Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы
2.1. Механизмы фотосенсибилизации. Фотофизические и фотохимические характеристики фотосенсибилизаторов 9
2.2. Низкомолекулярные фотосенсибилизаторы 11
2.3. Генетически кодируемые фотосенсибилизаторы. MiniSOG
2.3.1. Получение генетически кодируемого ФС miniSOG 13
2.3.2. Кофактор MiniSOG - производное рибофлавина 14
2.3.3. Физико-химические характеристики MiniSOG 17
2.4. Механизм клеточной гибели при воздействии ФС на клетки 19
2.4.1. Апоптоз 20
2.4.1.1. Основные пути внутренней передачи сигнала в ответ на ФДТ 21
2.4.1.2. ФДТ-индуцируемый внутренний путь гибели клеток, независимый от каспаз...
2.4.2. Аутофагия 27
2.4.3. Некроз
2.5. Механизмы клеточной защиты 31
2.6. Нацеливание фотосенсибилизаторов на рецептор HER2/neu 32
2.7. Источники света, используемые для ФДТ, и апконвертирующие нанофосфоры 3. Материалы и методы 44
4. Результаты и обсуждение 58
4.1. Разработка генетически кодируемого иммунофотосенсибилизатора 4D5scFv-miniSOG и характеристика его функциональных свойств 58
4.1.1. Экспрессия, выделение и очистка рекомбинантного белка 4D5scFv-miniSOG 58
4.1.2 Характеристика функциональных свойств 4D5scFv-miniSOG 60
4.1.2.1 Связывание с рецептором HER2/neu - иммунохимический метод
4.1.2.2 Спектральные свойства 4D5scFv-miniSOG 61
4.1.2.3 Специфичность связывания с HER2/neu на клетках 61
4.1.2.4 Конкурентное ингибирование 62
4.1.2.5 Внутриклеточная локализация 4D5scFv-miniSOG 63
4.2. Изучение фотоцитотоксичности полученного белка на линии опухолевых клеток при облучении синим светом 66
4.2.1 Определение фотоцитотоксичности 4D5scFv-miniSOG in vitro 66
4.2.2 Сочетанное действие 4D5scFv-miniSOG и таксола 67
4.2.3 Выяснение механизмов гибели клетки под воздействием 4D5scFv-miniSOG
4.2.3.1 Микроскопия 69
4.2.3.2 Активность каспазы-3 70
4.2.3.3 Фрагментация ДНК 70
4.3. Поиск подходов к фотоиндуцированному разрушению опухолевых клеток с использованием экзогенных и эндогенных ФС при облучении ИК-светом с использованием апконвертирующих нанофосфоров 72
4.3.1. Создание и исследование донорно-акцепторных пар НАФ:4Б58сРу-тіпі8СЮ,
возбуждаемых ближним ИК-светом 73
4.3.1.1 Перекрывание спектров 73
4.3.1.2 Стабилизация НАФ в водных растворах 74
4.3.1.3 FRET 75
4.3.1.4 Фёрстеровский радиус 76
4.3.1.5 Доказательство FRET 76
4.3.1.6 Конъюгация НАФ с белками 78
4.3.2. Разработка способа адресной доставки апконвертирующих нанофосфоров к опухолевым клеткам и исследование их фотоцитотоксичности при облучении ближним ИК-светом 79
4.3.2. 1 Получение и характеристика адресного белка DARPin-mCherry 79
4.3.2.2 Получение и характеристика связывания с клетками конъюгатов НАФ-PMAO:DARPin-mCherry 83
4.3.2.3 Оценка цитотоксичности конъюгата НАФ(ТтЗ+)РМАО:БАІІРігі-ггіСгіеггу при облучении ближним ИК-светом 84
4.3.3. Оценка использования рибофлавина в качестве ФС 91
4.3.3.1. Изучение способности рибофлавина селективно накапливаться в опухолевых
клетках 91
A33.2. Изучение онкоспецифической цитотоксичности рибофлавина при облучении УФА1 92
Выводы: 94
Заключение 95
Список сокращений и условных обозначений 96
Список литературы
- Генетически кодируемые фотосенсибилизаторы. MiniSOG
- Экспрессия, выделение и очистка рекомбинантного белка 4D5scFv-miniSOG
- Поиск подходов к фотоиндуцированному разрушению опухолевых клеток с использованием экзогенных и эндогенных ФС при облучении ИК-светом с использованием апконвертирующих нанофосфоров
- Разработка способа адресной доставки апконвертирующих нанофосфоров к опухолевым клеткам и исследование их фотоцитотоксичности при облучении ближним ИК-светом
Генетически кодируемые фотосенсибилизаторы. MiniSOG
ФДТ включает в себя 3 основных фактора: ФС, свет и кислород. Все факторы безопасны сами по себе, но в совокупности обладают цитотоксичностью: в кислородной среде при облучении ФС запускает фотохимическую реакцию с выходом активных форм кислорода (АФК), которые, являясь токсичными, приводят к повреждению клетки. Противоопухолевое действие ФДТ обусловлено тремя взаимосвязанными процессами: прямым токсическим действием АФК на клетки, повреждением сосудов опухоли и запусканием обильной воспалительной реакции, которая способна привести к развитию иммунного ответа. Относительный вклад каждого из этих процессов во многом зависит от типа и дозы ФС, промежутка времени между введением ФС и облучением, дозы и интенсивности облучения, концентрации кислорода в опухоли, а, возможно, и от других, плохо изученных факторов. Однако выбор ФС является наиболее критичным для успешного проведения ФДТ.
Как правило, ФС в основном состоянии имеет 2 спаренных электрона с противоположными спинами с суммарным спином S=0 и мультиплетностью, равной 1. Такое состояние называется синглетным, а конфигурация всех электронов на их низшей энергетической орбитали -основным состоянием So. Поглотив квант света определенной энергии, один из электронов этой пары переходит на более высокую энергетическую орбиталь. В зависимости от энергии, полученной ФС, он переходит в возбужденное синглетное состояние Sx, но сохраняет тот же спин, что и в синглетном состоянии. Такое возбужденное состояние является короткоживущим, и ФС теряет энергию, которая переходит в свет либо в тепло. В возбужденном синглетном состоянии Sx ФС также может запускать процесс так называемой интеркомбинационной конверсии, которая заключается в смене направления спина возбужденного электрона. Это приводит к образованию триплетного состояния ФС (Т ), электроны которого имеют параллельные спины [2]. Именно триплетное возбужденное состояние ФС является фотореакционноспособным., и большинство ФС имеют высокий квантовый выход интеркомбинационной конверсии. Как правило, триплетные состояния характеризуются относительно долгим временем жизни (вплоть до секунд). Находясь в возбужденном триплетном состоянии, ФС может принимать участие в двух типах реакций. В реакциях I типа ФС может передавать электрон (или протон) на кислород или другие близлежащие молекулы, например, на мембрану клетки, формируя анион-радикал или катион-радикал, соответственно (рис. 1, реакции 1-3) [3]. Радикалы с большой вероятностью могут вступать в реакции с кислородом с образованием активных форм кислорода. Зачастую в результате фотохимических реакций I типа путем переноса электрона от ФС на молекулярный кислород образуется супероксид-анион (СЬ ) (рис. 1, реакция 3). В биологических системах
В реакциях II типа ФС в триплетном состоянии напрямую переносит энергию (не электроны) на молекулярный кислород, который, являясь в основном состоянии триплетным Ог( S"g), переходит в возбужденную синглетную форму Ог( Ag или Ог) (рис. 1, реакция 4). В клетках время жизни Ог очень коротко ( 10-320 не), что сокращает их диффузию до -10-55 нм [5, 6]. Поэтому фотодинамическому воздействию подвергаются только те молекулы и структурные элементы клетки, которые оказываются вблизи локализации ФС внутри клетки [5]. реакции в процессе ФДТ. Различные типы первичных и вторичных фотохимических реакций вызывают образование АФК и дозозависимое повреждение клетки. Н2О2 - перекись водорода; СЬ( Ag) - синглетный кислород (возбужденное состояние); СЬ( S"g) триплетный кислород (основное состояние); Ог - супероксид-анион; ОН - гидроксильный радикал; SOD - супероксиддисмутаза.
Большинство используемых в онкологической практике ФС имеют тетрапиррольную структуру, сходную с протопорфирином гемоглобина. В качестве ФС используют очищенное природное соединение, что позволяет контролировать его качество без лишних затрат на производство, а также гарантирует стабильность вещества при хранении.
Первый используемый в лечении рака ФС представлял собой водорастворимую смесь порфиринов, производных гематопорфирина HpD. Их очищенная форма, порфимер натрия, позже стала основой коммерческого препарата Фотофрина. Несмотря на то, что порфимер натрия широко используется и по сей день, он имеет некоторые недостатки: сохранение фоточувствительности кожи в течение длительного времени после отмены препарата и относительно низкая величина поглощения ФС при 630 нм. Исследователями было приложено немало усилий по поиску ФС с улучшенными характеристиками, и было предложено несколько сотен соединений, потенциально пригодных для ФДТ опухолей. В таблице 1 приведены сведения о наиболее перспективных ФС, прошедших клинический контроль (как одобренных, так и испытываемых).
На сегодняшний день 5-аминолевулиновая кислота (АЛК), биосинтетический предшественник ФС протопорфирина, нашла множество применений. Так, АЛК или сложные эфиры АЛК могут применяться перорально или местно. Эти вещества являются неактивной формой лекарства, и только в раковых клетках с повышенной активностью 5-аминолевулинатсинтазы преобразуется в активный ФС протопорфирин [7].
Motexafin lutetium (Lutex) Таксафирин 732 Молочная железа Важным свойством всех перечисленных низкомолекулярных ФС является их способность неспецифически аккумулироваться в опухоли. Это может быть связано как с повышенной проницаемостью сосудов опухоли и эффектом удерживания (the enhanced permeability and retention effect, EPR-эффект) [8], так и со способностью ФС связываться с липопротеинами низкой плотности (low-density lipoprotein, LDL) и селективно доставляться к опухоли [9].
Генетически кодируемые ФС являются новым классом ФС, имеющим белковую природу. На сегодняшний день известно всего два таких белка: KillerRed и miniSOG. Они находят широкое применение в электронной микроскопии, хромофор-ассистируемой световой инактивации (chromophore-assisted light inactivation, CALI) белков и оптогенетике [10]. Использование белков - фотосенсибилизаторов в фотодинамической терапии является новым и перспективным направлением
Большим преимуществом белков - фотосенсибилизаторов является возможность их модификации с использованием генно-инженерных методов. В результате становится возможным специфически доставлять модифицированные ФС в различные клеточные компартменты (ядро или лизосомы) либо к различным типам клеток, а также контролировать генерацию АФК как по времени, так и по локализации. Это является основным отличием генетически кодируемых ФС от низкомолекулярных. Генетически кодируемые ФС могут вызывать различные эффекты при облучении, например: предотвращать деление клеток при ядерной локализации [11], вызывать некроз клеток при мембранной локализации [3] или апоптоз при лизосомной локализации [12].
Экспрессия, выделение и очистка рекомбинантного белка 4D5scFv-miniSOG
На сегодняшний день с использованием 4D5scFv в качестве нацеливающей молекулы было создано множество конструкций, обладающих различными свойствами. Например, 4D5scFv использовали для увеличения селективности доставки ФС пирофеофорбида А и вертепорфина путем формирования ковалентной связи между ФС и направляющим мини-антителом. Было показано, что полученные конъюгаты эффективно проникают в HER2/neu-положительные клетки SKOV-3, а также удерживаются внутри клетки значительно дольше по сравнению с неконъюгированными ФС [143].
Новым и перспективным направлением в этой области является создание генетически кодируемых иммунофотосенсибилизаторов (иммуноФС). Такие молекулы, так же как и вышеописанные конъюгаты, состоят из двух модулей: направляющего (мини-антитело) и эффекторного (фотосенсибилизатор), и представляют собой рекомбинантный белок, оба модуля в котором соединены друг с другом прочной пептидной связью. Это обеспечивает генетически кодируемым иммуноФС строгое постоянство состава, свойств и характеристик и, следовательно, строгую воспроизводимость функциональных свойств.
На базе нашей лаборатории был создан первый генетически кодируемый иммуноФС 4D5scFv-KillerRed [144]. Нацеливающий домен в полученном белке был представлен анти-НЕТ 2/пеи-миниантителом 4D5scFv, а эффекторный - фототоксичным красным флуоресцентным белком KillerRed, способным производить активные формы кислорода при облучении зеленым светом. Максимумы поглощения и эмиссии KillerRed составляют 585 и 610 нм соответственно. В опытах KillerRed демонстрирует фототоксичность, как минимум в 1000 раз превышающую токсичность всех других исследованных хромо- и флуоресцентных белков.
Исследования показали существенную фототоксичность KillerRed при экспрессии в клетках млекопитающих. Так, нами было показано, что белок 4D5-KillerRed специфически связывается с опухолевыми клетками SKOV-3, гиперэкспрессирующими опухолевый маркер HER2/neu, и обладает избирательной фототоксичностью по отношению к данным клеткам [144].
Другим примером нацеливающих молекул для специфического воздействия на рецептор HER2/neu опухолевых клеток в качестве мишени противоопухолевой терапии являются пептиды неиммуноглобулиновой природы. Несколько лет назад в лаборатории проф. А. Pliickthun путем отбора из библиотек анкириновых повторов белков с помощью технологий рибосомного или фагового дисплея был разработан новый класс таких молекул, которые получили название DARPin (Designed Ankyrin Repeat Protein) [145, 146]. Структура DARPin включает различное число анкириновых повторов, обычно от 4 до 6, формирующих связывающий домен. Один анкириновый повтор состоит, как правило, из 33 а.о., образующих Р-поворот и две антипараллельные а-спирали (Рисунок 11). Располагаясь друг над другом, анкириновые повторы образуют правозакрученный соленоид, в котором имеется протяженный гидрофобный кор и гидрофильная поверхность, доступная растворителю [147].
В природе такие белки с высокой аффинностью связываются с определенной мишенью, что приводит к запуску различных механизмов в клетке, от ингибирования ферментов до связывания белков друг с другом. В отличие от антител, DARPins имеют на порядок меньшие размеры (14-20 кДа vs 150 кДа), высоко стабильны и хорошо растворимы, что позволяет нарабатывать большие количества белка в гетерологичной системе экспрессии. DARPins не проявляют тенденции к агрегации и не требуют использования шаперонов для рефолдинга. Более того, было показано, что псевдотипирование лентивирусов белком DARPin приводит к большей специфичности их накопления в опухоли по сравнению с лентивирусами, псевдотипированными глико протеином [148]. Таким образом, все вышеперечисленные свойства позволяют говорить о DARPin как об альтернативе антителам и мини-антителам. 2.7. Источники света, используемые для ФДТ, и апконвертирующие нанофосфоры
На сегодняшний день не существует идеального источника света, удовлетворяющего требованиям всех типов ФДТ. Тем не менее, источник света необходимо выбирать в зависимости от абсорбции ФС (флуоресцентного поглощения и спектра действия), заболевания (локализации, размера новообразования, доступности и характеристик ткани), соотношения цена/качество и размера. Клинический эффект ФДТ зависит от комплексной дозиметрии: общей дозы облучения, времени облучения светом и порядка доставки света (единично, импульсно или равномерно). Плотность потока также оказывает влияние на исход ФДТ [149]. Системы, позволяющие измерять светорассеяние и плотность потока как интерстициально, так и на поверхности ткани, подвергаемой воздействию, к настоящему моменту используются только в экспериментальных работах.
В ФДТ используются такие источники света как лазеры и лампы накаливания, и эффективность их примерно одинакова [150]. В отличие от крупных и малоэффективных лазеров на красителях с накачкой, диодные лазеры имеют небольшие размеры и более рентабельны. Такие лазеры просты в обращении, имеют автоматическую дозиметрию и возможность калибровки, а также длительный срок службы. Светоизлучающие диоды (light emitting diodes, LEDs) являются альтернативными источниками с относительно узкой полосой испускания и высокой плотностью потока энергии [151, 152]. Лазеры могут объединяться в пучки с рассеивающимися концами (ЗАО «БИОСПЕК»), что позволяет воздействовать на опухоли в мочевом пузыре и пищеварительном тракте. Существуют также специальные надувные баллоны, сделанные из рассеивающего материала, которые помещают внутрь органа [153]. Вполне возможно имплантировать источник света в паренхиматозный орган глубоко внутрь тела.
Поиск подходов к фотоиндуцированному разрушению опухолевых клеток с использованием экзогенных и эндогенных ФС при облучении ИК-светом с использованием апконвертирующих нанофосфоров
Полученные данные свидетельствуют о том, что связывание 4D5scFv-miniSOG с клетками, гиперэкспрессирующими опухолевый маркер HER2/neu, является специфическим к данному рецептору. Показано, что 4D5scFv-miniSOG имеет флуоресцентный сигнал, незначительно превосходящий аутофлуоресценцию клеток и слабо детектируется флуоресцентным микроскопом. Но учет всех контролей и тщательный подбор параметров фотодетекции позволяют проводить оценку связывания белка при помощи конфокального микроскопа. Эти данные являются подтверждением результата о специфическом связывании антитела в составе молекулы 4D5scFv-miniSOG с антигеном HER2/neu, полученного нами при помощи метода поверхностного плазмонного резонанса.
Ранее показано, что анти-НЕЖ2/пеи-конъюгаты, и в том числе aHTH-HER2/neu рекомбинантные токсины, проникают в клетку рецептор-опосредованным эндоцитозом, после чего направляются в эндосомы и лизосомы [177-180]. В то же время фотосенсибилизаторы без «адреса», например, пирофеофорбид-а и вертепорфин, преимущественно поступают в митохондрии [180, 181].
Для определения внутриклеточной локализации адресного иммуноФС 4D5scFv-miniSOG исследовали его колокализацию с лизосомами и митохондриями - органеллами клетки, куда предположительно может поступать белок после интернализации. Для этого клетки линии SK-BR-3 инкубировали с иммуноФС, обрабатывали красителями органелл MitoTrackerRed (митохондрии) и LysoTracker Red (лизосомы) и помещали в ССЬ-инкубатор на 20 мин и 3 ч, соответственно. На рис. 6А видно, что большая часть 4D5scFv-miniSOG в результате такой обработки попадает в лизосомы. Количественный анализ коэффициентов колокализации был выполнен с помощью пакета программ Carl Zeiss LSM-710-NLO. Коэффициенты колокализации позволяют оценить вклад флуоресцентных сигналов в зеленом и красном каналах по отношению к средней интенсивности сигнала одного из каналов, то есть количественно оценить колокализацию белка 4D5scFv-miniSOG (зеленый канал) и красителей органелл (красный канал) [183].
Нами было показано, что через 3 ч после инкубации с 4D5scFv-miniSOG 72% лизосом клетки содержат белок (коэффициент колокализации Chll; рис.бВ), и эти данные служат дополнительным подтверждением рецептор-опосредованного эндоцитоза белка. В то же время количество белка в лизосомах составляет всего 21% от его общего содержания в клетке (коэффициет Ch2l, рис 6), что говорит о том, что большая часть 4D5scFv-miniSOG находится не в кислой среде лизосом, а, предположительно, в эндосомах. Аналогичный анализ колокализации белка с MitoTrackerRed выявил, что 28% митохондрий клетки содержат белок (рис.бГ) и 23% белка колокализуется с митохондриями. 4D5scFv-miiiiSOG
Определение внутриклеточной локализации 4D5scFv-miniSOG в клетках SK-BR-3, окрашенных красителем митохондрий MitoTrackerRed (А) и лизосом LysoTracker Red (Б). Представлены микрофотографии флуоресценции 4D5scFv-miniSOG (і, зеленый канал), окрашенных органелл (ii, красный канал), наложение микрофотографий флуоресценции зеленого и красного каналов (ш), Количественный анализ коэффициентов колокализации 4D5scFv-miniSOG с LysoTrackerRed (В) и MitoTrackerRed (Г) с диаграммами рассеяния по частоте и интенсивности сигналов флуоресценции белка и окрашенных органелл.
Таким образом, мы показали, что большая часть полученного нами aHTH-HER2/neu белка 4D5scFv-miniSOG направляется в лизосомы, что служит косвенным доказательством того, что эндоцитоз происходит посредством рецептора HER2/neu. В ряде работ было показано, что HER2/neu локализуется преимущественно в липидных рафтах плазматической мембраны и входит в состав крупных кластеров, которые при активации HER2/neu увеличиваются в размерах[184, 185]. Поэтому повреждение самого рецептора HER2/neu в плазматической мембране может отразиться на мобильности HER2/neu или повлиять на димеризацию с его партнерами, что может препятствовать взаимодействию рецепторов и эндоцитозу [186].
Ингибирование эндоцитоза HER2/neu при ФДТ может происходить в результате окисления липидов мембран. Тем не менее перекисное окисление липидов считается относительно медленным процессом, который проявляется через 30 мин после облучения [186]. Было показано, что усиленное перекисное окисление липидов при ФДТ происходит в лизосомах, так как, во-первых, эти органеллы имеют низкий рН, а во-вторых, высокие концентрации Fe(II) и Fe(III). Выступая катализаторами (реакция Фентона), ионы железа могут запускать автокатализируемое перекисное окисление липидов, усугубляя окислительное повреждение клеток [187]. Таким образом, мы полагаем, что в последующих экспериментах по изучению фотоиндуцируемой цитотоксичности белка облучение культуры необходимо проводить на момент локализации белка внутри клетки. В случае локализации 4D5scFv-miniSOG с внешней стороны мембраны на момент облучения эффект может быть менее выражен, так как фотодинамическое воздействие может предотвратить эндоцитоз.
Определение фотоцитотоксичности 4D5scFv-miniSOG проводили in vitro с помощью стандартного МТТ-теста на клетках SK-BR-3, инкубированных в течение 1 ч при 37С с белком 4D5scFv-miniSOG в диапазоне концентраций от 1 нМ до 500 нМ (Рис. 7). Для облучения клеток использовали источник синего света, который обеспечивает плотность потока энергии на дне планшета, равную 55 мВт/см . Было показано, что дозозависимое снижение жизнеспособности клеток SK-BR-3 происходит после обработки их иммуноФС 4D5scFv-miniSOG с последующим облучением в течение 10 мин, в то время как в отсутствие облучения токсичность не проявляется (Рис. 7, розовая и синяя кривые).
Относительная фототоксичность ICso (концентрация вещества, вызывающая 50% гибель клеток) белка 4D5scFv-miniSOG на клетках SK-BR-3 составила 160 нМ. Было показано также, что при наибольшей исследованной концентрации белка 4D5scFv-miniSOG - 500 нМ количество выживших клеток составило 21%.
Разработка способа адресной доставки апконвертирующих нанофосфоров к опухолевым клеткам и исследование их фотоцитотоксичности при облучении ближним ИК-светом
Таким образом, мы доказали, что НАФ(Тш ) при облучении являются цитотоксичными, что обусловлено УФА1 светом, излучаемым в процессе апконверсии за счет включения в состав НАФ ионов тулия. На сегодняшний день только несколько работ посвящены использованию НАФ, легированных тулием, в паре с акцепторами УФА света, например, с ДНК или с цитостатиком доксорубицином [213], однако ни в одной из них не описывается их фототоксичность.
Ключевыми посредниками фотооксидативного повреждения под воздействием УФА света на клетку являются возбужденные состояния эндогенных тканевых сенсибилизаторов [214]. В тканях человека имеется множество хромофоров, которые особенно сильно поглощают в УФ-А и синей области спектра. К основным эндогенным ФС относят порфирины, билирубин, меланин, флавины, витамины В6 и К, триптофан и некоторые другие.
Мы предполагаем, что при повышении количества одного из указанных эндогенных ФС внутри клетки чувствительность культуры к облучению может существенно повыситься. Так, мы предполагаем, что использование рибофлавина в паре с НАФ(Тш ) может представлять собой очень перспективную систему воздействия на опухолевые клетки, инициируемую ИК-светом.
В ряде работ последних десятилетий рибофлавину (Рф) приписывается роль в прогрессировании рака молочной железы. Во-первых, было показано, что в опухоли молочной железы мышей, выросших при недостатке Рф, уровень флавинов падал значительно в меньшей степени, чем в печени или мышцах животных; также, злокачественные ткани оказались гораздо устойчивее к рибофлавиновому голоданию, чем другие ткани организма [215]. Во-вторых, в плазме крови пациентов с раком молочной железы было отмечено повышение уровня белка-транспортера рибофлавина RCP (riboflavin carrier protein) по сравнению со здоровыми пациентами [216]. В то же время у больных было отмечено уменьшение концентрации Рф в плазме крови [217]. В-третьих, с использованием анти-RCP- специфичных мини-антител было продемонстрировано повышение накопления RCP в опухоли [218].
Способность рибофлавина селективно накапливаться в опухолевых клетках молочной железы была успешно применена для доставки цитостатика митомицина С к клеткам аденокарциномы молочной железы человека SK-BR-3, причем рибофлавин использовали в качестве адресной молекулы [34]. Авторы продемонстрировали большую эффективность интернализации при использовании рибофлавина в сравнении с распространенной адресной молекулой - фолиевой кислотой.
На примере опухолевых клеток молочной железы SK-BR-3 мы изучили способность Рф селективно накапливаться и вызывать гибель клеток при облучении.
Способность Рф селективно накапливаться в опухолевых клетках изучали на культурах клеток при помощи проточной цитофлуориметрии по флуоресценции Рф в канале FL1. Для этого клетки инкубировали в среде, содержащей повышенные концентрации рибофлавина (2 и 30 мкМ), в течение 90 мин. После этого культуру отмывали от Рф, не проникшего внутрь клеток, холодным PBS и сразу анализировали на проточном цитофлуориметре BD Accuri Сб. Для клеток SK-BR-3 было показано повышенное накопление Рф по сравнению с клетками яичника китайского хомяка (СНО) и фибробластами человека как при концентрации рибофлавина 2 мкМ, так и при концентрации 30 мкМ (рис.23). Интенсивность флуоресценции SK-BR-3 в результате инкубации клеток с 30 мкМ Рф выросла в 4 раза по сравнению с клетками, инкубированными в среде ( 0.5 мкМ рибофлавина). В то же время интенсивность флуоресценции СНО осталась практически на том же уровне. Примечательно, что при концентрации Рф 30 мкМ интенсивность флуоресценции фибробластов, выделенных из кожи человека, также возросла в -2.5 раза. Поэтому мы предполпгаем, что, как и все низкомолекулярные ФС, рибофлавин имеет тенденцию к накоплению в клетках кожи.
Онкоспецифическую цитотоксичность Рф исследовали на линиях клеток SK-BR-3 и СНО при облучении УФА1 (365 нм). Для этого клетки инкубировали с рибофлавином, аналогично эксперименту 4.3.3.1, после чего отмывали от избытка Рф и облучали источником УФА1-света АФС-365 (Полироник) с плотностью мощности 7 мВт/см в течение 10 мин. Было показано, что происходит дозозависимое снижение жизнеспособности клеток SK-BR-3, которое достигает 47% при инкубации клеток с 30 мкМ Рф (Рис.24). В то же время достоверного снижения жизнеспособности СНО не наблюдали. 1 К j-lOO