Введение к работе
Актуальность проблемы, В семейства флавивирусов, насчитывающем более 60 представителей, переносимых комарами и клещами, имеется немало возбудителей серьезных заболеваний, таких как лихорадки, энцефалиты, геморрагические лихорадки. Многие деоятки тысяч людей ежегодно болеют флавивируонымя инфекциями (Vonstii, 1986). Наиболее важными среди них являются: клещевой энцефалит (КЗ), широко распространенный б умеренной поясе Евразии, желтая лихорадка (ИЛ) - в экваториальном и субэкваториальном поясах планеты, лихорадка Денге -в тропиках, японски* энцефалит (ЯЭ) - в Восточной, Юго-Восточной и Южной Азии, лихорадка Западного Пила (ЗН) - в Северной Африке, Юкной Европе, на Ближнем Востоке и з Средней Азии, энцефалит Сен-Луи (ЭСЛ) - в Северной Америке, энцефалит долини Муррвя (ЭДМ) - в Австралии.
Надежный метод индикации $игавнвирусов необходим для проведения ранне! диагностики флававирусных заболеваний, определения вируоофорнооти переносчиков фківивирусов, исследовании диких животных. Среди существующих методов индикация флавиввруоов воэ большее распространение получает ишунофер-ментный анализ ДОА). Альтернативой ему мог оа стать метод молекулярной гиСридизации нуклеиновых киолот ШЇПО, не уступающий Шк по чувствительности и скорости получения результатов я дегеютругашй непосредственно вирусный ГЄНЄТИ-ческий материал в исследуемых образцах.
Большую проблему представляет идентификация вируоов. Большинство фпавивирусоз входит в состав нескольких антигенных групп, внутри которых вирусы трудно дифференцировать благодаря наличии существенных антигенных перекрестов между ними. Многие серологические тесты не различают близкородотвен-ные ВИДЫ флавивируоов (Calisher et si., 1989; Stephenson et, al., 1989), Самым належним тестом, как а десятки лат назад, остается реакция нейтрализации (РН), гребущая боль-лих затрат времени и труда. Метод МГНК очань специфичен, особенно при использовании олигонуклеотидннх зондов, сяособнюс выявлять тонкие различия в геномах иПаманин и др., TS9I; Wallace e,t чі., 1979), вследствие чего он представляется пзрспективнш
для быстрой и надежной идентификации флавивируеов.
Ранее метод '.ИНК с явяользованием пяазмидных зондов был применен для икдакаши вируса КЭ в клэаах и клинических образцах (Плетнев и др., J985} ІІивднко и др., 1989; Буковская и др., 1990), вирусов грушщ Денге в культуре клеток (гзэап, v/richt, 1987), а используя олитонуклеотидныв зонды, изучали штаымовнв различия вирусов КЭ и Дэягв 2 (Шаманил и др., 1991; г.вгаоіиюг at оі.,К86). Автори отмечали высокую специфичность МГНК, но не использовали этот метод для идентификации штаммов флавявирусов.
Цель и задачи лоследрванияг, Целью работы бнло создание видо- и грудпосявцифичных зондов, исследование возможности их дршешшя в ИНК для индикации к идентификации флавкви-руоов.
Б задачи исследования вхопдло!
-
Проведение сравнительного анализа Структур гэномов флавявирусов, выбор учаотков геномов, специфичных для определен-ннх видов и групп флавизирусов, получение синтетических оли-гонуклеотвдных зондов, комплементарных этим участкам.
-
Изучение специфичности полученных: олигонуклеотиднкх зон-" дов, формирование навора зондов для идентификации 9 видов флавивируоов, относящихся к 4 основным антигенным группам (группам КЭ, ЯЗ. Ы и Денге).
-
Оптимизация метода ЖЇЇК для индикации и идентификация флавивируеов.
А. Апробация МГНК для иядикагда флавивируеов в различных пробах (клещах, комарах, млекопитающих, крови больных) к идентификации штаммов флавивируеов, а такяе сравнение вффад» тивнооги применения мгак для этих деле! с еффвктивносгью наиболее широко используемых для этих целей серологических методов.
Научная новизна работы. Вперввв получены синтетические олигонуклеотиднне зонды к большому числу флавивируеов не основе анализа структур их геномов; впервые о целью индикации и идентификации флавивируеов получен и применен набор синтетических виде- я грушзоспецяфичннх олвгонуклеотивннх зондов; впервые разработан метод идентификации флавивируеов на родове ИГЕК; впервые для индикации.вируса КЭ применен нерадаоак-
тивномаченныи зонд; впервые проведена индикация флавпвирусов методом МІЖ в пробах or позвоночных животных из природних очагов флавивирусннх инфекций и вируса йгекой геморрагической лихорадки ЮГЛ) в крови больных.
Практическая ценность работы. В результате проведенных исследований разработаны и адаптированы для практического применения методы индикации и идентификация флавпвирусов, оо-нованные на МГНК; получен набор зондов, позволяющий идентифицировать штаммы основных представителей флавивирусов; произведена апрбапдя шгазмидных и олигонуклеогидных зондов для индикации флавпвирусов в различии источниках: клещах, комарах, шекопитающих, клиническом материале и идентификации штаммов флавивирусов, выделенных из различных источников.
Практическая реализация работы. На основе данных, полученных в ходе исследований, была подана заявка на изобретение "Шбор для идентификация флавивирусов", положительное решение № 4892388/13 - I202I8 от 7 января 1992 г.
Ло итогам работы было подготовлено информационное пиоь-мо "Индикация и идентификация флавивирусов методом молекулярное гибридизации нуклеиновых кислот о синтетическими оли-гонуклаогвднша зондами", утвержденное ре-пением ПНЦ № 3 от 20 апреля 1992 г.
В Государственно* коллекции вирусов были депонированы 9 щтаммов флавивирусов.
^ппобапиятаботы. Результаты исследования доложены на:
- Всесоюзном симпозиуме "Современные проблемы эпидемио
логии, диагностики и профилактики клещевого энцефалита"
{т. Иркутск, IS90 г.);
Всесоюзной ошпозиуне "Арбовирусы и арбовируснне инфекции" tnoc. Лыткино Московской обл., 1991 г.);
Международном симпозиуме "Синтетические олигонуклео-тида: проблемы и перспективы практического применения"
(г. Москва, 1991 г.).
Публикация результатов исследований. Основные положения диссертации отражены в 9 печатных работах.
На защиту выносятся следующие положения: I. ОлЕгонуклеотиднна зонды обладают высокой специфичностью, позволяющей дифференцировать близкородственные виды флавивирусов. На основе анализа структур геномов можно получать
оингетические олигонуклеотицние зонди о разной специфичностью: віщо- и группоснешфи'чные,
-
Сформирован и апробироаан набор олигонуклеотидннх зондов, полученных к 9 видам флавивирусов, для идентификация штаммов флавивирусов.
-
Чувствительность и специфичность МІЖ о использованием плазмидных зондов к вирусу КЭ позволяет проводить индикацию вирусов комплекса КЭ в полевом и клиническом материале о одновременной идентификацией штамлов до антигэююй группы» Более высокая специфичность МІЖ с олигонуклеотидными зондами позволяет проводить идентификацию флавивирусов до вида, но при индикации требуется.предварительное биологическое накопление вируса.
Объем и отруктура диссатл'апмц Диссертационная работа . состоит из введения, обзора литературы, четырех глав собственных исследований, обсуждения, выводов. Работа изложена на 118 страницах машинописного текста і иллюстрирована ІБ таблицами и 4 рисунками. Библиографический указатель 1на 2S страницах) содержит 213 источников, из которых 61 отечественный и Т52 зарубежше.