Введение к работе
Актуальность проблемы
"' ' В 1981 г. в СШЛ были зафиксированы первые случаи нового, ранее не известного заболевания, позднее названного синдромом приобретенного иммунодефицита человека (СПИД).
Отсутствие эффективных средств профилактики и сам характер заболевания, имеющего длительный скрытый период, во время которого возможна передача этиологического агента СПИД - вируса иммунодефицита человека - от инфицированного лица другим людям, привели к широкому распространению этой болезни, которая зафиксирована сейчас в 157 странах. По оценке Всемирной Организации Здравоохранения, на сегодняшний день в мире насчитывается до 8 млн. инфицированных ВИЧ, число больных СПИД в ближайшие годы может достичь 1 млн. человек.
Важной мерой ограничения роста СПИД в мире является раннее и точное выявление вирусоносителей. Имеющиеся в настоящее время тест-системы для скрининга сывороток на наличие антител к ВИЧ обладают высокой чувствительностью, но большое число ложноположи-тельных результатов требует подтверждения данных первичного исследования в тестах второго уровня. Наибольшее распространение в качестве подтверждающего теста получил метод иммуноблотинга, однако и он не гарантирует абсолютной точности. ВОЗ рекомендует проводить серодиагностику СПИД несколькими независимыми методами и создание альтернативных иммуноблотингу экспертизных методов является важной задачей.
После идентификации ВИЧ в качестве нового ретровируса началось изучение ранее известных ингибиторов обратных транскриптаз в качестве средств химиотерапии СПИД. Важные результаты были получены при исследовании аналогов природных нуклеозидов. Наибольшее распространение в качестве средства для лечения СПИД получил ази-дотимидин. Этот препарат обладает высокой эффективностью в подавлении обратной транскриптазы ВИЧ, но не лишен недостатков, среди которых неос.одимо виделить высокую токсичность, прежде всего для клеток красного костного мозга'. Кроме того, от больных СПИД выделен ряд штаммов ВИЧ, устойчивых к действию азидотимидина, поэтому актуальной проблемой является разработка новых препаратов для химиотерапии СПИД.
ШМ!1.1 {.'ШШШ. исследования
Целью настоящей работы била разработка метода раднсіи.імуноп-
реципитации для серодиагностики СПИД, апробация этого метода на референс-панелях сывороток крови и в ходе сероэпидемиоюгических . исследований и изучение действия ряда химиопрепаратов в качестве ингибиторов репродукции ВИЧ.
3 связи с этим были поставлены следующие задачи:
1. Разработать экспертизный метод радиоиммунопреципитации с
использованием tlsl- и 5*S-меченого вькюкоочщенного антигена для
определения антител' к индивидуальным белкам ВИЧ-1 и ВИЧ-2. Опре
делить чувствительность и специфичность разработанного метода на
панели референс-сывороток и в ходе сероэпидемиологических иссле
дований.
-
Провести сравнительное изучение различных методов детекции антигена ВИЧ - определения обратнотранскриптазной активности, ELISA, непрямой иммунофлуоресценции. ,
-
Разработать клеточную модель для изучения действия противовирусных препаратов, изучить влияние ряда соединений на репродукцию ВИЧ.
Положения, выносимые на защиту
-
Разработан модифицированный метод радиоиммунопреципитации с использованием <г*1- и. ^S-меченого антигена для определения антител к индивидуальным белкам ВИЧ-1 и ВИЧ-2. '
-
При изучении панели референс-сывороток. и в ходе сероэпидемиологических исследований групп риска установлено, что с помощью модифицированного метода радиоиммунопреципитации удается повысить надежность выявления антител к ВИЧ по сравнению с имеющимися методами.
-
С помощью различных методов определения вируса изучены характеристики линий-продуцентов ВИЧ и разработана клеточная модель для скрининга анти-ВИЧ препаратов.
-
Изучено действие 2',3'-дидезоксинуклеозидов о (тимидина, аденозша, цитидина и гуанозина), их 5'-фосфитов и 5*-фосфитов 3'-азидо-2',3'-дидезоксинуклеозидов на репродукцию БИЧ. Показано,
ЧТО ' -:,'..
а) исследованные ' аналоги монофосфатов модифицированных нуклеозидов эффективно ингибируют репродукцию ВИЧ и обеспечивают высокую-, степень зашиты клеток'от. цитоиатического действия вирусной инфекции;. " ' . ' . ."_ -.-' .'.;, ' '. б) использование суммы аналогов .ч'етирм лриго,У>ы>:.нуклеози-
дов обеспечивает высокую антивирусную активность и низкий цито-токеический эффэкт.
Научная новизна и практическая ценность работы
В результате проведенных исследований разработаны модифицированные методы радиоишунопреципитации с использованием лгъ1- и ^З-меченых антигенов для определения антител к индивидуальным белкам ВИЧ-1 и ВИЧ-2. При исследовании контрольных положительных и отрицательных сывороток и в ходе сероэпидемиологических исследования показано, что чувствительность и специфичность разработанных модификаций РИП превышают аналогичные характеристики коммерческих тест-систем, основанных на методе иммуноблотинга.
Показано,.что дожноположительные и ложноотрицателъные результаты тестирования сывороток в различных подтверждающих диаг-ностикумах Имеют различную причину. Сделан вывод, что для надежного выявления инфицированности ВИЧ необходимо использование. нескольких альтернативных конфирмационных тестов.
Показано, что характер перекрестных реакций между антигенами ВИЧ-2 и антителами к ВИЧ-1 при использовании метода радиоиммуноп-реципитации отличается от такового, показанного ранее для иммуноблотинга. С одной стороны, это затрудняет дифференциальную диагностику ВИЧ-1 и ВИЧ-2 инфекций методом РИЛ, но, с другой стороны, позволяет не пропустить случаи ВИЧ-2 инфекции при исследовании сывороток на антитела к ВИЧ-1.
При изучении производных нуклеозидов (2'.З'-дидезоксинуклео-аидов и их 5'-фосфитов, а также 5'-фосфитов 3'-азидо-2',3'-дидез-оксинуклеозидов (тимидина, аденозина, гуанозина, цитидина)) методами Щк, обратнотранскриптазной реакции, рекламирования показано; что изученные соединения эффективно ингибируют репродукцию ВИЧ-1 в культуре клеток Щ-4. Применение б'-фосфитов позволяет снизить цитптоксичность препаратов и в ряде случаев повысить их антивирусную активность. Применение эквимолярной смеси четырех Б*-фосфитов азидонуклеоэидов позволяет повысить выживание клеток в инфицированной культуре по сравнению с отдельными препаратами.
Апробация работы
Основные результаты проведенных исследований были доложены
- 4 -на конкурсах молодых ученых Института вирусологии им. Д. И. Ивановского АШ СССР (1988, 1989 гг.), на 1-ой Республиканской конференции молодых ученых-медиков Литовской ССР (г.Каунас, 1988 г.), иа Республиканской конференции "Актуальные вопросы СПИД в Литовской ССР" (г.Каунас, 1988 г.), на III Всесоюзном совещании "Культивирование клеток человека и животных" (г. Пущино, 1990 г.), на Республиканской конференции "йэвые методы диагностики СЇОД и других вирусных и бактериальных инфекций в практике инфекционной и противоэпидемической службы" (УССР, г.Алушта, 1990 г.), на Всесоюзной школе-семинаре молодых ученых "Молекулярная биология и медицина" (Ленинград, 1990 г.).
Объем и структура работы