Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 16
1.1 Актуальность дифференциальной диагностики лихорадок 16
1.1.1 Общие сведения и эпидемиология вирусов рода Ebolavirus 17
1.1.2 Структурно-функциональные свойства вирусов рода Ebolavirus 31
1.1.3 Факторы иммунной системы, определяющие эффективность диагностики лихорадки Эбола 37
1.1.4 Классические и современные средства диагностики лихорадки Эбола 38
1.2 Рекомендации ВОЗ по предупреждению эпидемий вызываемых филовирусами: задачи здравоохранения 45
1.2.1 Действия в случае эпидемии 45
1.2.2 Мониторинг эпидемиологической обстановки 45
1.2.3 Методы диагностики лихорадки Эбола 48
1.2.4 Рекомендации по применению средств иммунодиагностики при разработке терапевтических и вакцинных препаратов. Анализ иммунологической вариабельности вирусов рода Ebolavirus 50
2 Материалы и методы исследования 54
2.1 Материал исследования 54
2.1.1 Вирусы 54
2.1.2 Культуры клеток и среды 54
2.1.3 Животные 55
2.1.4 Референс-образцы, международные стандарты 55
2.1.5 Наборы реагентов 56
2.1.6 Химические реагенты и реактивы 57
2.2 Методы исследования 57
2.2.1 Методы идентификации Zaire Ebolavirus 57
2.2.2 Культивирование вируса 58
2.2.3 Определение инфекционной активности вирусных препаратов 59
2.2.4 Получение природного антигена Zaire Ebolavirus 60
2.2.5 Анализ препаратов Zaire Ebolavirus 62
2.2.6 Определение специфической активности образцов 62
2.2.7 Статистическая обработка 64
2.2.8 Этические нормы 66
3 Результаты и их обсуждение 67
3.1 Идентификация штаммов 67
3.2 Подбор условий приготовления природных антигенов 69
3.3 Характеристика использованных для сравнения антигенов 73
3.3.1 Рекомбинантный аналог белка VP40 Zaire Ebolavirus 73
3.3.2 Синтетические аналоги пептидов белка GP Zaire Ebolavirus 74
3.4 Разработка панелей для исследования свойств антигенов 76
3.5 Определение диагностической информативности антигенов 78
3.6 Выбор штамма Zaire Ebolavirus для использования в качестве антигена при выявлении специфических антител 81
3.7 Выбор метода выявления специфических антител 83
3.8 Разработка дизайна медицинского изделия для диагностики лихорадки Эбола 84
3.9 Клинические исследования диагностической эффективности набора реагентов 85
3.10 Регистрация медицинского изделия «Вектор ИФА Эбола-АТ скрин» 88
3.11 Сроки и длительность выявления антител против Zaire Ebolavirus 93
3.12 Определение специфической активности вакцин против Zaire Ebolavirus 96
3.13 Определение специфической активности терапевтических препаратов для лечения лихорадки Эбола 100
3.14 Заключение 102
Выводы 105
Список работ, опубликованных по теме диссертации 106
Список литературы 112
Приложение 1 136
Приложение 2 138
Приложение 3 142
Приложение 4 144
Приложение 5 146
Приложение 6 147
- Общие сведения и эпидемиология вирусов рода Ebolavirus
- Рекомендации по применению средств иммунодиагностики при разработке терапевтических и вакцинных препаратов. Анализ иммунологической вариабельности вирусов рода Ebolavirus
- Определение диагностической информативности антигенов
- Определение специфической активности терапевтических препаратов для лечения лихорадки Эбола
Общие сведения и эпидемиология вирусов рода Ebolavirus
Таксономия возбудителей БВВМ и БВВЭ определена в соответствии с протоколами и решениями Международного Комитета по Таксономии Вирусов. Текущая таксономия отражена в опубликованном 31 мая 2019 года документе «Virus Taxonomy: 2018b.v2 Release» [ICTV, 2019].
Семейство Filoviridae вместе с семействами Artoviridae, Bomaviridae, Lispivindae, Mymonavindae, Nyamivindae, Paramyxovindae, Pneumovindae, Rhabdoviridae, Sunviridae, Xinmoviridae входят в порядок Mononegavirales.
Семейство Filoviridae насчитывает пять родов Cuevavirus, Striavirus, Thamnovirus, Ebolavirus и Marburgvirus, представители двух вызывают заболевания человека. Болезнь, вызванная вирусом Марбург (Marburg virus disease) - БВВМ [МКБ-10а, 2019], называемая также геморрагическая лихорадка Марбург; и болезнь, вызванная вирусом Эбола (Ebola virus disease) - БВВЭ [МКБ-10б, 2019], называемая также геморрагическая лихорадка Эбола или лихорадка Эбола. БВВЭ у человека вызывается 4 видами, входящими в род Ebolavirus: Bundibugyo ebolavirus, Zaire ebolavirus, Sudan ebolavirus, и Таї Forest ebolavirus [Siegert et al., 1967; Bowen et al, 1977; Johnson et al., 1977; Kuhn, 2015]. Вспышек ВГЛ у человека, вызываемых представителями пятого вида Reston ebolavirus не зафиксировано.
Еще три рода семейства представлены единственными вирусами Lloviu cuevavirus рода Cuevavirus, Xilang striavirus рода Striavirus и Huangjiao thamnovirus рода Thamnovirus, вспышек ВГЛ по их причине также не зарегистрировано.
Новейшие исследования свидетельствуют о существовании еще двух представителей филовирусов. Mngl Virus согласно предложениям обнаруживших его РНК в летучих мышах рода Rosettus китайских ученых cтанет единственным видом рода Dianlovirus [Xing-Lou et al., 2019]. Bombali ebolavirus обнаружен в обитающих в Сьерра-Леоне летучих мышах летом 2018 года американскими исследователями [Goldstein et al., 2019].
Все вызывающие ВГЛ представители рода Ebolavirus считаются «новыми патогенами» [Peters et al., 1994; Howard & Fletcher, 2012; Martina & Osterhaus, 2009]. Это означает, что частота их выявления среди восприимчивых популяций значительно возросла. Ранее они являлись эндемичными только для Африки и вызывали локальные вспышки заболеваний [Roddy, 2014]. Из-за отсутствия диагностических возможностей и доступа к медицинским учреждениям вспышки в большинстве случаев не фиксировались. Системы эпидемиологического надзора за болезнями в государствах Африки, хотя они крайне необходимы, в основном не развиты и методически не готовы к работе с ВГЛ [Senga et al., 2016; Panning et al., 2007]. К открытию новых видов рода Ebolavirus привело появление новых инструментов лабораторной диагностики, начиная с обнаруженного на Филиппинах Reston ebolavirus. Благодаря лабораторному мониторингу клинически подозрительных проявлений заболеваний увеличивается числа зарегистрированных случаев БВВЭ. С другой стороны, антропогенные изменения экосистем Африки привели к более частым и более тесным контактам этих вирусов с людьми [Alexander et al., 2015; Mehedi et al., 2011; Bannister, 2010].
Данные ВОЗ по зарегистрированным вспышкам БВВЭ приведены на Рисунке 1 и в Таблице 1. В Таблице 2 – расследование причины вспышек БВВЭ. Для сравнения масштабов и географии вспышек, на Рисунке 2 и в Таблице 3 приведены данные ВОЗ по зарегистрированным вспышкам БВВМ.
Таким образом, летальность при БВВЭ колеблется от 36% до 90%. Каждый случай заболевания ВГЛ подвергается эпидемиологическому расследованию с целью установить все возможные контакты инфицированного для дальнейшего купирования вспышки. Некоторые результаты расследования в качестве образца приведены в таблице 2. В 2014-2016 гг. в 3 странах Западной Африки (Гвинея, Сьерра-Леоне и Либерия) была зарегистрирована эпидемия БВВЭ, которую вначале считали эндемичной только для сельских районов Центральной Африки [CDC, 2014а]. Масштаб эпидемии и угроза распространения эпидемии на другие территории показала необходимость участия всего мирового сообщества в ликвидации данной проблемы. В страны, пострадавшие от эпидемии, с целью оказания медицинской помощи были направлены бригады специалистов из многих стран мира [CDC, 2016].
В августе 2014 г. Правительством Российской Федерации было принято решение об оказании помощи Гвинейской Республике в ликвидации эпидемии БВВЭ. Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации в Гвинейскую Республику был направлен мобильный комплекс санитарной противоэпидемической бригады Роспотребнадзора (МК СПЭБ) и группа специалистов, в задачи которых входило оказание консультативно-методической помощи и осуществление лабораторной диагностики БВВЭ [Попова и др., 2014].
Диагностические исследования проводили методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Метод ОТ-ПЦР хорошо зарекомендовал себя при проведении диагностики БВВЭ на ранних стадиях развития инфекционного процесса, когда возбудитель персистирует в организме больного [Лопатин и др., 2015]. Немаловажное значение играет и выявление специфических антител, что позволяет проводить сероэпидемический мониторинг и осуществлять лабораторную диагностику на более поздних сроках от начала заболевания [Krhling et al., 2016; Vu et al., 2016]. В Российской Федерации на момент начала работы МК СПЭБ в Гвинейской Республике зарегистрированные препараты, позволяющие выявлять в сыворотке крови антитела к возбудителю БВВЭ, отсутствовали. Требовалось обеспечить средством иммунодиагностики работу лаборатории МК СПЭБ в период эпидемических проявлений БВВЭ в Гвинейской Республике.
Рекомендации по применению средств иммунодиагностики при разработке терапевтических и вакцинных препаратов. Анализ иммунологической вариабельности вирусов рода Ebolavirus
Под эгидой ВОЗ созданы экспертные группы из независимых исследователей, являющихся авторитетами в области исследования филовирусов.
В их компетенцию входит разработка рекомендаций по созданию терапевтических и профилактических препаратов для решения проблемы БВВЭ, а также процедур их испытаний и применения.
Экспертная группа по терапевтическим препаратам проводит регулярные обсуждения и дает рекомендации по целесообразности продолжения исследований препаратов. Пример такой работы по обсуждению экспертной группой ключевых пунктов повестки перечислен ниже:
ZMapp (коктейль моноклональных антител). Доступные данные, включая данные рандомизированного контролируемого исследования ZMapp у пациентов с БВВЭ, позволяют рекомендовать ZMapp для терапии, преимущества перевешивают риски.
Remdesivir (GS-5734) (антивирусное лекарство). Группа поддерживает использование препарата, однако необходимо провести клинические испытания для оценки его преимуществ и рисков.
REGN3470-3471-3479 (коктейль моноклональных антител). Данные оказались очень перспективными и эксперты поддерживали его использование в тех случаях, когда ZMapp или Remdisivir недоступны. Тем не менее, рекомендованы его клинические испытания.
Фавипиравир (антивирусное лекарство). Эксперты отметили значительную неопределенность в отношении того, предоставляет ли он преимущества для лечения пациентов с БВВЭ. Важно провести соответствующие клинические испытания. Его использование осложняется выбором дозы для лечения.
mAb 114 (моноклональное антитело) – mAb114 в настоящее время находится на очень ранних стадиях изучения. Ограниченные данные выглядят потенциально перспективными, но требуется больше данных от клинических испытаний, прежде чем рекомендовать.
В настоящее время ВОЗ разрабатывает унифицированные проекты клинических испытаний препаратов на основе рекомендаций этой группы экспертов. Экспертные группы ВОЗ активно взаимодействуют с производителями продуктов, а также с национальными органами, чтобы ускорить подготовку к клиническим испытаниям по единой схеме. В Таблице 4 перечислены платформы для вакцины против вируса Эбола, испытываемые в настоящее время на приматах.
Экспертной группой по профилактическим препаратам изучаются вспышки БВВЭ в прошлом. Они часто начинались в отдаленных сельских районах, как правило ограничивались не более чем 300 случаями и продолжались менее 6 месяцев [WHO, 2017b]. Инфицирование медицинских работников на ранних стадиях этих вспышек, прежде чем случаи были подтверждены лабораторно, способствовали передаче возбудителя.
Двенадцать кандидатных вакцин (в том числе моновалентных, двухвалентных и поливалентных) прошли или в настоящее время находятся на разных стадиях национальных клинических испытаний. Эксперимент с применением вакцины на основе ВВС, проведенный в Гвинее, является единственным исследованием, которое свидетельствует о клинической эффективности. ВОЗ получила полную документацию об еще одной вакцине на основе аденовируса. Она в настоящее время рассматривается как кандидат для использования в ДРК. На сегодняшний день ни одна другая вакцина для профилактики БВВЭ не была одобрена или хотя бы представлена ВОЗ в качестве кандидатной.
Все указанные препараты при разработке и проведении клинических испытаний по национальным стандартам должны быть оценены по параметру «специфическая активность». Это достигается введением препарата до или после инфицирования животных экспериментальных групп и отслеживанием последствий воздействия на иммунитет подопытных.
Чтобы определить против каких белков нарабатываются антитела, возможно использование ИФА с отдельными белками в качестве антигена [Sobarzo et al., 2013]. Чтобы определить их долю в общем пуле, используется Вестерн-блот анализ [Leroy et al., 2000].
Чтобы определить иммунодоминантные сайты белков, в качестве антигена используют короткие синтетические пептиды. Например, пептиды из 15 аминокислот идентифицировали иммунодоминантные сайты в VP35, VP40, NP и GP у бессимптомных индивидуумов. В крови выживших после БВВЭ в Габоне также идентифицированы иммунодоминантные сайты GP [Becquart et al., 2014]. К сожалению, аналогичная информация о специфичности антител после вакцинации мало доступна широкому кругу ученых. До сих пор основное внимание уделялось определению титров IgG с помощью ИФА или РН вируса, но результаты не содержат информации об иммунодоминантных областях, являющихся мишенями гуморального ответа.
Следует отметить, что только часть из иммунодоминантных эпитопов стимулируют наработку нейтрализующих или протективных антител.
Оболочечный гликопротеин GP, обеспечивающий рецептор-обусловленную связь вируса с клеткой-мишенью, является основной мишенью при создании вакцин и индукции нейтрализующих антител. Известно, что белок GP содержит не менее пяти эпитопов, которые способны индуцировать нейтрализующие антитела.
Ряд исследователей считают, что перспективу для разработки средств профилактики БВВЭ на основе нейтрализующих антител также имеет метод фагового дисплея [Mullen et al., 2006; Pande et al., 2010].
Таким образом, следующие друг за другом эпидемии БВВЭ заставляют повысить настороженность общественного здравоохранения всех стран мира к этому опасному заболеванию и разрабатывать средства для его диагностики, профилактики и лечения. Несмотря на высокую диагностическую эффективность (ДЭ) метода ОТ-ПЦР, в настоящее время существует острая необходимость разработки дополнительных средств, основанных на иммунологических методах. Они необходимы не только для диагностики БВВЭ, но и для мероприятий по контролю за эффективностью средств борьбы с болезнью. Сочетание простоты использования, высокой специфичности и чувствительности, а также доступности и широкой распространенности делают ИФА наиболее перспективным для дополнения эффективного метода ОТ-ПЦР при проведении противоэпидемических мероприятий, направленных на борьбу с БВВЭ.
Определение диагностической информативности антигенов
Для определения диагностической информативности антигенов был выбран ИФА. В отличие от Вестерн-блот анализа и РН, этод метод, с учетом временных и ресурсных затрат, может применяться при скрининге больших массивов образцов. каковым, Большим массивом является разработанная панель образцов содержащих и не содержащих специфические антитела. Кроме того, первые два метода не могут выявить в панельных образцах всего репертуара специфических антител: Вестерн-блот, как правило не имеет бэнда высокомолекулярного белка GP по причине требуемой высокой плотности полиакриламидного геля для разделения белков по сумме зарядов; РН выявляет только нейтрализующие антитела, это неоценимо для исследования протективных свойств содержащих антитела образцов но обедняет выявляемый репертуар специфических антител. Скрининг в ИФА выборки образцов предполагал использование иммуносорбентов с постоянной концентрацией каждого антигена, а также однообразные условия анализа для всех образцов. Коэффициент вариации ни в одном анализе не превысил значение CV = 8%.
Для определения критерия позитивности результата ИФА в качестве отрицательного контроля использован образец сыворотки крови от здорового донора без содержания специфических антител. Он применен в в пяти повторах для каждого ИФА с образцами панели. Образец панели считали содержащим антитела к использованному антигену если его ОП была в два раза выше чем сумма среднего ОП для К- и 8% коэффициента вариации ОП К-. Результаты представлены в Таблице 7.
Чтобы провести сравнительный анализ полученных результатов объективно, группы образцов с содержанием антител заведомо только к белкам VP40 или GP были исключены из рассмотрения.
После исключения, в ИФА изучено 860 образцов крови, из них 281 образец содержал специфические антитела и анализировался в пяти повторах на каждом из четырех антигенов, 579 образцов не содержали таких антител.
В ходе исследований доказана диагностическая эффективность антигена 8МС культуральной наработки:
- для 1405 положительных проб содержащих антитела к Zaire ebolavirus положительный результат получен в 1405 случаях. Диагностическая чувствительность – не менее 99,9% с доверительной вероятностью 95%;
- для 579 отрицательных проб не содержащих антитела к Zaire ebolavirus, отрицательный результат зарегистрирован в 579 случаях. Диагностическая специфичность – не менее 99,9% с доверительной вероятностью 95%.
Доказана диагностическая эффективность антигена H.sapiens/GIN/2015/Makona-Kindia1022 из печени инфицированного примата:
- для 1405 положительных проб содержащих антитела к Zaire ebolavirus положительный результат получен в 1405 случаях. Диагностическая чувствительность – не менее 99,9% с доверительной вероятностью 95%;
- для 579 отрицательных проб не содержащих антитела к Zaire ebolavirus, отрицательный результат зарегистрирован в 579 случаях. Диагностическая специфичность – не менее 99,9% с доверительной вероятностью 95%.
Определена диагностическая эффективность рекомбинантного антигена EboV6хHisagVP40:
- для 1405 положительных проб содержащих антитела к Zaire ebolavirus положительный результат получен в 1310 случаях. Диагностическая чувствительность – не менее 93% с доверительной вероятностью 95%;
- для 579 отрицательных проб не содержащих антитела к Zaire ebolavirus, отрицательный результат зарегистрирован в 575 случаях. Диагностическая специфичность – не менее 97% с доверительной вероятностью 95%. Определена диагностическая эффективность совместного применения пептидных антигенов «SEQ ID NO 1» и «SEQ ID NO 2»:
- для 1405 положительных проб содержащих антитела к Zaire ebolavirus положительный результат получен в 1285 случаях. Диагностическая чувствительность – не менее 91% с доверительной вероятностью 95%;
- для 579 отрицательных проб не содержащих антитела к Zaire ebolavirus, отрицательный результат зарегистрирован в 570 случаях. Диагностическая специфичность – не менее 96% с доверительной вероятностью 95%.
Таким образом, наибольшая диагностическая эффективность в ИФА на 1405 положительных и 579 отрицательных образцах была зарегистрирована для антигена МС8 культуральной наработки и антигена H.sapiens/GIN/2015/Makona-Kindia1022 из печени инфицированной обезьяны.
Определение специфической активности терапевтических препаратов для лечения лихорадки Эбола
Крупнейшая вспышка БВВЭ 2014-2016 годов привела к созданию Объединенной миссии ООН по чрезвычайному реагированию. Началась разработка новых средств и методов лечения инфекции. Среди них – разработка терапевтических препаратов на основе нейтрализующих антител.
Группа международных исследователей разработала альтернативу моноклональным антителам в виде антител от иммунизированных лошадей [Pyankov et al., 2017]. В образцах сыворотки крови лошадей методом ИФА с использованием иммуносорбента набора «Вектор ИФА Эбола-АТ скрин» определяли титр специфических антител. Он составил 1:50 000.
Препарат на основе очищенной лошадиной сыворотки был использован для лечения четырех приматов Macaca fascicularis, которым ввели летальные дозы (103 БОЕ/обезьяну) вируса. Для контроля пробы крови исследовали в ИФА с использованием иммуносорбента «Вектор ИФА Эбола-АТ скрин». Данные о динамике титров специфических антител приведены на Рисунке 13.
Из рисунка 13 видно (желтый сегмент), что образование собственных специфических антител в среднем титре 100+10 произошло на 11-й день после заражения. Все обезьяны выработали свои собственные специфические антитела через 9-15 дней после заражения, и очистили кровь от вируса через 15-18 дней.
Аналогично, набором «Вектор ИФА Эбола-АТ скрин» была исследована динамика наработки специфических гуманизированных антител при роллерном способе культивировании продуцента конструкции «МаЫ14». Данные отражены на Рисунке 14.
В результате производителям «Мab1 14» рекомендовано культивировать продуценты в одном объеме среды не более 14 суток.