Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Гепатиты С и дельта являются актуальными проблемами для здравоохранения Российской Федерации в связи с высокими показателями иввалидизации и смертности в результате этих заболеваний и их последствий. В настоящее время в России умирает не менее 10.000 человек в год в результате заболеваний парентеральными гепатитами и их отдаленных последствий, и есть все основания ожидать роста этого показателя в дальнейшем (С.М.Клименко, 1997). Проблема гепатита А (ГА) актуальна в связи с высокими показателями заболеваемости. Согласно официально регистрируемым данным за период с 1995 по 2001 годы заболеваемость ГА в Российской Федерации находилась в пределах от 78,5 до 123,5 заболевших на 100.000 населения.
Одним из путей создания эффективных диагностических и
профилактических препаратов против вирусных инфекций является использование синтетических пептидов, моделирующих антигенные детерминанты белков вируса. Знание особенностей строения, предопределяющих активность и специфичность этих участков, позволяет более точно ориентироваться при поиске В-эпитопов в аминокислотной последовательности белка, а также формирует подходы к пониманию функционирования вирусов в живом организме.
Трудности анализа антигенных детерминант вируса гепатита А (ВГА) обусловлены их конформационной структурой. В связи с этим перспективным представляется использование более сложных нелинейных синтетических пептидов, в том числе и являющихся гетерогенными антигенами.
В настоящее время в клинической практике с целью диагностики ГС используются иммуноферментные тест-системы Ш и ГУ поколений, позволяющие вьшвлять антитела класса Ig G к ВГС. На стадии внедрения в практику здравоохранения России находятся тест-системы, позволяющие вьшвлять алгі-HCV класса Ig М. Однако эти тест-системы не позволяют оценить уровень иммунного ответа по отношению к отдельным белкам ВГС и к отдельным эпитопам этих белков. Вьшвление нуклеиновой кислоты вируса методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) весьма информативно при проведении эпидемиологических исследований, однако будучи отдельно взятым, этот метод недостаточно информативен при оценке течения заболевания у конкретного больного. Тяуи^ пКрдтг»^ ттптгепд к диагностике ГС в настоящее время принципиально
ктЩМЬИСМАЛЩиівІичіхкото
БИБЛИОТЕКА С-Петсрвург і ,_»
4 обследования больных гепатитом В (ГВ) например, которое носит гораздо более комплексный характер. Серологическое обследование больного ГВ -это по сути своей мониторинг различных маркеров, каждый из которых несёт свою информационную нагрузку (HBsAg, anti-НВсог Ig М, anti-HBcor Ig G, anti-HBs, HBeAg/anti-HBe). Предлагаемый нами комплексный подход к серологическому обследованию актуален для больных ГС не менее, чем для больных ГВ, прежде всего потому, что заболевание ГС значительно чаще переходит в хроническую форму, следовательно патологический процесс носит более сложный, более комплексный характер.
Применение пептидных моделей позволяет определять роль отдельных аминокислотных остатков в составе белков, соответствующих различным генотипам вируса гепатита С (ВГС), а также интерфероно-чувствительным и интерфероно-резистентным разновидностям одного и того же генотипа. Ряд авторов указывает на то, что выявление антител к отдельным антигенным детерминантам (белки и отдельные эпитопы) ВГС коррелирует с определенной фазой течения заболевания и позволяет оценить активность патологического процесса (А.Ю.Афанасьев с соавт., 1997; ЕА.Засильева, 1995; С.Н.Соринсон, 1997; Z.-X.7,hang et al., 1995). Однако такие исследования, как правило, либо ограничивались сопоставлением частоты выявления Ig G к core- и NS4-6ejrKaM, либо их титров у различных групп больных, либо проводилось аналогичное сравнительное исследование частоты выявления Ig G и их уровня к отдельным фрагментам из последовательности структурных белков ВГС. В ходе проведения нашего исследования была сопоставлена частота выявления антител (как класса Ig G, так и класса Ig М) и их уровня к отдельным фрагментам вирусных белков у различных групп больных. Было также проведено исследование спектра антител в динамике у больных ГС с различными исходами заболевания. Были использованы наиболее значимые с точки зрения поставленной задачи антигенные детерминанты вирусных белков, выявленные в процессе исследования.
Вирус гепатита дельта - дефектный инфекционный агент, являющийся причиной тяжелых, часто летальных форм острого и хронического гепатитов и цирроза печени. Инфекционность HDV связана с HBV-инфекцией и реализуется в виде супер или коинфекции с последним. Вирион HDV содержит одноцепочечную циркулярную РНК 1,75 кб, упакованную высокоосновным, фосфорилированным по остаткам серина нуклеокапсидным
5 белком - антигеном вируса гепатита дельта (HDAg). Оболочка HDV состоит из поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg). HDV присутствует в крови и ткани печени инфицированных.
Специфическая диагностика вирусного гепатита дельта является актуальной проблемой здравоохранения. Первоначально в соответствующих, диагностикумах использовался вирусный антиген, выделяемый из ткани печени умерших от FD. Более эффективным и безопасным является использование генноинженерных препаратов или синтетических пептидов, моделирующих иммунодоминантные эпитопы HDAg. Использование рекомбинантного HDAg имеет свои недостатки. Рекомбинантные белки состоят из целевого протеина и дополнительных полипептидов, из-за которых иммуноферментная реакция иногда.дает ложноположительпые результаты. Синтетические пептиды легче и дешевле очистить, чем генноинженерные препараты. Поэтому тест-системы на основе синтетических пептидов более специфичны и заслуживают разработки и внедрения.
HDV распространен во всем мире. Известны нуклеотидные
последовательности РНК HDV и аминокислотные последовательности HDAg,
полученные из различных географических регионов. В соответствии с
принятой классификацией, большинство таких последовательностей
принадлежит к первому типу HDV. Второй тип, наряду с первым, встречается в Азии. HDV третьего типа циркулирует в Южной Америке. Данные о генотипах HDV, циркулирующих на территории РФ очень ограничены и противоречивы.
По одним данным расшифрованная нуклеотидная последовательность генома российского изолята HDV наиболее близка к последовательностям молдавских и болгарского изолятов, относящихся к генотипу Ш. По другим -нуклеотидные последовательности геномов HDV, кодирующих С-кояцевую часть HDAg и циркулирующих в Северо-Западном регионе России, относятся к IA генотипу HDV.
В диссертации представлены результаты серотшшрования HDV, циркулирующего на территории России, с помощью синтетических пептидов, моделирующих аминокислотные последовательности иммунодоминантного и вариабельного участков HDAg, соответствующих трем известным типам HDV.
ЦЕЛЯМИ диссертационной работы являются: - исследование антигенной структуры белков вирусов гепатитов А, С и дельта с помощью пептидных моделей фрагментов аминокислотной последовательности соответствующих вирусных белков;
разработка тест-системы четвертого поколения для выявления anti-HCV;
разработка тест-системы для контроля спектра антител в динамике, что позволит выявлять антитела к различным эпигонам белков ВГС, и исследование особенностей сероконверсни антител к антигенным детерминантам структурньж и неструктурньж белков вируса гепатита С у больных с различными исходами острого гепатита С;
разработка модификации метода иммуноферментного анализа для выявления типоспецифических anti-HCNS4 антител у больньж гепатитом С;
разработка новьж иммуноферментньж тест-систем для диагностики гепатита D на основе синтетических пептидов;
оценка целесообразности использования гетерогенных тетрамерньж мультипептидных антигенов при разработке новьж тест-систем для выявления серологических маркёров ВГА.
Для достижения указанных целей были поставлены следующие ЗАДАЧИ:
1. На основании компьютерного анализа гидрофильности и рассчета
вторичной структуры аминокислотных последовательностей вирусных белков
выбрать участки с потенциальной антигенной активностью.
2. Установить оптимальные условия проведения иммуноферментного
анализа (ИФА) при использовании в качестве антигенов синтетических
пептидов различной длины и вариабельности, моделирующих эпигоны из
состава белков вирусов гепатитов А, С и дельта и провести анализ
антителосвязывающей способности синтезированных пептидов.
3. На основе полученных результатов выявить наиболее перспективные с точки зрения поставленньж целей пептидные фрагменты, моделирующие соответствующие участки аминокислотной последовательности вирусных белков.
4. Изучить спектр антител к разным группам антигенных детерминант структурньж и неструктурньж белков вируса гепатита С у больньж с различными клиническими особенностями гепатита С в остром периоде, периоде реконвалесценцни и при различных исходах заболевания.
7 Методами, позволяющими реализовать поставленные задачи, являются: моделирование консервативных иммунодоминантных, а также вариабельных тшюспецифических эпитопов вирусных белков с помощью синтетических пептидов;
иммуноферментное исследование антигенной активности пептидов с помощью сывороток больньж различными вирусными гепатитами;
метод множественного пептидного исследования (Multiple Peptide Assay (Z.-X. Zhang etal. 1995));
исследование методом иммуноферментного анализа (ИФА) корреляции между наличием того или иного спектра антител к различным вирусным белкам, представленным разными антигенными детерминантами и клипико-биохимическим вариантом течения HCV-инфекщш;
общие клинические методики, тестирование серологического материала на маркёры гепатитов А, В, С и дельта;
биохимический анализ крови обследуемых больньж;
- статистическая обработка полученных данных, в том числе оценка
достоверности различий и вьиисление коэффициента корреляции будут
проводиться на основании критерия Сгьюдента.
-
Сопоставлена частота выявления anti-HCV антител (как класса Ig G, так и класса Ig М) и их уровня к отдельным фрагментам вирусных белков у различных групп больньж ГС.
-
Впервые проведено исследование спектра anti-HCV антител и их уровня в динамике заболевания у больньж ГС с различными исходами. Для этого были выявлены и использованы наиболее значимые с точки зрения поставленной задачи антигенные детерминанты вирусных белков.
3. Новые иммуноферментные тест-системы для диагностики гепатита D
разработаны на основе синтетических пептидов.
4. В процессе проведения исследования серологического материала,
полученного от больньж ГА, впервые бьши использованы гетерогенные
тетрамерные мультипептидные антигены.