Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы .13
1.1. Параганглиомы головы и шеи .13
1.1.1. Генетика .13
1.1.2. Молекулярные механизмы патогенеза .15
1.1.3. Диагностика и лечение .17
1.2. Мутации в опухолях .19
1.2.1. Классификация мутаций 19
1.2.2. Мутационная теория канцерогенеза .23
1.2.3. Скорость мутационного процесса в опухолях .25
1.2.4. Драйверные, пассажирские и сторожевые мутации 29
1.2.5. Сигнальные пути, ассоциированные с канцерогенезом 34
1.3. Мутационные сигнатуры в опухолях 36
1.4. Неоантигены .38
1.5. Мутационная нагрузка как предиктор ответа на иммунотерапию ингибиторами иммунных контрольных точек 40
1.6. Применение технологии высокопроизводительного секвенирования для анализа мутаций в опухолях .41
2. Материалы и методы .44
2.1. Образцы тканей 44
2.2. Выделение ДНК из образцов опухолевых и нормальных тканей .46
2.3. Выделение РНК из образцов опухолевых тканей 47
2.4. Подготовка экзомных библиотек 47
2.5. Подготовка транскриптомных библиотек 49
2.6. Валидирование библиотек .49
2.7. Высокопроизводительное секвенирование 50
2.8. Биоинформатическая обработка данных 51
2.9. Анализ данных секвенирования с помощью алгоритма MutSiqCV .52
2.10. Анализ данных секвенирования с помощью алгоритма xseq .52
2.11. Анализ мутационной нагрузки 53
2.12. Валидирование мутаций методом секвенирования по Сэнгеру .55
3. Результаты и обсуждение 58
3.1. Новые гены с высокой частотой мутаций при КПГ .58
3.2. Новые пути с участием генов SARM1, DISC1, CTDSP2 и IGFBP2, потенциально ассоциированные с патогенезом КПГ .61
3.3. Влияние мутаций на экспрессию генов при КПГ .64
3.4. Вовлеченность генов MYH15, CSP1 и MYH3 в образование и развитие опухолей. Новый потенциальных механизм развития КПГ с участием гена CSP1 .68
3.5. Алгоритм оценки мутационной нагрузки 70
3.6. Мутационная нагрузка при каротидных параганглиомах .73
3.7. Патогенные и потенциально патогенные соматические варианты при КПГ 76
3.8. Патогенные и потенциально патогенные герминальные варианты при КПГ 80
3.9. Герминальные и соматические варианты в известных генах, ассоциированных с параганглиомами/феохромоцитомами 82
Заключение .85
Выводы .88
Список литературы 89
Приложение .124
- Классификация мутаций
- Неоантигены
- Новые гены с высокой частотой мутаций при КПГ
- Герминальные и соматические варианты в известных генах, ассоциированных с параганглиомами/феохромоцитомами
Классификация мутаций
Различают мутации генные, хромосомные и геномные мутации:
1. Генные мутации приводят к изменению структуры отдельных генов.
Среди них значительную часть составляют точечные (однонуклеотидные) мутации.
При точечных мутациях изменения затрагивают одну пару нуклеотидов. Чаще всего при точечных мутациях происходит замена нуклеотидов. Такие мутации бывают двух типов: транзиции и трансверсии. При транзициях в нуклеотидной паре пурин замещается на пурин или пиримидин на пиримидин, т.е. пространственная ориентация оснований не изменяется. При трансверсиях пурин замещается на пиримидин или пиримидин на пурин, что изменяет пространственную ориентацию оснований. По характеру влияния замены оснований на структуру кодируемого геном белка выделяют три класса мутаций: миссенс-мутации (missense), нонсенс-мутации (nonsense) и синонимичные замены (synonymous).
Миссенс-мутации изменяют смысл кодона, что приводит к появлению в составе белка одной неверной аминокислоты. Это может иметь очень серьезные последствия и приводить к развитию заболевания. Нонсенс-мутация - это появление терминального кодона внутри гена в результате замены одного основания. В результате этой замены белок не может быть полностью синтезирован и его трансляция обрывается на терминальном кодоне. При синонимичной мутации замена одного основания приводит к появлению кодона-синонима. В этом случае изменения генетического кода не происходит и синтезируется нормальный белок.
Кроме замены нуклеотидов, точечные мутации могут быть вызваны вставкой или удалением одной пары нуклеотидов. Эти нарушения приводят к изменению рамки считывания, соответственно, нарушается генетический код и синтезируется измененный белок.
Стоит отметить, что описанные выше классы мутаций располагаются в экзонных участках гена, оказывая непосредственное влияние на синтезируемый белок. Также, точечные мутации могут встречаться в интронных регионах. Такие мутации могут влиять на структуру синтезируемого белка, если они располагаются в сайтах сплайсинга.
К генным мутациям относят также удвоение и потерю небольших участков гена, а также инсерции - вставки дополнительного генетического материала, источником которого чаще всего являются мобильные генетические элементы. Генные мутации являются причиной существования псевдогенов - неактивных копий функционирующих генов, у которых отсутствует экспрессия, т.е. не образуется функциональный белок. В псевдогенах мутации могут накапливаться. С активацией псевдогенов связывают процесс развития опухолей.
2. Хромосомные мутации вызывают более серьезные изменения в генетическом материале. Их называют хромосомными аберрациями, или хромосомными перестройками. Перестройки могут затрагивать одну хромосому (внутрихромосомные) или несколько (межхромосомные). Внутрихромосомные перестройки могут быть трех типов: потеря (нехватка) участка хромосомы, удвоение участка хромосомы (дупликации), поворот участка хромосомы на 180 градусов (инверсии). К межхромосомным перестройкам относятся транслокации -перемещение участка одной хромосомы на другую, не гомологичную ей хромосому.
3. Геномные мутации - самые существенные нарушения генетического аппарата, приводящие к изменению числа хромосом. Они могут касаться либо отдельных хромосом (анеуплоидия), либо целых геномов (эуплоидия). Генные мутации можно классифицировать на две группы:
1) Наследственные (герминальные) мутации, которые наследуются от родителей и присутствуют на протяжении всей жизни человека практически в каждой клетке организма. Эти мутации также называются мутациями зародышевой линии.
2) Приобретенные (соматические) мутации - происходят в определенный период жизни человека и присутствуют только в индивидуальных клетках. Эти изменения могут быть вызваны внешними (например, ультрафиолетовое излучение) или внутренними (например, ошибки репликации ДНК) факторами. Приобретенные мутации в соматических клетках (клетках, отличных от сперматозоидов и яйцеклеток) не могут быть переданы следующему поколению.
Генетические изменения, которые описываются как de novo (новые) мутации, могут быть наследственными и соматическими. В некоторых случаях мутация происходит в яйцеклетке или сперматозоидах человека, но не присутствует ни в одной из других клеток человека. В других случаях мутация происходит в оплодотворенной яйцеклетке вскоре после объединения яйцеклетки и сперматозоида.
De novo мутации делятся на спонтанные и индуцированные. Повреждения ДНК могут возникнуть в результате двух различных процессов:
1. Экзогенных повреждений, возникающих в результате воздействия мутагенных агентов и канцерогенов - индуцированные мутации.
2. Эндогенных дефектов, которые возникают как следствие клеточного метаболизма и присущей ДНК нестабильности - спонтанные мутации.
Спонтанные мутации возникают самопроизвольно в нормальных для организма условиях окружающей среды с частотой около 10-9 - 10-12 мутаций на нуклеотид за клеточную генерацию. Индуцированные мутации возникают в результате тех или иных мутагенных воздействий в искусственных (экспериментальных) условиях или при неблагоприятных воздействиях окружающей среды. Интересно, что некоторые специфические типы экзогенного повреждения ДНК связаны со специфическими паттернами мутаций, также называемыми мутационными сигнатурами. Например, преобладание переходов C A, обусловленное действием полициклических углеводородов табачного дыма, характерно для немелкоклеточного рака легкого [48]. При меланоме ультрафиолетовое излучение создает димеры пиримидина, что приводит к высокой распространенности переходов C T на нетранскрибируемой цепи ДНК [49].
Спонтанные мутации появляются постоянно в ходе процессов, происходящих в живой клетке. Основные процессы, приводящие к возникновению мутаций - репликация ДНК, нарушения репарация ДНК и генетическая рекомбинация. Многие спонтанные химические изменения нуклеотидов приводят к мутациям, которые возникают при репликации. Из процессов, связанных с рекомбинацией, наиболее часто приводит к мутациям неравный кроссинговер.
Спонтанные повреждения ДНК встречаются довольно часто, такие события происходят в каждой клетке. Для устранения последствий подобных повреждений имеется специальные репарационные механизмы (например, ошибочный участок ДНК вырезается и на этом месте восстанавливается исходный). Мутации возникают лишь тогда, когда репарационный механизм по каким-то причинам не работает или не справляется с устранением повреждений. Дефект системы репарации ДНК является одним из основных драйверов геномной нестабильности. Мутации, возникающие в генах белков, ответственных за репарацию, могут приводить к многократному повышению (мутаторный эффект) или понижению (антимутаторный эффект) частоты мутирования других генов. Так, мутации генов многих ферментов системы эксцизионной репарации приводят к резкому повышению частоты соматических мутаций у человека, а это, в свою очередь, приводит к развитию пигментной ксеродермы и злокачественных опухолей покровов. Специфические мутационные сигнатуры были идентифицированы в опухолях с эндогенными дефектами системы репарации ДНК, например, BRCA1-или BRCA2-ассоциированный серозный овариальный рак и тройной-негативный рак молочной железы поздних стадий, который характеризуется частой потерей гетерозиготности [50, 51], колоректальный рак, характеризующийся нарушением системы репарации ДНК [52], связанный с микросателлитной нестабильностью и высокой мутационной нагрузкой (МН) и POLE-дефицитный рак эндометрия, который характеризуется высоко мутированным фенотипом [53].
Неоантигены
Клиническая значимость Т-клеток в борьбе с различными типами опухолей человека в настоящее время не вызывает сомнений. Однако природа антигенов, позволяющих иммунной системе отличать опухолевые клетки от нормальных, долгое время оставалась неясной. Последние достижения науки и технологий позволили проанализировать иммунный ответ на специфические для пациента неоантигены, которые возникают в результате онко-ассоциированных мутаций. Распознавание таких неоантигенов является одним из основных механизмов действия иммунотерапии при лечении опухолей. Число неоантигенов является потенциальным биомаркером для иммунотерапии и может быть использовано для разработки новых терапевтических подходов, которые избирательно повышают реактивность Т-клеток против этого класса антигенов.
Иммунотерапия, повышающая способность эндогенных Т-клеток разрушать опухолевые клетки, показала эффективность при различных злокачественных опухолях человека. Показано, что лечение ипилимумабом, антителом человека, связывающим антиген CTLA-4 цитотоксичных Т-клеток (иммунная контрольная точка), улучшает общую выживаемость пациентов с метастатической меланомой [128]. В работе C. S. Hinrichs с коллегами показано, что инфузия аутологичных ex vivo лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль, может индуцировать объективные клинические реакции при метастатической меланоме [129], при этом часть этой клинической активности обусловлена цитотоксичными Т-клетками [130]. Испытания антител, которые блокируют взаимодействие белков PD-1 и PD-L1, располагающихся на поверхности Т-клеток и опухолевых клеток, соответственно -еще одной контрольной точки иммунитета, показали клиническую эффективность при меланоме, раке легких, мочевого пузыря, желудка, головы и шеи, почек и лимфоме Ходжкина [131].
Эндогенный Т-клеточный компартмент способен распознавать пептидные эпитопы, которые презентируются молекулами главного комплекса гистосовместимости (MHC) на поверхности опухолевых клеток. Теоретически такие эпитопы могут быть получены из двух классов антигенов. Первый класс потенциальных опухолевых антигенов образуется немутированными белками (самоантигенами), к которым толерантность Т-клеток является неполной, например, из-за их ограниченного паттерна экспрессии в тканях. Второй класс потенциальных опухолевых антигенов формируется пептидами, которые полностью отсутствуют в нормальных клетках человека, так называемыми неоантигенами. Для большой группы опухолей человека без вирусной этиологии такие неоэпитопы создаются исключительно опухолеспецифическими изменениями ДНК, которые приводят к образованию новых белковых последовательностей. Для вирус-ассоциированных опухолей, таких как рак шейки матки и рак головы и шеи, неоэпитопы образуются в результате активности вирусного генетического материала. Неоантигены имеют потенциальную клиническую значимость, поскольку, например, показано, что распознавание неантигенов CD4+ Т-клетками является частым событием при меланоме [132, 133].
Новые гены с высокой частотой мутаций при КПГ
На основании данных секвенирования экзома 52 образцов КПГ (выборка № 1) с использованием алгоритма MutSigCV проведен поиск генов, характеризующихся высокой частотой мутаций - потенциальных драйверных генов. Этот алгоритм позволяет минимизировать ошибки, которые могут возникать при анализе больших массивов данных. Например, при больших размерах выборки в список значимых генов могут попасть гены со специфической функцией или гены, кодирующие протяженные белки. Число ложноположительных и ложноотрицательных результатов возрастает с увеличением размера выборки или частоты фоновых мутаций (например, при меланоме и раке легкого), анализируемой с использованием стандартных алгоритмов обработки данных. В первом случае это связано со снижением порога статистической значимости, в последнем - с завышенной базовой частотой мутаций. Кроме того, частота мутаций в разных областях генома различается и коррелирует с уровнем экспрессии и временем репликации ДНК [48]. Это необходимо учитывать при поиске значимых генов. Например, известные онко-ассоциированные гены имеют более высокий уровень экспрессии (по сравнению с «ложными» генами) и более раннее время репликации [164]. Алгоритм MutSigCV учитывает эти параметры и позволяет наиболее точно выявлять гены, ассоциированные с заболеванием. С помощью MutSigCV идентифицировано 34 гена, которые могут быть вовлечены в патогенез КПГ: MADCAM1, SARM1, ZFPM1, CTDSP2, DSPP, POTED, ANP32B, FRG2B, BAGE3, CCDC89, ACOT2, KRTAP10-1, ATXN1, GXYLT1, MUC2, AQP7, TMPRSS13, KRTAP4-3, PRR21, PSPH, PLBD1, ZNF595, IGSF3, PRR16, FAM157A, KCNJ12, HYDIN, IGFBP2, KIAA1671, DISC1, MUC6, XKR3, HRNR и MUC4.
С помощью баз данных KEGG и Gene Ontology проанализированы функции генов и биологические процессы, в которые вовлечены выявленные гены (Таблица 3.1). Многие из этих генов участвуют в различных метаболических путях, дифференцировке, адгезии, росте и миграции клеток, иммунном ответе и гомеостазе, изменения в которых часто связаны с развитием опухолей (Рисунок 3.1). Для части идентифицированных генов (FAM157A, PRR21, FRG2B, POTED, BAGE3, CCDC89, ZNF595, KIAA1671 и XKR3) функции в базах данных KEGG и GO не описаны.
Герминальные и соматические варианты в известных генах, ассоциированных с параганглиомами/феохромоцитомами
Параганглиомы/феохромоцитомы могут быть ассоциированы с герминальными и соматическими вариантами по меньшей мере в 42 известных генах [12]. В исследуемой выборке 6 пациентов с КПГ патогенные и потенциально патогенные соматические варианты обнаружены в генах SDHD (Pat103), TP53 (Pat103 и Pat104), EPAS1 (HIF2A) (Pat104) и SETD2 (Pat105). Выявлено несколько патогенных и потенциально патогенных герминальных вариантов в генах SDHB, SDHC, SDHD и RET. Большинство из них идентифицированы в генах SDHx, которые часто ассоциированы с наследственными параганглиомами/феохромоцитомами. Два варианта наблюдались в гене SDHB у разных пациентов (Pat101 и Pat102): новый миссенс-вариант NM_003000.2: c.463C A, p.Pro155Thr (chr1:17354321) и нонсенс-вариант NM_003000.2: c.136C T, p.Arg46 (chr1:17371320, rs74315370). Последний описан в базах данных dbSNP и ClinVar как патогенный герминальный вариант, ассоциированный с синдромом наследственной предрасположенности к раку, параганглиомами/феохромоцитомами и стромальной опухолью желудочно кишечного тракта [237-240]. Примечательно, что этот вариант ранее был выявлен у пациентов с агрессивной экстраадренальной параганглиомой в грудной клетке и КПГ, и рассматривался как фактор высокого риска злокачественности или рецидива при параганглиомах/феохромоцитомах [241-244]. Действительно, исследуемый пациент (Pat101) характеризовался рецидивом опухоли, указывающим на агрессивный фенотип КПГ. Вариант NM_003001.3: c.149G A, p.Arg50His (chr1:161298257, rs769177037) в SDHC идентифицирован у пациента Pat102 и описан в dbSNP как вариант с неопределенной клинической значимостью. Варианты в гене SDHC встречаются реже при параганглиомах/феохромоцитомах, чем варианты в генах SDHB или SDHD. Таким образом, у Pat102 выявлено четыре потенциально патогенных варианта - два герминальных в генах SDHB и SDHC и два соматических в генах GRIK1 и NT5DC2. Вероятно, развитие КПГ может быть вызвано кумулятивным эффектом нескольких высоко- или невысокопатогенных вариантов [22]. В данном конкретном случае, по-видимому, основным драйвером является патогенный герминальный вариант в гене SDHB.
Герминальный вариант NM_003002.3: c.305A G, p.His102Arg (chr11:111959726, rs104894302) в SDHD идентифицирован у двух пациентов (Pat100 и Pat104). Этот вариант описан в базах данных dbSNP и ClinVar как патогенный герминальный вариант, ассоциированный с синдромом наследственной предрасположенности к раку, параганглиомами/феохромоцитомами, стромальной саркомой желудка и синдромом Коудена 3 [14, 245]. Также этот вариант обнаружен при злокачественной КПГ [246]. Данных об агрессивном поведении опухоли у обследованных пациентов не поступало. Один пациент (Pat104) характеризовался множественными опухолями (ВПГ и КПГ). У этого пациента (Pat104) также обнаружены патогенные и потенциально патогенные соматические варианты в гене T P53.
У одного пациента (Pat103) обнаружен герминальный вариант NM_020975.4: c.1946C T, p.Ser649Leu (chr10:43609994, rs148935214) в протоонкогене RET. В базе данных ClinVar описан другой аллель этого варианта с противоречивыми данными интерпретации патогенности, обнаруженный при синдроме наследственной предрасположенности к раку (неопределенная значимость) и множественной эндокринной неоплазии 2 типа (неопределенная значимость/вероятно доброкачественный), характеризующийся медуллярной карциномой щитовидной железы, феохромоцитомами и гиперпаратиреозом [247-249]. У этого пациента также идентифицированы патогенные и потенциально патогенные соматические варианты в гене TP53 (NM_000546. 5: c. 842A T, p. Asp281Val (chr17:7577096, rs587781525) и NM_000546.5: c.A170A G, p. Asp57Gly ( chr17:7579517).
Интересно, у пациента Pat105 с наибольшим количеством выявленных соматических вариантов и наибольшей мутационной нагрузкой не выявлено патогенных или потенциально патогенных герминальных вариантов. Однако идентифицировано два соматических варианта в гене SETD2. Этот ген кодирует гистонметилтрансферазу, которая является эпигенетическим модификатором и опухолевым супрессором [250]. Мутации в SETD2 обнаружены при многих опухолях, включая новообразования центральной нервной системы [251].