Введение к работе
Актуальность работы. В настоящее время в связи с увеличением продолжительности жизни людей одной из самых злободневных и волнующих проблем, стоящих перед человечеством, становится проблема развития ряда комплексных заболеваний, таких как онкологические, нейродегенеративные и аутоиммунные заболевания. Многие из этих заболеваний связаны с нарушениями в работе протеасомной системы. Это неудивительно если учесть тот факт, что практически все внутриклеточные процессы, включая регуляцию клеточного цикла, апоптоз, регуляцию экспрессии генов, старение, окислительный стресс, презентацию антигенов, находятся под ее контролем. Основные ингибиторы протеасомной системы, применяемые в качестве терапевтических препаратов в наши дни, обладают низкой селективностью и высокой токсичностью, так как ингибируют конститутивную протеасому, присутствующую во всех клетках организма, вызывая тем самым нарушения в функционировании здоровых клеток. Использование в качестве терапевтических препаратов селективных ингибиторов отдельных каталитических субъединиц иммунопротеасомы позволит решить проблему токсичности, поскольку данный тип протеасомы постоянно присутствует только в органах иммунной системы.
Малые интерферирующие РНК (siPHK) широко используются для подавления экспрессии терапевтически значимых генов. Данный тип ингибиторов вызывает эффективную и селективную деградацию мРНК практически любого гена мишени и обладает низкой токсичностью. В связи с этим использование siPHK для регулирования экспрессии генов индуцибельных субъединиц иммунопротеасомы является перспективным подходом в поиске новых лекарственных препаратов. Однако для эффективного лечения комплексных заболеваний ингибирование экспрессии одного гена является недостаточным. Таким образом, исследования, направленные на поиск нового типа индукторов РНК интерференции, способного одновременно подавлять экспрессию нескольких генов мишеней, являются актуальными.
Целью данного исследования является создание нового типа
комбинированных индукторов РНК интерференции, способных эффективно
подавлять экспрессию нескольких каталитических субъединиц
иммунопротеасомы и гена множественной лекарственной устойчивости MDR1.
В ходе исследования решались следующие задачи:
-
Разработать на основе siPHK ингибиторы экспрессии индуцибельных субъединиц иммунопротеасомы LMP2, LMP7 и MECL1 и исследовать влияние химических модификаций и модификаций структуры дуплекса на их интерферирующую активность, длительность ингибирующего действия и способность проникать в клетки.
-
Получить ингибиторы экспрессии индуцибельных субъединиц иммунопротеасомы LMP2, LMP7 и MECL1 на основе shPHK, экспрессирующихся рекомбинантным лентивирусом и сравнить эффективность и длительность подавления экспрессии генов-мишеней с аналогичными ингибиторами на основе siPHK.
3.
4.
Сконструировать на основе селективно-модифицированных siPHK, ингибиторы экспрессии гена MDR1, с различной длиной дуплекса (42 и 63 п.н.) и исследовать механизм их интерферирующего действия и возможность внутриклеточного процессинга Дайсером.
Сконструировать комбинированные мультимерные селективно-модифицированные интерферирующие РНК, направленные на подавление экспрессии трех разных генов и определить эффективность и механизм их действия.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Разработаны высокоэффективные ингибиторы экспрессии индуцибельных субъединиц иммунопротеасомы LMP2, LMP7 и MECL1 на основе селективно 2'-0-метил-модифицированных siPHK, их липофильные производные способны проникать в клетки без трансфекционных агентов и подавлять экспрессию генов-мишеней.
-
На основе селективно-модифицированной анти-MDRl-siPHK получен новый тип индукторов РНК интерференции - тримерная siPHK (tsiPHK), способная эффективно и длительно подавлять экспрессию гена-мишени, не вызывающая индукции интерферонового ответа в клетках и действующая по Дайсер-независимому механизму.
-
Разработан новый тип комбинированных индукторов РНК интерференции длиной 63 п.н. (tsiCombi), способный независимо подавлять экспрессию трех генов мишеней с высокой эффективностью, действуя по Дайсер-зависимому механизму, и обладающий существенно более высокой эффективностью по сравнению с каноническими siPHK, направленными к тем же последовательностям-мишеням.
Научная новизна. В данной работе впервые разработан новый тип комбинированных индукторов РНК интерференции, способный эффективно подавлять экспрессию трех генов-мишеней (tsiCombi). Созданный tsiCombi не вызывает неспецифического иммунного ответа и эффективно процессируется на короткие полностью функциональные мономеры, способные длительно подавлять экспрессию нескольких генов.
Теоретическая и практическая значимость. В данном исследовании разработана селективно-модифицированная комбинированная siPHK длиной 63 п.н., способная эффективно подавлять экспрессию трех целевых генов - tsiCombi. siPHK, направленные одновременно на несколько генов-мишеней имеют большие преимущества в лечении ряда сложных заболеваний, таких как, онкологические, аутоиммунные, нейродегенераивные заболевания, где ингибирование экспрессии одного гена является недостаточным. Поскольку многие из этих заболеваний связанны с нарушениями в работе иммунопротеасомы, мономеры в составе tsiCombi направлены на подавление экспрессии каталитических субъединиц иммунопротеасомы.
Полученные результаты демонстрируют, что ограниченное введение 2'-O-метильных модификаций в состав tsiCombi способно эффективно подавлять развитие интерферонового ответа и не мешает процессингу длинных siPHK. Расщепление tsiCombi на короткие мономеры, обеспечивает длительное и эффективное ингибирование трех генов мишеней в течение 120 часов после трансфекции.
Созданный нами новый тип комбинированных индукторов РНК интерференции ранее не был описан в литературе и имеет широкую практическую значимость, поскольку обладает более высокой специфичностью и низкой токсичностью по сравнению с другими используемыми в настоящее время селективными ингибиторами иммунопротеасомы и поэтому может быть использован для создания новых терапевтических препаратов в противоопухолевой терапии. Более того, используя разработанный нами принцип построения длинных siPHK, можно создать мощные индукторы РНК интерференции направленные на подавление экспрессии любых комбинаций генов-мишеней
Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликованы 3 статьи в журналах : FEBS letters, Biochimie и NNNA, а также глава в книге «RNA interference» INTECH. Материалы диссертации были представлены на международных конференциях XXI Round Table on Chemical Biology of Nucleic Acids „Chemical Biology of Nucleic Acids" (Poznan, Poland, 2014), VII International Meeting «From Molecular to Cellular Events in Human Pathologies» (Riga, Latvia, 2014).
Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 123 страницах, содержит 32 рисунка, 5 таблиц. Библиография включает 201 литературный источник.