Введение к работе
Актуальность проблемы. Одним из наиболее опасных и широко распространяющихся в последнее время вирусных заболеваний, связанных с преимущественным поражением иммунной системы организма, является инфекция, вызываемая вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ-инфекция) и получившая название СПИД (синдром приобретенного иммунодефицита человека). Со времении появления этого заболевания в 1981 году количество заболевших оценивается на середину 1993 года цифрой 2,1 млн человек, а общее количество инфицированных превышает 10 млн человек (Norton, 1993).
Открытый в 1983 году вирус иммунодефицита человека, относящийся к семейству ретровирусов, является этиологическим агентом СПИД (Barre-Slnoussi et al., 1983; Popovic et al.,1984). Изучение чувствительности различных популяций лимфоцитов показало, что специфической мишенью для этого вируса служат Т-хелперы (Klatzman et al., 1984; Dalgleish et al.,1984).
Основные проявления патогенеза при ВИЧ-инфекции связываются с гибелью популяции Т-хелперов, в которых происходит размножение ВИЧ (Klatzmann et al.,1984, Mo Dougal et al., 1985). Рецептором для ВИЧ является Т4 рецептор лимфоцитов (или СД4 антиген) - белок с молекулярной массой 55 кД (Sattentau et al.,1984, Lasky et al.,1987), с которым взаимодействуют поверхностные гликопротеиды (gpl20) вируса. Было обнаружено, что моноциты/макрофаги также могут быть инфицированы ВИЧ (Gartner et al.,1986, Growe et al.,1987). Подробное изучение роли клеток макрофагального ряда в инфекционном процессе при ВИЧ-инфекции еще не закончено, но исследователи выявили по крайней мере одну значительную особенность: в отличие от изменений, которые происходят с Т-хелперами, изменение числа моноцитов периферической крови, их фенотипа и функций минимальны даже на поздних стадиях инфекции (Gendelman et al., 1989, Bender et al.,1988). Предполагается, что именно участие макрофагов в инфекционном процессе объясняет многие особенности клинической картины при СПИДе, в частности, наличие длительного латентного периода (до нескольких лет) от момента инфицирования до развития клинических проявлений заболевания (Meltzer at al., 1990).
В последние годы внимание исследователей направлено на изучение механизмов латентности и ее активации при ВИЧ-инфекции.
- 2 -Причины, вызывающие переход от латентной к продуктивной ВИЧ-инфекции могут быть разнообразны - инфицирование другими ретрови-русами, например, HTLV-1, цитомегаловирусом, воздействие различных химических соединений. Исследованиями ряда авторов установлено, что антигенная или митогенная стимуляция лимфоцитов приводят к клеточной пролиферации и активации транскрипции и репликации ВИЧ (Bednarik & Folks,1992, Matsuyama,1991). Крайне важным представляется изучение особенностей активации ВИЧ-инфекции. Знание этих,механизмов может обеспечить как прогноз развития заболевания так и создание эффективных средств борьбы.
Для постановки диагноза ВИЧ-инфекция используются иммунологические методы определения содержания в сыворотке пациента антител к белкам ВИЧ-1. При этом на первом этапе проводится первичный скрининг с использованием в основном иммуноферментных тест-систем на основе лизата вирусных белков, рекомбинантнах белков вируса или пептидов-фрагментов белков ВИЧ (Хаитов и Игнатьева, 1992). Подтверждается диагноз с применением иммунофер-ментной тест-системы для определения антител к индивидуальным белкам вируса - иммуноблот, изготавливаемой на основе лизата вирусных белков иммобилизованного на нитроцеллюлозкые полоски. Хотя такая комбинация тестов считается достаточной для установления диагноза, несомненный интерес представляет выявление вирусного антигена. Тест на вирусный антиген служит дополнительным тестом для лабораторного диагноза асимптоматической ВИЧ-инфекции в ранний период, когда антитела еще не выявляются, а также помогает определить вероятность прогрессирования инфекции у ВИЧ-инфицированных пациентов (Hjelle & Busch.1989, Анджапаридзе с со-авт., 1991).
В связи с появлением и распространением СПИДа начался активный поиск препаратов, обладающих выраженным анти-ВИЧ действием. Одной из основных проблем при проведении этих исследований послужило отсутствие адекватной модели этого инфекционного заболевания на лабораторных животных. Это в значительной степени затрудняет иссследования как по поиску эффективных противовирусных препаратов, так и вакцины. Общепринятой моделью служат перевиваемые культуры Т-хелперов, инфицированные эталонными штаммами ВИЧ. При использовании таких модельных систем была выявлена анти-ВИЧ активность сурамина (Mitsuya Н., et al., 1984), азидоти-мидина (Mitsuya Н., et al.,1985), - глицирризиновой кислоты (Ito
1,1988), рибавирина (Williams I.G., 1989), ауринтрикарбоновой сислоты (Balzarini J.,, et al.,1989) и многих других препаратов. Гем не менее, использование только одной модели, очевидно, не юзволяет проводить полноценный отбор соединений - кандидатов в іекарственньїе препараты, поскольку особенности ВИЧ-инфекции в зазличных клетках-мишенях значительно отличаются. Исходя из это-"о, нами были предприняты попытки оценить перспективность приме-іения различных моделей и методов оценки для отбора перспективам ингибиторов ВИЧ-инфекции.
Наиболее эффективные анти-ВКЧ препараты относятся к группе гуклеотидных аналогов, являющихся ингибиторами вирусного фермен-?а-обратной транскриптазы. Один из них - азидотимидин (AZT) -!тал первым препаратом, нашедшим применение в медицинской прак-:ике для лечения СПИД. Обладая высокой эффективностью ингибиро-іания ВИЧ в культуре клеток , азидотимидин, тем-не менее, имеет >яд недостатков, ограничивающих его применение в клинической ірактике: он токсичен (Richman et al.,1987), обладает низкой эффективностью ингибирования репродукции ВИЧ в макрофагах (Crowe it al.,1989), длительное применение азидотимидина приводит к по-івлению AZT-устойчивых штаммов ВИЧ (Larder et al.,1989. Larder ind Kemp,1989). Более того, результаты расширенных клинических іспьгааний этого препарата в клинике показали, что его применение [е приводит к продлению жизни больных СПИДом (Dickson & laoilwain, 1993). Поэтому актуальным представляется поиск новых інгибиторов размножения ВИЧ.
Развитие исследований по изучению молекулярной биологии ВИЧ делало возможным применение самых современных подходов для раэ-іаботки средств лечения заболевания, вызываемого этим вирусом. >дин из таких подходов основан на использовании для ингибирова-:ия репродукции ' вируса синтетических олигодезоксинуклеотидов, шлементарных консервативным участкам вирусной мРНК (Zamecnik t al.,1986). Предполагается, что использование таких антисмыс-:овых олигонуклеотидов приводит к блокированию трансляции вирусах белков. К настоящему времени в литературе описано ингибиро-ание размножения ВИЧ в культуре клеток олигонуклеотидами, комп-ементарными различным функциональным участкам РНК вируса Zamecnik et al., 1986; Matsukura et al., 1987, 1989; Agrawal et ,1., 1988, 1989;). Тем не менее, поиск новых, более эффективных отношении ВИЧ антисмысловых олигонуклеотидов и разработка на
- 4 -их основе лекарственных средств остается актуальным. Более того, при использовании модифицированных антисмысловых олигонуклеоти-дов, содержащих реакционноактивные группировки, которые обеспечат повреждение провирусной ДНК, возможно излечение этого заболевания.
Другим методом направленного конструирования препаратов-ингибиторов ВИЧ-инфекции служит использование пептидов-фрагментов вирусных белков, соответствующих функционально-значимым районам и блокирующих связывание вируса с клетками-мишенями или сборку вирусных частиц.
Следует подчеркнуть, что в настоящее время не существует такого подхода к созданию лекарственных препаратов для лечения СПИД, который мог бы претендовать на монополию. Скорее всего, как и для других инфекционных заболеваний, эффективная терапия ВИЧ-инфекции будет заключаться в применении системного комплексного подхода, когда в зависимости от стадии или формы проявления болезни будут использоваться лекарственные средства с разными механизмами действия и их различные комбинации.
Исходя из этого, нами проводился поиск новых перспективных анти-ВИЧ агентов среди уже известных ингибиторов ВИЧ-инфекции (3-глицирризиновая кислота) путем получения их различных химических производных, среди химических препаратов, для которых показана противовирусная активность в отношении других вирусов, а также оценивали возможность их совместного применения.
Настоящая работа выполнялась в рамках исследований по государственной научно-технической программе "Борьба с наиболее распространенными заболеваниями" по проблеме СПИД темы 102, 310, 312, 389, 418, по программе "Ген-направленные препараты".
Цели и задачи исследования. Основной целью настоящей работы было исследование особенностей репродукции ВИЧ на различных клетках-мишенях (Т-хелперах и моноцитах) и разработка технологии получения на основе изолированных и охарактеризованных штаммов ВИЧ антигенов и антител, пригодных для исследования иммунологических вирусспецифических маркеров этой инфекции. Кроме того, планировались исследования по поиску эффективных ингибиторов репродукции ВИЧ.
Основными задачами исследования явилось:
-разработка технологии получения полноценного очищенного
- 5 -вирусного антигена, пригодного для изготовления диагностических иммуноферментных тест-систем для детекции антител к белкам ВИЧ;
-разработка иммуноферментных тест-систем для детекции вирусного антигена ВИЧ-І и ВИЧ-2;
-изучение особенностей репродукции ВИЧ на различных клетках-мишенях (Т-хелперах и моноцитах/макрофагах) и активаторов репродукции ВИЧ;
-проведение оценки анти-ВИЧ активности ранее известных препаратов, обладающих противовирусным эффектом;
- -изучение перспективы применения в качестве специфических ингибиторов ВИЧ-инфекции пептидов-фрагментов белков ВИЧ, антис-мысловых олигодезоксинуклеотидов и производных азидотимидина.-
Научная новизна работы, В результате выполнения настоящих исследований был получен ряд новых результатов, имеющих важное теоретическое и практическое значение.
Исследованы особенности репродукции ВИЧ в хронически-инфи-цированной культуре клеток моноцитов человека и-937.
Выделен высокопродуктивный штамм ВИЧ-І, пригодный для получения вирусного антигена для диагностических тест-систем. Определена первичная структура областей VI, V2 и V3 гена env этого штамма.
Выявлены новые ингибиторы репродукции ВИЧ среди производных
глицирризиновой кислоты, эффективно ингибирующих размножение
ВИЧ-І как в культуре _-лимфоцитов, так и в моноцитарной клеточ
ной системе. Впервые установлена анти-ВИЧ активность нового
класса химических соединений - сложных эфиров изоборнеола
(2, 9-диметил-За, 4, 9, 9а-тетрагидрофуро-[ 2, 3-ь] -хиноксалин- 3
карбоновой кислоты - энциклан). Впервые показана высокая проти
вовирусная активность (I s 100-500) и специфичность анти-ВИЧ
действия олигонуклеотидов последовательности
pGcatcaagcagctccaggca (РМ-20), комплементарной 'области начала трансляции открытой рамки считьшания на (+) цепи ДНК ВИЧ-І, и последовательности pTGCCTGGAGCTGCTTGATGC (МР-20), комплементарной олигонуклеотиду РМ-20. Показано, что энциклан и глицирам не является антагонистами азидотимидина.
^Основные положения, выносимые на защиту: I. Хронически инфицированная ВИЧ-Глиния перевиваемых моно-
цитов человека ГКВ-4005 продуцирует инфекционные вирусные частицы в течение длительного непрерывного культивирования (более 20С пассажей) без подсева неинфицированных клеток. Предложенный способ сокультивирования хронически инфицированной ВИЧ-І культурь клеток моноцитов (ГКВ 4005) и Т4-лимфоцитов человека (МТ-4) позволяет получать вирусный антиген с полным набором вирусспецифи-ческих белков.
-
Изолирований высокопродуктивный штамм ВИЧ-І охарактеризован по культуральным свойствам и определена первичная структура областей vl, V2 и V3 гена env этого штамма. На основе этого штамма разработана технология получения очищенного вирусного антигена, пригодного для использования в диагностических тест-системах.
-
Разработаннные диагностические тест-системы для детекцш; вирусных антигенов ВДЧ-І (суммарного и р24) и ВИЧ-2 с чувствительностью до 50пг/мл позволяют проводить определение вирусногс антигена в клинических образцах. Выбран оптимальный метод тестирования вирусного антигена в составе иммунного комплекса. Анализ клинических образцов от ВИЧ-инфицированных пациентов с использованием тест-системы для детекции антигена р24 показал, что і свободном состоянии антиген р24 присутствует в 5 процентах исследованных образцов и в 31 процентах в составе иммунных комплексов.
-
Оценку анти-ВИЧ активности тестируемых соединений следует проводить с использованием как лервично-инфицированньо культур Т-хелперов, так и хронически-инфицированных культур клеток моноцитов с определением уровня защиты клеток по жизнеспособности и уровня подавления синтеза вирусных белков.
-
Олигонуклеотиды РМ-20 - pGCATCAAGCAGCTCCAGGCA , комплементарный области начала трансляции открытой рамки считывания нг (+) цепи ДНК ВИЧ-І, и МР-20 - pTGCCTGGAGCTGCTTGATGC, комплементарный олигонуклеотиду РМ-20, оказывают выраженный анти-ВИЧ эффект на модели ВИЧ-инфицированных клеток МТ-4 (is >100 и >500, соответственно). Присоединение к 5'-концевым фосфатам олигонук-леотидов алифатических аминов или остатков холестерина приводи: к существенному повышению эффективности ингибированля ими репродукции ВИЧ.
-
Пептид (426-439 env) - NMWQEVGKAMYAPP, соответствующиі сайту связывания поверхностного белка ВИЧ gpI20 с СД4 рецепторої
- 7 -обладает анти-ВИЧ активностью.
-
5' -фсфонаты азидотимидина с различными типами остатков модифицированного фосфата и 5' -фосфонатов фтортимидина обладают более низкой токсичностью для неинфицированных клеток, чем ази-дотимидин. Наиболее выраженным ингибирущим действием обладает 5' -карбоксифосфонат азидотимидина в культуре клеток МТ-4, инфицированной ВИЧ-І. На моделях первичной культуры нестимулирован-ных моноцитов периферической крови, инфицированных ВИЧ-І и в культурах клеток перевиваемых линий Т-хелперов, хронически инфицированных ВИЧ-І, ингибирующий эффект азидотимидина и его производных существенно снижен.
-
Производные глицирризиновой кислоты эффективно ингиби-рукгг репродукцию ВИЧ-І в хронически инфицированной ВИЧ-І культуре клеток моноцитов человека. Анти-ВИЧ активностью обладают гли-копептиды и амиды глицирризиновой кислоты. Сложные эфиры изо-борнеола (энциклан) являются ингибиторами репродукции как ВИЧ-І, так и ВИЧ-2 в культуре клеток - (is - 406 и 10, соответственно). Энциклан и глицирам не являются антагонистами азидотимидина и могут быть использованы для комбинационной терапии ВИЧ-инфекции.
-
2, 3,7, 8-тетрахлордибензо-пара-диоксин является активатором ВИЧ-инфекции на модели клеток МТ-4, инфицированных ВИЧ-І.
Практическая ценность работы. Разработана технология культивирования и очистки вирусного антигена для использования в им-муноферментных диагностических тест-системах для определения антител к белкам ВИЧ как для первичного скрининга, так и для проведения верификации (иммуноблот). В настоящее время эта технология внедрена в промышленное производство.
Разработаны тест-системы для детекции антигенов ВИЧ-І, ВИЧ-2 и антигена р-24 ВИЧ-І. С помощью этих тест-систем проведен анализ клинических .образцов от ВИЧ-инфицированных в нашей стране.
Подготовлены "Методические рекомендации по выделению вирусов иммунодефицита человека от ВИЧ-инфицированных лиц и больных СПИДом" (совместно с Д Н. Носиком, Л Е Калийной, А. Е Злобиным, И. А. Киселевой, М. С. Бочковой, В. В. Покровским), утвержденные Ученым советом Института вирусологии им. Д И. Ивановского 17. 05.1991 и "Временные требования к линиям клеток-продуцкнтов вируса иммунодефицита человека, рекомендуемых для производства (совместно с.
Государственным научно-исследовательским институтом стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л. А. Тара-севича, Московским научно-исследовательским институтом вирусных препаратов, Институтом вирусологии им. Д, И. Ивановского РА1ЛН), ут-вержденнные Минздравом СССР 25. 04.1988г. N 28-6/д.
Апробация работы. Основные экспериментальные материалы и положения диссертации были представлены на V, VI, VIII, IX,
международных конференциях поо СПИДу (Монреаль, Сан-Франциско, Амстердам, Берлин) Всесоюзной конференции "Химия природных и низкомолекулярных биорегуляторов" (Ереван, 1990), Международной конференции по терапии нуклеиновыми кислотами "international Conference on Nucleic Acid Therapeutics" (Флорида, США, 1991), IX Всесоюзном симпозиуме "Целенаправленное изыскание лекарственных средств" (Юрмала, 1991), Международной конференции "Молеку-лярно-биологические аспекты диагностики и терапии СПИД" "International conference on molecular biology aspects of diagnostics and therapy of AIDS" (Новосибирск, Академгородок, 1991), IV Всесоюзном симпозиуме "Изучение и использование солодки в СССР' (Алма-Ата, 1991), I Съезде иммунологов России (Новосибирск, 1992), на международной конференции "Antlsensa oligonucleotides and rl bonucl eases H" (Аркахон, Франция, 1992), на I и 2 международных конференциях "СЛВД рак. и рэтровирусы человека" (Санкт-Петербург, 1992,1993) и ряде других кэждународных конференциях.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 55; ра бот.
Основные результаты, изложенные в диссертации, получены в соавторстве с сотрудниками НИИ молекулярной биологии НПО "Вектор": Плясуковой 0. А., Мамаевой 0. А., Федюк Н. В., Куляндиньм С. А., Киселевым Н. Н., Гашниковой II М., Красных Е Н., Черных
A. И., Ястребовой 0. Н., Чаплыгиной С. Р., Егоричевой И. Н., Не
чаевым id С., Блиновым R №, Коноваловым Е Е , Локтевым Е Б.,
Института вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН: Рудневой И.
А., Карамовым Э. Е , Гараевым М. М., Урысаевым Л. R ; Новоси
бирского института биоорганической химии СО РАН: Власовым
B. R, Свинарчуком Ф. П., Конввцок Д. А.; Института орга-
нической химии Башкирского научного центра РАН: Толетиковым Г.А., Балтикой Л.А., Мурашовым Ю.И., Русаковым И.А.; Уральского политехнического института: Чупахиным О.Н., Чарушиным В.Н., По-низовским М.Г.; Института гриппа: Киселевым О.И. Своим коллегам и соавторам проведенных исследований автор приносит искреннюю благодарность.