Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы - 12
1. Однонитевые разрывы днк - 12
2. Повреждения днк в хроматине - 18
3. Репарация однонитевых разрывов днк - 20
4. Транскрипция хроматина рнкп ii - 21
5. Эффект однонитевых разрывов днк на транскрипцию рнкп ii - 28 материалы и методы - 33
Реактивы - 33
1. Ферменты и белковые комплексы - 33
2. Культуры клеток - 33 3.
4. Буферные растворы и многокомпонентные реактивы - 34
5. Коммерческие ферменты - 34
6. Готовые наборы реактивов - 34
7. Синтетические олигонуклеотиды - 35
8. Оборудование - 36
9. Методы - 36
9.1. Общая схема эксперимента - 36
9.2. Экспериментальная система - 37
9.3. Электрофоретические методы - 38
9.4. Амплификация фрагментов днк методом полимеразной цепной реакции (пцр) -39
9.5. Очистка нуклеиновых кислот фенолом - 40
9.6. Ход эксперимента - 40
9.6.1. Получение днк-матриц с заданной нуклеотидной последовательностью на основе существующей днк-матрицы - 40
9.6.2. Получение фрагментов днк с интересующей последовательностью нуклеотидов для транскрипционных опытов - 44
9.6.3. Внесение позиционированных однонитевых разрывов во фрагменты днк для транскрипционных опытов - 44
9.6.4. Сборка нуклеосом - 45
9.6.5. Транскрипция нуклеосом рнк-полимеразой e. Coli in vitro - 45
9.6.6. Получение рнк-маркера для анализа длин продуктов транскрипции - 47
9.6.7. Получение днк-маркера для анализа длин продуктов транскрипции - 47
9.6.8. Анализ распределения транскриптов по длинам методом электрофоретического разделения в пааг в денатурирующих условиях
2 9.7. Построение примерной молекулярной структуры комплекса эк+24 с разрывом
Нематричной цепи в положении +12 нпп - 48
Результаты и обсуждение - 49
1. Введение - 49
2. Экспериментальная система - 49
3. Позиционированный однонитевой разрыв нематричной цепи днк может вызывать дискретную нуклеосом-специфичную остановку рнк-полимеразы - 56
4. Особенности остановок рнк-полимеразы на разрывах нематричной цепи нуклеосомной днк - 65
5. Предполагаемый механизм нуклеосом-специфичной остановки рнк-полимеразы на разрыве нематричной цепи днк - 71
6. Обсуждение предполагаемых функций внутринуклеосомных петель днк - 74
7. Обнаружение разрывов нематричной цепи с помощью внутринуклеосомных петель днк - 78
Заключение - 81
Выводы - 82
Список использованной литературы - 83
Приложения - 95
Благодарности - 99
- Повреждения днк в хроматине
- Буферные растворы и многокомпонентные реактивы -
- Электрофоретические методы
- Анализ распределения транскриптов по длинам методом электрофоретического разделения в пааг в денатурирующих условиях
Введение к работе
Актуальность проблемы:
Геном клетки постоянно подвергается разрушающему воздействию
окружающей среды. Раннее выявление и восстановление повреждений ДНК имеет большое значение для функционирования и выживания клеток.
Одними из самых частых повреждений ДНК оказываются однонитевые разрывы. В клетках млекопитающих такие нарушения распознаются белком поли(АДФ-рибоза)-полимеразой 1 (poly (ADP-ribose) polymerase 1, PARP1), и удаляются системой эксцизионной репарации оснований (base excision repair, BER). В ядрах эукариотических клеток ДНК упакована в хроматин – сложную надмолекулярную структуру, формирующуюся с участием большого числа белков-гистонов, мономером которой является нуклеосома. Многие исследования показали, что организованная в нуклеосомы ДНК менее доступна для белков репарации, поэтому можно предположить, что часть включенных в хроматин разрывов будут скрыты от сенсорного белка PARP1.
Разрывы матричной цепи ДНК блокируют транскрипцию РНК-полимеразой II (РНКП II) in vivo и in vitro. Так как остановка РНКП II служит сигналом для начала процесса эксцизионной репарации нуклеотидов, ассоциированной с транскрипцией (TC-NER), то часть скрытых в хроматиновой структуре разрывов может быть репарирована по такому пути. Тем не менее, разрывы, локализованные в нематричной цепи ДНК, не влияют существенно на транскрипцию свободной от гистонов ДНК in vitro, хотя они эффективно устраняются in vivo.
При умеренном уровне транскрипции РНКП II элонгация через хроматин происходит по сложному механизму с сохранением гистонов на ДНК. Таким образом, можно предположить, что нуклеосомная структура способна повлиять на процесс элонгации через ДНК с повреждениями. Эта возможность ранее была оценена соавтором Н.А. Пестовым с помощью мононуклеосомных ДНК, содержащих случайные однонитевые разрывы ДНК в нематричной цепи. Оказалось, что такие разрывы заметно влияют на скорость транскрипции через нуклеосомы, но не
свободной от гистонов ДНК. Особенности такого влияния и его механизм стали предметом настоящего исследования.
Цель исследования:
Определить особенности и механизм действия разрывов нематричной цепи на эффективность транскрипции нуклеосомной ДНК по РНКП II – зависимому механизму.
Задачи исследования:
Спроектировать и получить точно позиционированные нуклеосомы для транскрипции, содержащие одиночные однонитевые разрывы нематричной цепи ДНК в различных положениях на нуклеосом-позиционирующей последовательности. Провести эксперименты по транскрипции полученных матриц модельной РНК-полимеразой Escherichia coli в различных экспериментальных условиях. По распределению остановок модельной РНК-полимеразы сделать выводы об особенностях и предполагаемому механизму влияния разрывов нематричной цепи на транскрипцию нуклеосомной ДНК.
Положения и результаты, выносимые на защиту:
-
Одиночные разрывы нематричной цепи ДНК могут вызывать высокоэффективную, нуклеосом-специфичную остановку РНК-полимеразы E. coli при транскрипции.
-
Остановка РНК-полимеразы E. coli при транскрипции нуклеосом в присутствии одиночного разрыва нематричной цепи ДНК происходит после того, как активный центр фермента миновал положение разрыва и находится на расстоянии 7-12 п.н. от него.
-
Позиции остановок РНК-полимеразы E. coli при транскрипции нуклеосом в присутствии одиночных разрывов нематричной цепи ДНК дискретны и имеют 10-п.н. периодичность.
-
Определены три позиции остановок РНКП E. coli (+24, +34, +44 п.н. относительно ближайшей к промотору границы нуклеосомы).
-
Эффективность остановки РНК-полимеразы E. coli зависит от положения разрыва нематричной цепи в нуклеосоме.
-
Характер остановки РНК-полимеразы при транскрипции нуклеосом в присутствии одиночных разрывов нематричной цепи ДНК позволяет предположить, что остановка вызвана формированием небольших внутринуклеосомных петель ДНК.
-
Полученные данные позволяют предположить, что формирование небольшой внутринуклеосомной петли ДНК приводит к накоплению напряжений в двойной спирали при вращении РНК-полимеразы, облегчающих транскрипцию нуклеосом.
-
Полученные данные позволяют предположить, что разрывы нематричной цепи ДНК вызывают релаксацию напряжений двойной спирали, накопленных при прохождении РНК-полимеразы и облегчающих транскрипцию нуклеосом.
Научная новизна работы:
В работе впервые показано, что разрывы нематричной цепи ДНК, в
зависимости от их расположения в нуклеосомной структуре, могут вызывать почти
полную остановку РНК-полимеразы. Обнаруженный эффект является хроматин-
специфичным и не наблюдается на свободной от гистонов ДНК. Известно, что
остановка РНКП II in vivo служит сигналом к началу транскрипционно-зависимой
ветви эксцизионной репарации нуклеотидов. Таким образом, в ходе исследования
впервые получены данные, позволяющие предположить существование хроматин-
специфичного, транскрипционно-зависимого механизма, обеспечивающего
обнаружение разрывов нематричной цепи ДНК, которые в противном случае
оказываются скрытыми в нуклеосомной структуре и недектируемыми другими
системами репарации. Настоящая работа демонстрирует принципиальную
возможность нуклеосом-специфичного узнавания повреждений ДНК и открывает
новую тематику в области исследований репарации хроматина.
Практическая значимость:
Не устраненные однонитевые разрывы ДНК препятствуют процессам
транскрипции, репликации и репарации ДНК, индуцируют накопление двунитевых
разрывов ДНК, увеличивают нестабильность генома и могут приводить к апоптозу.
Нарушения работы систем репарации однонитевых разрывов приводят к развитию серьезных нейродегенеративных заболеваний. При дальнейшем развитии тематики и показанном эффекте разрывов нематричной цепи на эффективность транскрипции РНКП II in vivo могут быть найдены или спроектированы химические соединения, воздействующие на изучаемый механизм. Таким образом, настоящее исследование актуально как для фундаментальной, так и для прикладной науки.
Достоверность результатов диссертации обеспечивается корректным
использованием современных широко применяемых биохимических методов
исследования.
Личный вклад автора состоял в обзоре имеющихся данных литературы,
самостоятельной постановке экспериментов, обработке и интерпретации результатов
экспериментов, представлении и апробации результатов исследования на
конференциях, подготовке научных публикаций по выполненной работе.
Апробация работы:
Материалы работы были представлены на конференциях: 50-й международной ежегодной конференции FEBS-EMBO, Франция, Париж, 2014; XXI и XXII Международных научных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов», Россия, Москва, 2014 и 2015; международной конференции Института молекулярной биологии г. Майнц (IMB) «DNA Repair and Genome Stability in a Chromatin Environment», Германия, Майнц, 2015; международной конференции молодых ученых «Molecular Control of Gene Expression», Россия, Москва, 2015.
Публикации:
По результатам диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 4 статьи в российских рецензируемых журналах, входящих в перечень ВАК РФ, 1 статья в международном журнале, входящем в базу данных PubMed, и 6 материалов российских и международных конференций.
Структура и объем диссертации:
Диссертация изложена на 104 страницах машинописного текста и состоит из списков использованных сокращений и терминов, введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их
обсуждения, заключения, выводов, списка цитируемой литературы, приложений и благодарностей. Работа содержит 31 рисунок и 1 таблицу. Библиография включает 119 названий.
Повреждения днк в хроматине
Ранее было показано, что PARP1 как минимум на порядок менее эффективно связывает неповрежденную нуклеосомную ДНК, чем свободную от гистонов [Clark et al., 2012]. Таким образом, связывание домена ZF1 заметно ухудшается при организации ДНК в хроматин. Исходя из модели механизма распознавания однонитевых разрывов белком PARP1, предложенной в [Eustermann et al., 2011; Ali et al., 2012] и представленной на рисунке 2, обнаружение и связывание по крайней мере некоторых разрывов ДНК в нуклеосомной структуре будет пространственно затруднено.
Некоторые не поддающиеся детекции разрывы могут быть обнаружены процессивными ферментами, перемещающимися вдоль ДНК. В частности, разрывы матричной цепи ДНК блокируют транскрипцию РНК-полимеразой 2 (РНКП II) in vivo и in vitro [Zhou, Doetsch, 1993; Kathe et al., 2004]. Остановка РНКП II служит сигналом для начала процесса эксцизионной репарации нуклеотидов, ассоциированной с транскрипцией (transcription-coupled nucleotide excision repair, TC-NER). Таким образом, в транскрипционно активных клетках, остановка РНКП II может служить сигналом к репарации однонитевого разрыва матричной цепи транскрибируемого участка ДНК [Fousteri, Mullenders, 2008]. Тем не менее, разрывы, локализованные в нематричной цепи ДНК (NT-SSBs), не влияют существенно на транскрипцию свободной от гистонов ДНК in vitro [Belotserkovskii et al., 2013], хотя они эффективно устраняются in vivo [Bielas, 2006; Dorazi et al., 2007].
Несмотря на то, что на глобальном уровне удаление однонитевых разрывов происходит через активацию системы BER, есть некоторые свидетельства, что путь TC-NER также может быть задействован при репарации однонитевых разрывов [Flohr et al., 2003; Khobta et al., 2010]. Так, для удаления некоторых однонитевых разрывов ДНК оказывается необходимой активность белка CSB (Cockayne syndrome group B), действие которого характерно и специфично для транскрипционно-зависимого пути NER [Fousteri, Mullenders, 2008].
Из-за протекторных свойств ДНК-связывающих белков, повреждения чаще происходят в менее конденсированном хроматине. Недавно было показано, что доступность ДНК может довольно значительно сказываться на интенсивности повреждения [Strand et al., 2014]. Таким образом, под ударом находятся активно открытые участки генома и транскрибируемые гены, тем не менее уровень мутаций в этих участках оказывается ниже, чем в участках высококонденсированного хроматина [Teytelman et al., 2008; Schuster-Bckler, Lehner, 2012]. Это увеличивает роль транскрипционно-зависимой ветви NER (transcription-coupled NER, TC-NER), сигналом для начала которой служит остановка РНКП II на повреждении.
Абсолютное большинство генов транскрибируется РНКП II. При высоком уровне транскрипции происходит потеря нуклеосом, в то время как при умеренном уровне транскрипции РНКП II сохраняется нуклеосомная структура генов. РНКП II сравнима по размеру с нуклеосомой, поэтому механизм транскрипции РНКП II через нуклеосому представляет собой фундаментальный интерес для понимания процессов регуляции транскрипции и сохранения гистонового «кода».
Транскрипция – это ферментативный синтез РНК на матрице ДНК. Она осуществляется ДНК-зависимыми РНК-полимеразами и происходит при участии белковых факторов, выполняющих различные функции. Прокариоты имеют одну РНК-полимеразу (РНКП), ответственную за транскрипцию всех типов РНК. Эукариотические организмы имеют одну митохондриальную и как минимум ядерных РНК-полимеразы (1, 2 и 3), каждая из которых участвует в синтезе разных типов клеточных РНК.
Процесс транскрипции состоит из нескольких этапов: связывания промотора РНК-полимеразой, инициации, элонгации и терминации. Регуляция транскрипции – ключевой момент в клеточном развитии. Каждый из этапов (особенно первые три) в той или иной степени регулируется с участием различных генетических и эпигенетических механизмов.
О транскрипции хроматина РНК-полимеразой 1, ответственной за синтез рибосомных РНК, кроме 5S рРНК, известно крайне мало. РНК-полимераза III (РНКП III) участвует в транскрипции тРНК, 5S рРНК, U6 мяРНК и ряда других малых РНК. Считается, что абсолютное большинство генов, транскрибируемых третьей эукариотической РНК-полимеразой, довольно короткие, и они все время покрыты транскрипционными факторами, мешающими посадке нуклеосом [Gerlach et al., 1995]. Тем не менее, механизм, характерный для РНКП III и РНК-полимеразы бактериофагов SP6 и Т7, отличается внутриматричным переносом октамера гистонов с находящейся впереди ДНК на пройденную без потери/обмена гистонов H2A-H2B, и относительно низким нуклеосомным барьером [Studitsky et al., 1995; Studitsky et al., 1994; Studitsky et al., 1997; Bednar et al., 1999].
Большинство клеточных некодирующих регуляторных РНК и все мРНК синтезируются РНКП II. Наиболее изученной в отношении механизма элонгации через нуклеосомы сейчас является РНК-полимераза II.
РНК-полимераза II (РНКП II) представляет собой гетеромультимерный комплекс общей массой более 500 кДа, состоящий из 12 различных субъединиц [Meyer et al., 2006]. Во время транскрипции РНКП II делает полный оборот каждые 10 п.н. вдоль спирали ДНК, двигаясь через сильно компактизованную структуру хроматина [Gnatt et al., 2001]. Нуклеосомная упаковка хроматина существенно затрудняет как доступ ферментов и факторов транскрипции к ДНК, так и движение транскрибирующей РНКП II. Таким образом, расположение нуклеосом регулирует доступность ДНК, препятствуя или способствуя связыванию транскрипционных факторов и РНК-полимераз [Zhao et al., 2001; Whitehouse et al., 2007; Lam et al., 2008; Boeger et al., 2008; Petesch, Lis, 2008; Kim, O Shea, 2008]. Несмотря на то, что хроматин удаляется при активации генов в живых клетках, кодирующие области умеренно транскрибируемых генов остаются упакованными в нуклеосомы [Hartzog et al., 2002]. Нуклеосомы могут быть временно удалены из эукариотических генов при высоком уровне транскрипции [Lee et al., 2004; Kristjuhan, Svejstrup, 2004; Schwabish, Struhl, 2004], но большинство транскрибируемых генов сохраняют нуклеосомную организацию, и, таким образом, как правило, РНКП II сталкивается с нуклеосомами во время элонгации.
Элонгация протяженных участков ДНК (до более сотен тысяч п.н.), организованных в нуклеосомы, происходит с высокой скоростью (3-4 тысячи п.н. в минуту [Singh, Padgett, 2009]). Подобная скорость транскрипции наблюдается in vitro на ДНК, свободной от гистонов [Izban, Luse, 1992; Cheng, Price, 2007].
Каким образом РНКП II преодолевает нуклеосомный барьер во время транскрипции? Схема, обобщающая результаты многолетних исследований, представлена на рисунке 5 [Kulaeva et al., 2013]. При приближении (комплекс 1) и вхождении в нуклеосому РНКП II (комплекс 2), происходит частичное разворачивание ДНК, находящейся сзади фермента от октамера гистонов [Kulaeva et al., 2009]. Прохождение барьера опосредуется с помощью формирования в +49 положении внутринуклеосомной петли ДНК очень небольшого размера (нулевой петли, рисунок 5, комплекс 3). Название нулевой петли данная структура получила вследствие своих малых размеров. В данном комплексе сохраняются исходные, «пре-транскрипционные» ДНК-гистоновые взаимодействия как в области, находящейся перед транскрибирующей РНКП II, так и в области, уже пройденной ферментом. Следует отметить ряд особенностей элонгационного комплекса, содержащего нулевую петлю, выявленных анализом модели комплекса высокого разрешения [Kulaeva et al., 2009]. Важно отметить, что структура ЭК +49 несовместима с наличием двух витков нуклеосомной ДНК; в такой структуре один ДНК виток должен быть вытеснен. В результате формирования нулевой петли происходит стерическое вытеснение и разворачивание нуклеосомной ДНК по ходу движения РНКП II и облегчение дальнейшей транскрипции (рисунок 5, комплекс 4). Затем происходит реформирование исходных ДНК-гистоновых взаимодействий и восстановление структуры нуклеосом после прохождения их РНКП II.
Буферные растворы и многокомпонентные реактивы -
Однонитевые разрывы – одни из самых частых повреждений ДНК. Они могут препятствовать процессу транскрипции, вызывая остановку РНК-полимеразы на обрыве матричной цепи. Согласно предварительным данным, полученным в лаборатории, вопреки ожиданиям, разрывы нематричной цепи ДНК также способны заметно ингибировать РНК-полимеразу. Однако это происходит только в том случае, когда поврежденная ДНК организована в хроматиновую структуру. Видимо, такой эффект связан со сложным механизмом транскрипции РНКП II через нуклеосому. Для того чтобы определить некоторые особенности и сделать предположения о механизме обнаруженного эффекта, необходимо провести дополнительные исследования. Было выяснено, что разрывы нематричной цепи могут оказывать как ускоряющее, так и замедляющее действие на транскрипцию нуклеосом. Так как остановка элонгирующей РНКП II in vivo служит сигналом к началу репарации, то ингибирующий эффект разрывов более интересен с биохимической точки зрения.
Экспериментальная система Для изучения механизма замедления транскрипции РНК-полимеразой II через нуклеосому разрывами нематричной цепи ДНК была выбрана экспериментальная система, основанная на мононуклеосомах с точно позиционированными однонитевыми разрывами. Как было показано ранее, наиболее заметное замедляющее воздействие оказывают разрывы около (+10 – +13) положения нуклеосом-позиционирующей последовательности относительно близлежащей к промотору границы нуклеосомы (рисунок 6, Б). Поэтому для первого эксперимента были выбраны мононуклеосомы с разрывом сахарофосфатного остова между 12 и 13 нуклеотидными остатками НПП (разрыв +12) (рисунок 9). Разрывы предполагалось вносить коммерчески доступной никазой Nt.BsmA1. Никазы – модифицированные эндонуклеазы рестрикции, в которых дезактивирован один из активных центров. Эти ферменты взаимодействуют со специфической последовательностью ДНК, но разрушают только одну из цепей.
Схема расположения исследуемых однонитевых разрывов ДНК в нуклеосоме. Все разрывы расположены в нематричной цепи (выделенной голубым цветом). Пунктирной стрелкой указано направление транскрипции. Рисунок нуклеосомы получен в программе Cn3D с использованием структуры 1EQZ («X-ray structure of the nucleosome core particle at 2,5 A resolution», [Harp et al., 2000]).
На первом этапе работы на основе 603 НПП была разработана и получена ДНК-матрица с последовательностью узнавания фермента Nt.BsmA1 в соответствующем участке НПП. Этапы получения ДНК-матрицы и результаты работы показаны на рисунках 10 и 11. Сначала были получены фрагменты, содержащие промоторный и измененный нуклеосом-позиционирующий участки (рисунок 10, А). После обработки эндонуклеазой рестрикции ApaI фрагменты лигировали, получив смесь полноразмерных матриц ожидаемой длины с искомой и первичной последовательностью нуклеотидов. Количество полноразмерных фрагментов увеличили ПЦР-амплификацией, продукты реакции (рисунок 10, Б) лигировали в вектор pTZ57R и клонировали в E. coli. В результате была получена плазмида pTZ57R со вставкой с ожидаемой последовательностью нуклеотидов длиной 282 п.н. (рисунок 10, В; нуклеотидная последовательность приведена в приложении, плазмида pTZ57R-(+12_603)). Этап молекулярного клонирования был введен для дополнительного контроля нуклеотидной последовательности конечной ДНК-матрицы для опытов по транскрипции.
Методом ПЦР на матрице pTZ57R-(+12_603) были получены фрагменты ДНК, включающие промотор T7A1 и модифицированную НПП (рисунок 11, А и Б). Для контроля эффективности никирования в 5 -конец нематричной цепи в составе затравочного олигонуклеотида ввели флуоресцирующее соединение FAM. В дальнейшей работе использовали только фрагменты, для которых эффективность внесения разрыва была не ниже 95% (рисунок 11, В и Г). При этом матричная цепь и вся молекула в целом сохраняли первоначальную длину (рисунок 11, Г). На полученных ДНК методом ступенчатого диализа против растворов с понижающейся ионной силой в присутствии донорного хроматина были собраны нуклеосомы (рисунок 11, Д и Е). Продукты диализа имели три преобладающих типа структур – свободную от гистонов ДНК, мононуклеосомы и динуклеосомы. В случае образования динуклеосомной струткуры второй гистоновый октамер взаимодействует с промоторным участком. На таких фрагментах не происходит инициация транскрипции, поэтому они не изменяют результаты транскрипционных экспериментов. Условия процедуры подбирали так, чтобы минимизировать количество свободной ДНК. В дальнейшей работе использовали только смеси, содержащие не менее 80% мононуклеосом относительно суммарного количества мононуклеосом и свободной ДНК. Оценку количества проводили в программе GelQuant по снимку геля в канале сигнала FAM при сохранении линейного диапазона нарастания сигнала при увеличении количества ДНК.
Получение ДНК-матрицы, содержащей последовательность узнавания фермента Nt.BsmA1 для никирования в положении +12 НПП. На первом этапе были получены промоторный и нуклеосом-позиционирующий ДНК фрагменты с модифицированной последовательностью нуклеотидов («промотор» и «НПП»), в качестве матрицы для ПЦР использован полинуклеотид T7A1_s603-25A («матрица»). Затем промоторный и нуклеосом-позиционирующий участки были обработаны эндонуклеазой рестрикции ApaI и лигированы («лигирование»). В продукте лигирования сохраняется рестриктный сайт ApaI («рестр. лиг. смеси») в том же положении, что и в первоначальной ДНК-матрице («рестр. матрицы»). Длины фрагментов совпадают с ожидаемыми. Маркер - GeneRuler 100 bp DNA Ladder (А). Для получения большого количества полноразмерных фрагментов с модифицированной последовательностью нуклеотидов проведена реакция ПЦР амплификации с использованием лигированной смеси в качестве матрицы («ПЦР на лиг. смеси»). Длина фрагмента соответствует ожидаемой (Б). Методом молекулярного клонирования была получена плазмида pTZ57R со встройкой полноразмерного фрагмента с ожидаемой модифицированной последовательностью («плазмида»); маркер – GeneRuler 1kb DNA Ladder (В). Снимки агарозного геля с электрофоретически разделенными фрагментами ДНК, окрашенными бромистым этидием.
Электрофоретические методы
Согласно опубликованным ранее [Kulaeva et al., 2009] и полученным в работе данным внутринуклеосомные петли ДНК, содержащие транскрибирующую РНКП II, могут быть сформированы с высокой эффективностью, по крайней мере, в четырех разных точках (+24, +34, +44 и +49) ближайшей к промотору области нуклеосомной ДНК. Так как петли с заключенной транскрибирующей РНКП эффективно образуются в разных ротационных ориентациях и позициях, то можно предположить, что тенденция поддерживать компактную структуру во время транскрипции (и, возможно, других ДНК-зависимых процессов) является фундаментальным свойством нуклеосом. Склонность к образованию компактных нуклеопротеидных комплексов с большим количеством ДНК-гистоновых взаимодействий, возможно, снижает вероятность потери гистонового октамера во время транскрипции и, таким образом, гарантирует более эффективное выживание нуклеосом. Формирование петель особенно важно до позиции +49, где петля формируется в последний раз и разрешается перед транскрипционным комплексом, в результате чего нуклеосома восстанавливается, а транскрипция эффективно продолжается вдоль ДНК, отвернутой от гистонового октамера [Kulaeva et al., 2009].
Транскрипция правозакрученной двойной спирали ДНК требует вращения РНК-полимеразы вокруг ДНК. Если концы ДНК жестко закреплены, при транскрипции происходит накопление положительной и отрицательной суперспирализации ДНК перед РНК-полимеразой и позади неё, соответственно [Liu, Wang, 1987; Ma et al., 2013]. В условиях живой клетки этот эффект наблюдается в больших доменах хроматина (обзор [Lilley, 1988]). Аналогичные условия для накопления транскрипционно-зависимой суперспирализации ДНК будут присутствовать при формировании небольших внутринуклеосомных петель ДНК - концы ДНК иммобилизованы на поверхности октамера гистонов, и РНК-полимераза не может свободно вращаться из-за небольшого размера петли.
Из-за небольшого размера внутринуклеосомных петель накапливающаяся в них при транскрипции суперспирализация ДНК в первую очередь будет влиять на поворот спирали. Изменения в повороте могут иметь следующие последствия для транскрипции.
Во-первых, для облегчения напряжения от суперспирализации, ДНК-гистоновые взаимодействия перед РНК-полимеразой или позади нее могут быть разрушены, что вызовет открытие петли. Открытие петли по крайней мере частично освободит накопленную суперспирализацию ДНК и, следовательно, будет происходить асимметрично, только на одной стороне петли. +24, +34 и +44 петли открываются позади фермента (рисунок 24 и [Kulaeva et al., 2009]). Интересно, что после формирования петли в положении +49 ДНК-гистоновые взаимодействия разрушаются перед ферментом, несмотря на то, что протяженность контактов позади фермента все еще остается меньше [Kulaeva et al., 2009]. Такое асимметричное открытие петли, скорее всего, объясняется усиленным дестабилизирующим ДНК-гистоновые взаимодействия эффектом положительной суперспирализации ДНК, накопленной перед РНКП (обсуждается в [Studitsky et al., 1997]). Считается, что накапливаемое при транскрипции суперскручивание ДНК служит дополнительным фактором, вызывающим перемещение гистоновых октамеров из положения перед РНК-полимеразой в положение за ней [Studitsky et al., 1997].
Из-за сильного разрушающего эффекта положительной суперспирализации, накопленной перед ферментом, образование более крупных петель РНК-полимеразой III [Studitsky et al., 1997], вероятно, облегчает транслокацию нуклеосом из положения перед ферментом в положение за ним. Ранее были описаны два различных молекулярных механизма элонгации транскриптов в хроматине: РНКП II- и РНКП III-типа. Первый механизм, как описано в Обзоре литературы, характеризуется высоким нуклеосомным барьером для РНКП II, вытеснением/обменом димера гистонов H2A-H2B, и сохранением позиций нуклеосом при транскрипции. Для второго типа характерен более низкий нуклеосомный барьер, сохранение октамера гистонов и его перемещение в направлении, противоположном направлению движения фермента [Kulaeva et al., 2013]. Структуры переходных комплексов, формируемых в процессе транскрипции нуклеосом по механизму РНКП III-типа, были охарактеризованы ранее в литературе и совместно с соавторами Орловским И.В., Чертковым О.В., Логиновой М.А. и Кулаевой О.И. (Приложения, рисунок 30 и [Studitsky et al., 1995; Studitsky et al., 1994; Bednar et al., 1999; Studitskii et al., 2012a; Studitskii et al., 2012b]). Сравнение структур переходных комплексов, формирующихся при транскрипции хроматина по механизмам РНКП II- и РНКП III-типа подробно приведено в [Kulaeva et al., 2013]. При вхождении РНКП II и РНКП III в нуклеосому cначала происходит формирование сходных структур, в частности ДНК, находящаяся за элонгационным комплексом, диссоциирует от поверхности октамера гистонов (рисунок 5, комплекс 2). Предположительно, в процессе транскрипции по механизму РНКП III-типа, с поверхности октамера перед ферментом разворачивается более продолжительный участок ДНК. Таким образом, на ранних этапах транскрипции по механизму РНКП III-типа большая поверхность октамера экспонирована в раствор. Комплексы, содержащие нулевую петлю, формируются лишь на 30% матриц при транскрипции нуклеосом по механизму РНКП III-типа [Bednar et al., 1999]. В остальных комплексах происходит формирование петли большого размера [Studitskii et al., 2012a; Studitskii et al., 2012b]. При дальнейшем перемещении фермента в петле может происходить накопление положительного и отрицательного суперскручивания ДНК впереди и позади фермента, соответственно. Предположительно, из-за более сильного разрушающего действия напряжений от положительной суперспирализации открытие петли происходит ассимметричным образом впереди фермента, что приводит к перемещению октамера гистонов в направлении, противоположном транскрипции [Studitsky et al., 1995; Studitsky et al., 1994; Studitsky et al., 1997].
Кроме того, положительная суперспирализация ДНК, накапливаемая перед РНКП, может вызывать разворачивание октамера гистонов [Lavelle, 2009] и, таким образом, облегчать выживание нуклеосом во время транскрипции и продвижения других процессивных ферментов (например ДНК-полимераз и АТФ-зависимых ремоделирующих хроматин белковых комплексов) вдоль ДНК.
Накопленная отрицательная и положительная суперспирализация ДНК, соответственно, негативно или позитивно влияет на стабильность транскрипционного «пузыря». Этот эффект, вероятно, работает даже после открытия внутринуклеосомных петель, когда положительное суперскручивание накапливается перед ферментом вследствие стерических ограничений на вращение РНК-полимеразы октамером гистонов (рисунок 26).
Анализ распределения транскриптов по длинам методом электрофоретического разделения в пааг в денатурирующих условиях
Взаимодействие между РНКП и нуклеосомой может вызывать формирование топологических замков. При контакте РНК-полимеразы с нуклеосомой (1), образовании внутринуклеосомных петель ДНК (2) или выходе из фермента из нуклеосомы (3), вращение фермента вокруг ДНК ограничено октамером гистонов. Таким образом, при транскрипции участки ДНК между ферментом и октамером заключены в топологические замки. Так как РНК-полимераза представляет собой мощный молекулярный мотор, его вращение вызывает накопление положительного и/или отрицательного суперскручивания ДНК высокого уровня ( ++ и - - соответственно). Показана только половина нуклеосомной ДНК.
Положительные и отрицательные эффекты преобладают в присутствии разрывов, локализованных в промотор-дистальной и проксимальной областях нуклеосомной ДНК, соответственно. Вероятно, общий эффект разрыва нематричной цепи на скорость транскрипции нуклеосомной ДНК, проиллюстрированный в рисунке 6, складывается из суммы эффектов разрыва на паузирование в конкретных положениях НПП.
Обнаружение разрывов нематричной цепи с помощью внутринуклеосомных петель ДНК Как было описано ранее, в случае расположения разрыва позади РНК-полимеразы может происходить очень эффективная остановка фермента с его сохранением в элонгационном комплексе.
Остановка транскрипции РНК-полимеразой II служит сигналом для систем репарации ДНК (см. Обзор литературы), поэтому ингибирующий эффект разрывов нематричной цепи на транскрипцию предполагает их возможную роль в репарации ДНК. Обычно однонитевые разрывы ДНК обнаруживаются белковым фактором PARP1 [Le Cam et al., 1994; Weinfeld et al., 1997; Caldecott, 2008a], но вероятно, организованная в хроматин ДНК менее доступна для PARP1, и по крайней мере некоторые повреждения могут оставаться незамеченными. Действительно, для раковых клеток было показано, что частота мутаций повышена в более закрытых хроматиновых участках и снижена в более открытом хроматине [Schuster-Bckler, Lehner, 2012]. Однонитевые разрывы, локализованные в матричной цепи генов, могут быть непосредственно обнаружены при остановке РНК-полимеразы II во время транскрипции поврежденной ДНК и репарированы по транскрипционно-зависимому механизму эксцизионной системы репарации нуклеотидов [Tijsterman et al., 1999; Wellinger, Thoma, 1997]. Кроме того, в клетках млекопитающих репарация однонитевых разрывов нематричной цепи требует активности CSB, одного из важнейших белковых факторов TC-NER [Khobta et al., 2010], свидетельствуя в пользу того, что путь TC-NER может также участвовать в репарации однонитевых разрывов нематричных цепей кодирующих участков хромосом.
Однако in vitro обнаружить остановку РНКП II на разрыве нематричной цепи при транскрипции свободной от гистонов ДНК не удалось (первый шаг в TC-NER) ([Belotserkovskii et al., 2013] и результаты настоящей работы, рисунки 12 и 19). Наши данные свидетельствуют в пользу того, что структура хроматина позволяет обнаруживать разрывы нематричной цепи, вызывая остановку транскрибирующей РНКП II. Стоит отметить, что изученные в рамках данного исследования разрывы, локализованные в обращенных к гистоновому октамеру участках нуклеосомной ДНК (и, следовательно, наиболее эффективно скрытые от белков репарации; позиции +12, +22 и +31, рисунок 9) индуцируют довольно эффективную остановку РНК-полимеразы, в то время как остановка в присутствии разрыва +17, который обращен к окружающей среде, и, следовательно, может быть доступен другим детектирующим ферментам, может быть преодолена повышением ионной силы. Хотя детальный физический механизм этой особенности не может быть объяснен в рамках настоящего исследования, данные позволяют предположить, что такой эффект может позволять клетке обнаруживать скрытые в структуре нуклеосом разрывы.
Однонитевые разрывы нематричной цепи вызывают эффективную остановку РНКП II, когда они локализованы в ближайшей к промотору области нуклеосомной ДНК (участок длиной около 50 п.н.) (рисунок 6). Как могут быть обнаружены разрывы, локализованные в оставшихся 100 п.н. нуклеосомной ДНК? Нуклеосомы редко занимают строго определенные позиции в естественных условиях [Cole et al., 2012], а позиционирование нуклеосом в ходе транскрипции является динамическим [Hughes, Rando, 2014]. Поэтому положение каждого конкретного разрыва в нуклеосоме, вероятно, будет изменяться. Например, если позиции нуклеосом более менее случайны, в течение каждого раунда транскрипции каждый разрыв нематричной цепи имеет 20-30% вероятность оказаться в 50-п.-н. промотор-проксимальном участке нуклеосомной ДНК и быть обнаруженным транскрибирующей РНКП через петлевой механизм.
В целом, наши данные свидетельствуют о возможности существования хроматин-специфичного механизма обнаружения разрывов нематричной цепи ДНК транскрибирующей РНКП II.