносилась в 24-х луночные планшеты по 1 мл на лунку.

После 2-х недель культивирования на среде DMEM, содержащей антибиотик Geneticin в концентрации 800 мкг/мкл производился цитофлуорометрический анализ выживших клонов. Дальнейшее поддержание полученных линий и анализ уровня экспрессии EGFP производились согласно методике, описанной для пулов трансфецированных клеток. Измерения интенсивности флуоресценции EGFP проводились через каждые 15 суток.

Двойной люциферазный анализ проводили с использованием набора реактивов Firefly & Renilla Luciferase Assay Kit (Biotium) по инструкции производителя. Измерения проводили на люминометре с чувствительностью 100 и временем экспозиции 1 с.

ДНК выделяли из культуры клеток S2 при помощи реагента DNAzol (MRC) согласно рекомендациям производителя. РНК выделяли из S2-клеток при помощи TRI-реагента (Ambion) согласно рекомендациям производителя. Выделенную тотальную РНК очищали от примеси геномной ДНК с помощью набора реактивов Turbo DNA-free (Ambion). К 1-5 мкг полученного препарата РНК добавляли случайные гексамеры до концентрации 1-5 мкМ. Нагревали до 70C, инкубировали в течение 5 мин и быстро охлаждали во льду. Добавляли 4 мкл 2,5 мМ dNTP, 2 мкл буфера, 5 единиц SUPERase-In (Ambion), 60 единиц обратной транскриптазы ArrayScript Reverse Transcriptase (Ambion). Реакцию инкубировали в течение 2 часов при 42C, затем инактивировали ферменты при нагревании до 95C в течение 5 минут.

Исследование стабильности и эффективности экспрессии EGFP в стабильных клеточных линиях полученных после 90 дней трансфекции

В работе [20] было показано, что комплексный регуляторный элемент, состоящий из энхансеров SV40 и copia, индуцирует двустороннюю транскрипцию. В настоящее время существует достаточно много данных о том, что на большой части энхансеров происходит инициация транскрипции [178, 179]. Наиболее часто с энхансеров запускается транскрипция коротких нестабильных неполиаденилированных транскриптов, которые, чаще всего, не транспортируются в цитоплазму и не транслируются. Поэтому было решено проверить способность энхансера copia индуцировать транскрипцию. В последних работах было показано, что некоторые энхансеры могут продуцировать полноценные мРНК [178, 179]. Поэтому было также проведено исследование способности энхансера copia продуцировать полиаденилированную РНК, способную транслироваться.

Для решения поставленных задач были сделаны конструкции, в которых энхансер copia был встроен в прямой либо обратной ориентации вместо hsp70-промотора выше репортерного гена люциферазы светлячка (рисунок 7Б). В качестве контроля были использованы плазмиды с и без hsp70-промотора выше репортерного гена. Тестируемые плазмиды были трансфецированы в Sg4-клетки. В результате было показано, что в обоих ориентациях с энхансера copia запускается транскрипция и экспрессируется люцифераза, но в 5-20 раз слабее, по сравнению с конструкцией с hsp70 промотором. При этом в прямой ориентации энхансер copia функционирует в качестве промотора приблизительно в 3 раза сильней, чем в обратной ориентации. Таким образом, энхансер copia может функционировать как слабый двусторонний промотор, индуцирующий формирование функциональной мРНК, на матрице которой синтезируется люцифераза. Уровень транскриптов, иницируемых с энхансера copia и hsp70-промотора, был также сравнен с помощью обратной транскрипции РНК с последующей количественной ПЦР. В результате оказалось, что транскрипция с промотора всего лишь в 2-3 раза эффективней транскрипции с энхансера (рисунок 7Б). Таким образом, одна копия энхансера copia может запускать двусторонний синтез молекул РНК, пригодных для прохождения этапов трансляции, и на уровне, сопоставимом с базовой активностью hsp70-промотора.

Наиболее сильный инсулятор дрозофилы, состоящий из 12 сайтов связывания для белка Su(Hw), был найден в регуляторной области ретротранспозона МДГ4 [187-189]. В трансгенных линиях дрозофилы активность этого инсулятора зависит от взятых в исследование энхансеров и промоторов. Так, одна копия такого инсулятора полностью блокирует активность энхансеров гена yellow, но почти не влияет на активность энхансера гена white в трансгенных линиях дрозофилы [29, 190]. При трансфекции кольцевой плазмиды в S2-клетки дрозофилы было показано [38], что одна копия инсулятора из МДГ4, размещенная перед промотором репортерного гена снижает в 2 раза активность энхансера copia, встроенного с 3 -стороны гена. Двукратное снижение транскрипции можно объяснить влиянием инсулятора как на активность энхансера, так и на рядом расположенный промотор. Для того чтобы определить, на активность какого элемента оказывает влияние инсулятор, была сделана серия конструкций, в которых энхансер был встроен в положении - 233 относительно старта транскрипции с hsp70 промоторе (рисунок 8). Энхансер был размещен в двух ориентациях – прямой (ed) и обратной (er). В трансфецированных Sg4-клетках уровень экспрессии репортерного гена не зависел от ориентации энхансера. Инсулятор МДГ4 (g) был встроен непосредственно перед энхансером либо в прямой либо в обратной ориентации. Таким образом, было получено 4 конструкции, в которых инсулятор и энхансер размещались в разных ориентациях друг относительно друга и промотора. Все тестируемые конструкции были трансфецированы в Sg4-клетки (рисунок 8). В результате анализа уровня экспрессии люциферазы оказалось, что в конструкциях, в которых энхансер был встроен в противоположной ориентации относительно промотора, присутствие инсулятора в любой ориентации не влияло или незначительно увеличивало уровень экспрессии репортерного гена. В тех случаях, когда энхансер был встроен в прямой ориентации, уровень экспрессии репортерного гена снижался примерно в 2 раза в присутствии инсулятора в любой ориентации. Таким образом, инсулятор может влиять на активность рядом расположенного энхансера, находящегося в непосредственной близости от промотора. В этом случае механизм влияния не связан с блокированием взаимодействия между энхансером и промотором. Наиболее вероятно, что такое ориентационно-зависимое ингибирование транскрипции связано с прямым взаимодействием друг с другом белков, связанных с инсулятором и энхансером.

Следующей задачей исследования стало тестирование влияния инсулятора на уровень экспрессии репортерного гена в положении между энхансером и промотором. Для этого была сделана конструкция, в которой инсулятор был встроен в положении - 233 относительно старта транскрипции hsp70-промотора (рисунок 8). Энхансер был встроен непосредственно перед инсулятором в прямой ориентации. Таким образом, инсулятор находится в положении между энхансером и промотором. В этом случае инсулятор снижал активность энхансера примерно в 4 раза. Таким образом, инсулятор, расположенный между энхансером и промотором, сильнее ингибирует транскрипцию репортерного гена, чем в положении выше энхансера. Этот результат согласуется с основным, энхансер-блокирующим, свойством инсуляторов, которое проявляется, когда инсулятор располагается между энхансером и промотором.