Иммуноферментные тест-системы для изучения лихорадки Эбола Мерзликин, Николай Владиславович

Введение к работе

Актуальность проблемы.

Одной из актуальных проблем современной вирусологии является всестороннее изучение инфекции, вызываемой вирусом Эбо-ла, и разработка методов её диагностики. Вирус Эбола относится к семейству Filoviridae и является одним из самых высокоиатогенных для человека. Геморрагическая лихорадка, вызываемая этим возбудителем, эндемична для некоторых районов Центральной Африки, однако известны случаи завоза лихорадки Эбола и на другие территории. Расширение экономических связей с государствами Африки и іури-іма делают оту ни^екцнк» п"-ннии,і,,т, і,и<н.иоїі и длл территории нашей страны. Одним из источников заболевания могут служить также обезьяны, ввозимые из стран Африки для научных исследований. Недавние сообщения об обнаружении в крови обезьян Cercopitecus aethiops антител к вирусу Эбола, выделение новых Эбола-подобных вирусов (Рестон) с неизвестным патогенным потенциалом от приматов, импортированных из Азии, а также разразившаяся в мае сего года тяжелая эпидемия лихорадки Эбола в Заире и связанные с нею международные эпидемиологические мероприятия заставляют более серьезно взглянуть на данную проблему. Раннее распознавание случаев жизненно необходимо для контроля вспышки и может быть выполнено только при наличии быстрого, специфичного и доступного метода. Этот метод должен быть применим также для обследования животных, завозимых в нашу страну.

Классическим методом детекции вируса Эбола является выделение в чувствительной культуре клеток с последующей идентификацией методом иммунофлюоресценции в сочетании с соответствующим клиническим анамнезом. Однако, несмотря на высокую чувствительность и специфичность, недостатком этого приема яв-

2 ляется длительность исследования — не менее 5-7 дней, что ограничивает его значение как диагностического. Кроме того, в случае клинических образцов интерпретация часто затруднена из-за неспецифической флюоресценции. Метод непрямой иммуноэлектронной микроскопии для обнаружения и идентификации филовирусов в жидких образцах, метод гибридизации нуклеиновых кислбт имеют лишь ограниченное лабораторное применение.

Сегодня метод иммуноферментного анализа является необходимым инструментом при изучении различных аспектов инфекционного процесса: обнаружения возбудителя в различных органах и физиологических жидкостях, времени его появления и концентрации, динамики появления и накопления специфических антител. Метод иммуноферментного анализа хорошо зарекомендовал себя при изучении репродукции вирусов в культуре клеток, при поиске и оценке противовирусных средств. К моменту начала наших исследований и до настоящего времени в стране отсутствуют иммуно-ферментные тест-системы для выявления антигена вируса Эбола и антител к нему.

Целью настоящего исследования было экспериментальное изучение инфекции, вызываемой вирусом Эбола, на моделях пер-миссивных культур клеток и лабораторных животных с помощью разработанных иммуноферментных тест-систем.

В задачи исследования входило:

1. Изучить вопросы культивирования и оптимизировать технологию получения очищенного вируса Эбола в препаративных количествах.

2. Получить специфические антисыворотки к вирусу Эбола с высоким титром антител.

3. Разработать и апробировать иммуноферментные тест-системы для выявления антигена и антител к вирусу Эбола.

4. Получить набор контрольных отрицательных и положительных сывороток для оценки качества (чувствительности и-.специфичности) разработанных тест-систем.

5. Определить диагностические возможности разработанных иммуноферментных тест-систем в сравнении с традиционными методами диагностики.

6. Изучить динамику появления и накопления антигена вируса Эоола и шсдіїфіїчссліігс пї;т"т?.і v, процессе «'«-римгн^.ньнйй инфекции у различных лабораторных животных.

Научная новизна.

Изучена динамика накопления вируса Эбола в перевиваемых культурах клеток Vero и Л-68; на этой основе разработан оть-

емно-доливной способ культивирования с многократным (до 4-х раз) сбором вируссодержащей культуралыюй жидкости с высоким уровнем биологической активности — 2,3x10⁵ - 1,6х10⁶БОЕ/мл.

Впервые разработана иммуноферментная тест-система для выявления антигена вируса Эбола. Проведены исследования по обнаружению вирусного антигена в крови и тканевых гомогенатах при экспериментальной инфекции вирусом Эбола; показана возможность постановки специфического диагноза на 5-6 сутки после инфицирования, до развития основных клинических симптомов заболевания.

Разработана экспериментальная иммуноферментная тест-система для выявления антител в сыворотках лабораторных животных — морских свинок и обезьян павианов гамадрилов, инфици-

4 рованных вирусом Эбола. Изучены сроки появления и динамика

титра антител, выявляемых в иммуноферментном анализе, в сыворотках экспериментальных животных, инфицированных вирусом Эбола; тест-система позволяет обнаруживать специфические антитела на 8-9 сутки после заражения; чувствительность ИФА выше чувствительности традиционных методов серологической диагностики РСК и РНИФ в 100-160 и 5-20 раз соответственно.

Разработаны методические подходы к получению панели положительных контрольных сывороток; получен и охарактеризован набор из 22 иммунных сывороток с низким титром специфических антител (1:100-1:800) для оценки чувствительности тест-системы на выявление антител к вирусу Эбола.

Практическая значимость работы.

В результате проведенных исследований отработана технология культивирования вируса Эбола в перевиваемых культурах клеток Vero и Л-68 и получения очищенного концентрированного препарата вируса с высоким биологическим и физическим титром (до 10⁹БОЕ/мл и 10" вирионов/мл соответственно) и минимальным содержанием балластных веществ для приготовления высокоактивного антигена с целью его использования в ИФА. Разработанная методика может быть использована также и для получения препаративных количеств вируса Эбола для приготовления инактивиро-ванной вакцины, иммунизации животных, выделения РНК и т.д.

Разработаны иммуноферментные тест-системы для выявления антител к вирусу Эбола и антигена вируса Эбола; оптимизированы условия постановки реакции; отработана оптимальная схема учета и интерпретации результатов. Обе тест-системы апробирова-

5 ны в экспериментальных условиях, показана их высокая чувствительность и хорошая воспроизводимость результатов. Наборы для определения антител к вирусу Эбола и антигена вируса Эбола освоены в условиях опытгго-лабораторного производства и могут быть использованы для исследования лихорадки Эбола.

Апробация работы.

Материалы диссертационной работы были представлены:

1. на межведомственной конференции "Изучение и профилактика осооо опасных внрушыл ПпфСкЦ;;;:", гт.Кс.тн!"»». '*« »п-реля 1993г.;

2. на Всероссийской научной конференции "Иммунология и специфическая профилактика особо опасных инфекций", г.Саратов, 21-23 сентября 1993 г.;

3. на научной конференции РАМН "Здоровье и болезни человека на рубеже XXI века", г.Москва, 25-27 мая 1994 г.

Результаты проведенных исследований отражены в 6 печатных работах.

Структура работы.