Характеризация противовирусной активности химически синтезированного соединения НИОХ-14 для создания противооспенного препарата Кабанов Алексей Сергеевич

Содержание к диссертации

Введение

1 Обзор литературы: антиортопоксвирусная активность

1.1 Разрабатываемые химические препараты, обладающие антиортопоксвирусным действием 13

1.2 Противовирусная активность препаратов ST-246 и СМХ001 в отношении ортопоксвирусов в экспериментах in vitro и ex vivo 18

1.3 Эффективность препаратов ST-246 и СМХ001 в отношении вирусов эктромелии, оспы коров, оспы кроликов и осповакцины in vivo 27

1.4 Защитная эффективность препаратов ST-246 и СМХ001 при заражении животных вирусами оспы обезьян и натуральной оспы 40

1.5 Некоторые структурные аналоги химического соединения ST-246 и виды их биологической активности 48

1.6 Заключение по обзору литературы 49

2 Материалы и методы 51

2.1 Лабораторные животные 51

2.2 Клеточная культура 51

2.3 Вирусы и определение их концентрации 52

2.4 Исследованные химически синтезированные соединения 52

2.5 Определение цитотоксичности и противовирусной активности химических соединений in vitro 53

2.6 Оценка изменения инфекционности вируса эктроме лии в опытах in vitro под влиянием препаратов НИОХ-14 и ST-246 55

2.7 Определение 50 %-й летальной дозы вирусов оспы коров и эктромелии при интраназальном заражении мышей 55

2.8 Определение 50 %-й инфицирующей дозы вируса оспы обезьян при интраназальном заражении мышей и сурков 56

2.9 Определение 50 %-й инфицирующей дозы вируса натуральной оспы при интраназальном заражении мышей з

2.10 Оценка противовирусного действия препаратов в экспериментах на мышах, инфицированных вирусами оспы коров и эктромелии

2.11 Оценка противовирусного действия препаратов у мышей и степных сурков, инфицированных вирусом оспы обезьян

2.12 Оценка противовирусного действия препаратов у мышей, инфицированных вирусом натуральной оспы

2.13 Определение концентрации ортопоксвирусов в культуральной жидкости и в гомогенатах органов животных.

Гистологические исследования Статистическая обработка результатов

Результаты собственных исследований

Изучение антиортопоксвирусной активности различных химических соединений в экспериментах in vitro и in vivo

Скрининг и оценка противовирусной активности химических соединений в отношении вирусов осповакцины, оспы коров и эктромелии в культуре клеток Vero 3.1.2

Изучение противовирусного действия выбранных химических соединений в отношении вирусов оспы обезьян и натуральной оспы в культуре клеток

Vero Изучение противовирусного действия химических соединений у мышей аутбредной популяции ICR, инфицированных вирусами эктромелии и оспы коров 3.2

Сравнительная оценка противовирусной активности химических соединений НИОХ-14 и ST-в отношении вируса эктромелии in vitro и in vivo

Изучение влияния препаратов НИОХ-14 и ST46 на инфекционность вируса эктромелии в культуре клеток Vero

Изучение противовирусного действия НИОХ-14 и ST-246 у мышей аутбредной популяции ICR, инфицированных вирусом эктромелии

Исследование противооспенной активности химического соединения НИОХ-14 в сравнении с ST-246 в экспериментах in vivo в отношении высокопатогенных для человека ортопоксвирусов 3.3.1 Оценка противовирусного действия химических соединений НИОХ-14 и ST-246 у мышей аутбредной популяции ICR и степных сурков, инфицированных вирусом оспы обезьян 105

3.3.2 Оценка противовирусного действия химических соединений НИОХ-14 и ST-246 у мышей иммунодефицитной линии SCID и аутбредной популяции ICR, инфицированных вирусом натуральной оспы 110

4 Обсуждение результатов 118

Заключение 128

Список сокращений и условных обозначений 131

Список литературы 133

Список иллюстративного материала

• Эффективность препаратов ST-246 и СМХ001 в отношении вирусов эктромелии, оспы коров, оспы кроликов и осповакцины in vivo
• Определение цитотоксичности и противовирусной активности химических соединений in vitro
• Скрининг и оценка противовирусной активности химических соединений в отношении вирусов осповакцины, оспы коров и эктромелии в культуре клеток Vero 3.1.2
• Сравнительная оценка противовирусной активности химических соединений НИОХ-14 и ST-в отношении вируса эктромелии in vitro и in vivo

Введение к работе

Актуальность темы исследования. После завершения на Земле программы глобальной ликвидации натуральной оспы и отмены вакцинации против нее в 1980 году в мире сложилась опасная ситуация, когда более половины населения планеты не имеет иммунитета против ортопоксвирусных инфекций. При этом угроза возникновения натуральной оспы существует до настоящего времени при преднамеренном или случайном распространении возбудителя этого заболевания, источником которого потенциально могут являться:

возможно, существующие нелегальные его хранилища [Henderson et al., 1999; Jahrling et al., 2005; Anderson and Bokor, 2012];

останки людей, умерших от натуральной оспы, при археологических раскопках в мерзлотных грунтах, где вирус может сохраняться длительное время [Biagini et al., 2012; McCоllum et al., 2014];

- искусственно созданный вирус на основе данных первичной структуры его
дезоксирибонуклеиновой кислоты [Parker et al., 2012].

Кроме того, отмечается увеличение в последние десятилетия масштабности и
частоты эпидемических вспышек других ортопоксвирусных инфекций: оспы обезьян и
оспы коров [Damaso et al., 2000; Wienecke et al., 2000; Reed et al., 2004; Favier et al.,
2011]. Вместе с тем, в настоящее время в мире не существует официально
зарегистрированных химиопрепаратов для защиты людей от ортопоксвирусных
инфекций. В связи с этим необходимость обеспечения противооспенной безопасности
людей и животных делает актуальной проблему разработки новых

антиортопоксвирусных препаратов.

Степень разработанности. За последние 50 лет определено несколько субстанций, в той или иной степени обладающих антиортопоксвирусной активностью. К ним относятся тиосемикарбазоны, аналоги нуклеозидов, нуклеотидов, ациклические нуклеозиды и нуклеотиды, интерфероны и их индукторы [De Clercq, 2001; Smee and Sidwell, 2003; Parker et al., 2008]. Однако в настоящее время на стадии клинических испытаний находятся только два современных эффективных и биодоступных при пероральном (п/о) введении противовирусных химических соединения: CMX001 (Brincidofovir, BCV, hexadecyloxypropyl-cidofovir [HDP-CDV]), который является эфирно-липидным аналогом цидофовира, и ST-246 (Tecovirimat, 4-трифторметил-N-(3,3a,4,4a,5,5a,6,6a-октагидро-1,3-диоксо-4,6-етеноциклопроп[f]изоиндол-2(1H)-ил)-бензамид) [Rice et al., 2011; SIGA Technologies Inc., 2011]. При этом оба препарата, являющиеся разработками США и различающиеся по механизмам действия, успешно прошли этапы научно-исследовательских работ и доклинических испытаний, проявив специфическую антиортопоксвирусную активность в экспериментах ex vivo и in vitro на органных культурах, перевиваемых и первичных культурах клеток животных и человека, а также in vivo на разных видах модельных животных. Данный эффект был продемонстрирован при использовании вирусов осповакцины (ВОВ)*, оспы коров (ВОК), эктромелии (ВЭ), а также высокопатогенных для человека вирусов оспы обезьян (ВОО) и натуральной оспы (ВНО). Тем не менее, в связи с возросшей актуальностью принятия мер по защите людей от ортопоксвирусных инфекций и со способностью возбудителей этих заболеваний мутировать и приобретать устойчивость *Список сокращений приведен на обороте автореферата.

к лекарственным препаратам [Smee et al., 2002, 2005; Yang et al., 2005; Kornbluth et al.,
2006, Becker et al., 2008] необходимо проводить поиск новых химических соединений с
различными механизмами действия и создавать на их основе противовирусные
средства новой генерации. В ряде исследований была выявлена серия производных
трицикло[3.2.2.02,4]нон-8-ен-6,7-дикарбоновой кислоты - N-амидов 3,5-диоксо-4-
азатетрацикло[5.3.2.02,6.08,10]додек-11-ен-3,5-диона, проявляющих активность в
отношении ортопоксвирусов [Bailey et al., 2007; Ming-xin et al., 2010; Jordan et al.,
2012]. Поэтому дальнейший поиск и изучение химических соединений, обладающих
высокой антиортопоксвирусной активностью, с целью создания новых

противооспенных препаратов является актуальным.

В связи с этим, в данной работе были поставлены следующие цель и задачи исследования.

Цели и задачи. Провести сравнительное изучение противовирусной активности химически синтезированных соединений, в том числе аналогов ST-246, и выбрать наиболее эффективное соединение в отношении ортопоксвирусов in vitro и in vivo для создания на его основе отечественного противооспенного препарата.

Для достижения данной цели необходимо было решить следующие задачи:

1) провести скрининг и расширенное тестирование in vitro противовирусной
активности различных химических соединений, в том числе производных
трициклодикарбоновой кислоты и конденсированных производных пирролдиона
(аналогов ST-246) в отношении вирусов осповакцины, оспы коров и эктромелии;

2) исследовать противовирусную активность химических соединений,
выбранных по результатам скрининга и расширенного тестирования in vitro, в
экспериментах на культуре клеток Vero в отношении вирусов оспы обезьян и
натуральной оспы;

1. изучить противовирусное действие химических соединений, проявивших высокую антиортопоксвирусную активность in vitro, в экспериментах на мышах аутбредной популяции ICR, инфицированных вирусами оспы коров и эктромелии;

2. провести сравнительное исследование защитной эффективности ST-246 и выбранных химических соединений, наиболее активных в отношении ортопоксвирусов in vivo, в экспериментах на мышах аутбредной популяции ICR и степных сурках, инфицированных вирусом оспы обезьян;

3. изучить протективное действие выбранного наиболее высокоактивного в отношении ортопоксвирусов in vivo химического соединения в сравнении с ST-246 в экспериментах на мышах иммунодефицитной линии SCID и аутбредной популяции ICR, инфицированных вирусом натуральной оспы.

Научная новизна работы. В данной работе впервые исследованы и
проанализированы показатели противовирусной активности в отношении

ортопоксвирусов in vitro более 100 новых производных трициклодикарбоновой кислоты, полициклических гидрированных функциональных производных изоиндола и их аналогов, близких по химической структуре ST-246, синтезированных в НИОХ им. Н.Н. Ворожцова СО РАН. При проведении последовательной оценки показателей 50 %-й ингибирующей концентрации (IC₅₀) химических препаратов в отношении вирусов осповакцины, оспы коров, эктромелии, оспы обезьян и натуральной оспы было выявлено 9 соединений, которые имели значения IC₅₀ меньше 0,5 мкг/мл. Наиболее высокую антиортопоксвирусную активность in vitro проявляло соединение НИОХ-14.

Кроме того, на примере 10 выбранных наиболее активных химических соединений, включая ST-246, с помощью корреляционного анализа показателей IC50 в отношении всех исследованных ортопоксвирусов in vitro впервые была показана их корреляционная связь в диапазоне от средней до очень высокой степени корреляции по шкале Чеддока.

Впервые продемонстрировано, что у мышей аутбредной популяции ICR, интраназально инфицированных вирусом оспы коров (штамм Гришак), сравнимую защитную эффективность при пероральном введении проявили 3 соединения (НИОХ-14, НИОХ-32 и ST-246), судя по снижению летальности и увеличению средней продолжительности жизни относительно контрольной группы мышей. Однако при использовании для заражения мышей этой же популяции естественного для них патогена - вируса эктромелии (штамм К-1) снижение процента гибели и увеличение средней продолжительности жизни, а также уменьшение продукции вируса и патологических изменений в легких инфицированных мышей происходило только при воздействии НИОХ-14 и ST-246, тогда как НИОХ-32 оказался неэффективным.

Впервые проведена сравнительная оценка противовирусного действия химических соединений НИОХ-14 и ST-246 в отношении вируса оспы обезьян (штамм V79-1-005) при использовании разных модельных животных. Обнаружено, что у мышей аутбредной популяции ICR, интраназально инфицированных вирусом оспы обезьян и перорально получавших эти препараты, доля инфицированных мышей и продукция вируса в легких была ниже, чем в контроле. Вместе с тем, пероральное введение НИОХ-14 и ST-246 степным суркам, аналогично инфицированным этим же вирусом, защищало их от развития заболевания, судя по отсутствию внешних оспоподобных признаков, в отличие от контроля.

В экспериментах на мышах иммунодефицитной линии SCID и аутбредной популяции ICR, интраназально инфицированных вирусом натуральной оспы (штамм Ind-3a), впервые показано, что химические соединения НИОХ-14 и ST-246 при их пероральном введении проявляют сравнимую противооспенную эффективность, регистрируемую по уменьшению доли инфицированных животных, продукции вируса и патоморфологических изменений в легких по сравнению с контролем.

В данной работе впервые были исследованы противовирусные свойства химического соединения НИОХ-14, являющегося близким структурным аналогом ST-246 и обладающего патентной чистотой, которое проявляет высокую, сравнимую с ST-246, антиортопоксвирусную активность in vitro и in vivo.

Теоретическая и практическая значимость работы

Теоретическая значимость данной работы заключается в том, что для
достижения цели и выполнения задач нами была разработана и использована
методология поиска, выбора и исследования антиортопоксвирусной активности новых
химических соединений, основанная на последовательной оценке их ингибирующего
действия в отношении слабопатогенных и высокопатогенных для человека
ортопоксвирусов in vitro и in vivo. Благодаря такому подходу нам удалось из более 100
новых производных трициклодикарбоновой кислоты, полициклических

гидрированных функциональных производных изоиндола и их аналогов, близких по
химической структуре ST-246, выбрать наиболее высокоэффективное

антиортопоксвирусное химическое соединение НИОХ-14. Доказанная нами

целесообразность и правомерность применения данной методологии позволяет

руководствоваться ею при проведении поиска и разработки препаратов, эффективных в отношении других инфекционных патогенов.

Практическая значимость данной работы заключается в том, что определена и
изучена противовирусная активность химического соединения НИОХ-14,

обладающего патентной чистотой и являющегося субстанцией для отечественного противооспенного препарата. На основании модифицированных нами методов и полученных результатов были разработаны и утверждены стандартные операционные процедуры и методические рекомендации, которые могут быть использованы при исследованиях, в том числе доклинических, антиортопоксвирусной эффективности не только химически синтезированных, но и других препаратов. Разработанные нами модельные биосистемы: мыши аутбредной популяции ICR, иммунодефицитной линии SCID и степные сурки, инфицированные соответственно (см. Материалы и методы) ВЭ (штамм К-1), ВОК (штамм Гришак), ВОО (штамм V79-1-005) и ВНО (штамм Ind-3a), были использованы при выполнении Госконтрактов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» в рамках федеральной целевой программы «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009 - 2014 годы)». Кроме того, основные результаты данной диссертационной работы вошли в «Отчет о доклиническом изучении безвредности, специфической активности и фармакокинетики препарата НИОХ-14 (субстанция)» ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор».

Методология и методы исследования. В процессе проведения поиска, выбора и исследования антиортопоксвирусной активности новых химических соединений нами была разработана и использована методология, заключающаяся в логически обоснованной, последовательной оценке их ингибирующего действия в отношении вирусов осповакцины, оспы коров, эктромелии, оспы обезьян и натуральной оспы сначала в экспериментах на культуре клеток, а затем на модельных животных.

При проведении скрининга и расширенного тестирования противовирусной
активности новых химически синтезированных соединений в отношении

ортопоксвирусов in vitro в работе использовали адаптированный и модифицированный нами колориметрический метод определения оптической плотности раствора красителя, поглощенного живыми клетками в монослое на 96-луночных планшетах [Baker et al., 2003]. Исследование противовирусного действия химических соединений в отношении ортопоксвирусов in vivo проводили в экспериментах на мышах аутбредной популяции ICR, инфицированных ВОК (штамм Гришак), ВЭ (штамм К-1), ВОО (штамм V79-1-005) и ВНО (штамм Ind-3a), а также на степных сурках, инфицированных ВОО (штамм V79-1-005), и мышах иммунодефицитной линии SCID, инфицированных ВНО (штамм Ind-3a). В работе были применены традиционные вирусологические, культуральные, гистологические и статистические методы исследований.

Положения, выносимые на защиту:

1) среди всех исследованных новых производных трициклодикарбоновой
кислоты, полициклических гидрированных функциональных производных изоиндола и
их аналогов, близких по химической структуре ST-246, наиболее высокой активностью
в отношении вирусов осповакцины, оспы коров, эктромелии, оспы обезьян и
натуральной оспы in vitro обладает соединение НИОХ-14;

2) в экспериментах на мышах, инфицированных вирусом оспы коров (штамм
Гришак), выраженной протективной эффективностью обладают НИОХ-14, НИОХ-32 и
ST-246, тогда как при заражении мышей вирусом эктромелии (штамм К-1), который

является для них естественным патогеном, только применение НИОХ-14 и ST-246 приводит к уменьшению летальности и продукции вируса в легких инфицированных мышей;

3) у мышей аутбредной популяции ICR и степных сурков, инфицированных
вирусом оспы обезьян (штамм V79-1-005), препарат НИОХ-14, так же как ST-246, при
пероральном введении проявляет лечебно-профилактическое действие;

4) при заражении мышей иммунодефицитной линии SCID и аутбредной
популяции ICR вирусом натуральной оспы (штамм Ind-3a) пероральное введение
препаратов НИОХ-14 и ST-246 по лечебно-профилактической схеме приводит к
уменьшению доли инфицированных животных, продукции вируса и
патоморфологических изменений в легких;

5) химическое соединение НИОХ-14 по своей антиортопоксвирусной активности
in vitro и in vivo не уступает ST-246 и является субстанцией для разработки на ее
основе отечественного противооспенного химиопрепарата.

Степень достоверности и апробация результатов. Статистическую обработку и сравнение экспериментальных данных проводили стандартными методами [Закс, 1976] с помощью пакета компьютерных программ «Statistica 6.0» (StatSoft Inc. 1984-2001) [Статистический анализ данных Statistica 6, 2010]. Основные результаты данной диссертационной работы были представлены на 16 российских и международных научных форумах, кроме того, по материалам диссертации опубликовано 14 научных статей, из них 8 – в отечественных журналах из списка ВАК и 5 – в зарубежных изданиях, а также 22 тезиса в сборниках научных трудов, материалах конференций и других изданиях. По результатам диссертации получено 5 патентов Российской Федерации на изобретение.

Личный вклад автора в диссертационную работу. Результаты диссертации получены и описаны лично автором под руководством д.б.н. Шишкиной Л.Н. и к.м.н. Сергеева Ар.А. Автор принимал участие во всех исследованиях in vitro и in vivo. Все эксперименты с ВОО и ВНО были проведены лично автором в лаборатории с максимальным уровнем биологической защиты в изолирующих пневмокостюмах совместно с другими сотрудниками. Автор признателен своим научным руководителям д.б.н. Шишкиной Л.Н. и к.м.н. Сергееву Ар.А., а также профессору Сергееву А.Н., к.б.н. Булычеву Л.Е. и д.б.н. Агафонову А.П. за содействие и помощь, оказанные при планировании, проведении, описании, обсуждении и анализе результатов данной работы. Автор благодарит Бормотова Н.И., Скарнович М.О., Мазуркова О.Ю., Серову О.А., Сергеева Ал.А., Боднева С.А., Пьянкова О.В., Туманова Ю.В., Титову К.А., Юрганову И.А., Галахову Д.О., Овчинникову А.С., Таранова О.С., всех инженеров и лаборантов, которые участвовали в экспериментах.

Работа была выполнена при финансовой поддержке федеральной целевой программы «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009 - 2014 годы)».

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста, включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, заключение и выводы, список сокращений и условных обозначений, список литературы и список иллюстративного материала. Диссертация содержит 23 таблицы и 16 рисунков. Список литературы включает 144 источников, в том числе 127 статей в зарубежных журналах.

Эффективность препаратов ST-246 и СМХ001 в отношении вирусов эктромелии, оспы коров, оспы кроликов и осповакцины in vivo

Снижение противооспенного иммунитета среди населения, связанное с отменой оспопрививания после элиминации вируса натуральной оспы (ВНО) из окружающей среды, циркуляция вирусов оспы обезьян (BOO), верблюдов (ВОВр), буйволов (ВОБ) и коров (ВОК), а также спорадические вспышки ортопоксвирусных инфекций среди животных создают реальные предпосылки для эпизоотии и заболеваний людей, вызванных патогенными для человека ортопоксвирусами [1, 33, 56, 99, 124]. Кроме того, в настоящеее время, человеческая популяция подвергается потенциальной опасности возникновения оспы, поскольку невозможно исключить наличие нелегального хранения ВНО и преднамеренного использования против населения природных или рекомбинантных штаммов вируса ВНО и BOO в качестве биологического оружия [98]. В связи с этим разработка высокоэффективных противовирусных лекарств, обладающих лечебно-профилактическим действием при заражении человека и животных патогенными ортопоксвирусами, является важной задачей для медицины и ветеринарии.

В 20 веке были найдены химические вещества, обладающие противооспенным действием. Так, в период проведения компании ликвидации оспы в серии исследований в Индии с профилактической целью был использован препарат Метисазон [57]. В настоящее время известен препарат Марборан (Метисазон) и противовирусное лекарственное средство для ветеринарии, содержащее диметилсульфоксид, полиэтиленгликоль и Метисазон [32, 5]. В связи с тем, что Метисазон, блокирующий синтез поздних белков вируса и сборку вириона, был умеренно эффективным против ортопоксвирусов, причем только в максимальной переносимой концентрации, его применение было прекращено [2]. Вместе с тем, проводится поиск более эффективных антиортопоксвирусных препаратов среди большого количества близких соединений класса тиосемикарбазонов. Поскольку разработка лекарств с самого начала является дорогостоящим и длительным по времени процессом [63], использование лицензированных лекарств, утвержденных для иных целей, выглядело привлекательной возможностью получения антивирусных средств против натуральной оспы. Так, противооспенная активность была определена для ряда зарегистрированных ранее в FDA препаратов. Гливек (обозначаемый STI-571, или иматиниба мезилат), являющийся утвержденным FDA лекарством для лечения хронического миелолейкоза, проявляет также антивирусную активность против поксвирусов. Гливек блокирует действие тирозинкиназы АЫ-семейства [52] и тем самым блокирует выход вируса вакцины из инфицированных клеток in vitro [91, 109, 144]. Лечение Гливеком обеспечивает выживание мышей интраназально зараженных вирусом вакцины [109]. Однако эффективность лечебного действия Гливека наблюдается лишь при низких заражающих дозах вируса и в случаях, когда лекарство вводили менее чем через 48 часов после заражения. Исследования лечебно-профилактического действия Гливека на кроликах, инфицированных высоковирулентным штаммом вируса оспы кроликов, и на мышах, инфицированных высоковирулентным штаммом вируса эктромелии, выявили гораздо меньшую его эффективность, чем у животных, инфицированных низко вирулентными для них штаммами ортопоксвирусов. Кроме того, при применении Гливека могут развиваться побочные эффекты, такие как водянка, цитопения и токсическое поражение Осознавая важность проблемы возникновения устойчивости ортопоксвирусов к противовирусным препаратам, исследователи во всем мире продолжают интенсивный поиск новых противооспенных химических соединений. Так, был проведен высокопропускной скрининг природных и синтетических химических продуктов, в том числе непатентованных веществ, разрешенных для применения в медицине и ветеринарии, с целью поиска антагонистов ортопоксвирусов. В результате этого было выявлено 13 химических соединений, имеющих ранее не установленные для них антипоксвирусные свойства [51]. При этом одно из них - известный противоопухолевый препарат Митоксантрон, ингибирующий, как было установлено, ДНК-лигазу вируса и образование внутриклеточного зрелого вируса, был наиболее активным не только в отношении вируса вакцины, но также блокировал размножение вирусов оспы коров и обезьян in vitro [51, 27]. Кроме того, внутрибрюшинное введение Митоксантрона мышам, зараженным вирусом оспы коров, приводило к увеличению их выживаемости и продолжительности жизни [27]. Продолжаются дальнейшие исследования активности Митоксантрона в отношении других ортопоксвирусов. Другой препарат (S)-HPMPA, показал свою антиортопоксвирусную эффективность in vitro, тем не менее, оказался не эффективным in vivo. Однако соединение (S)-HPMPA с липидными эфирами, такими как гексадецил пропандиол алкоксиалканол (HDP-CDV), привело к усилению его противоортопоксвирусной активности in vitro и обеспечило эффективность in vivo в отношении заболеваний у мышей, вызванных вирусами оспы коров и вакцины [103]. Связывание соединений с липидами подобными HDP является перспективным направлением по усилению биодоступности препаратов. Начиная с 2001 г. и по настоящее время проводятся исследования еще двух потенциальных противооспенных соединений - ингибиторов вирусной ДНК полимеразы: VistideR (Цидофовир), разрешенный для лечения герпесного ретинита, и СМХ001 - липидное пролекарство Цидофовира, био доступное при пероральном использовании [98].

Было обнаружено, что Цидофовир проявляет в лабораторных условиях антивирусную активность против ортопоксвирусов, и эффективен против оспы коров и инфекции, вызванной вирусом вакцины у мышей [87, 32, 104, 89]. Однако существенным недостатками Цидофовира считаются высокая нефротоксичность и низкая биодоступность, в результате чего терапевтический эффект достигается только при внутривенном введении препарата.

В то же время при ковалентном связывании Цидофовира с HDP-CDV недавно получено новое липидное пролекарство Цидофовира - СМХ001 [98]. Полученный конъюгат СМХ001 аналогичен натуральному липиду и конкурирует с лизофосфодитилхолином в организме. В отличие от Цидофовира, СМХ001 обладает высокой биодоступностью при оральном применении и накапливается в плазме крови и/или лимфе в высоких концентрациях, не аккумулируясь при этом в почках, тем самым, исключая их токсическое поражение. Компания Chimerix (NC, USA) получила лицензию (IND) для препарата СМХ001 и с 2006 года проводит его клинические испытания.

Определение цитотоксичности и противовирусной активности химических соединений in vitro

В экспериментах на мышах иммунодефицитной линии SCID массой 12-14 г и аутбредной популяции ICR массой 8-11 г при и/н заражении 10 ИД5о ВНО (штамм India-За) проводили сравнительное изучение противовирусной эффективности препаратов НИОХ-14 и ST-246. В качестве плацебо использовали раствор, содержащий 0,75 % метилцеллюлозы и 1 % твина-80, с помощью которого готовили суспензии НИОХ-14 и ST-246. Мышам линии SCID, инфицированным ВНО, п/о вводили по 0,2 мл суспензии исследуемых соединений в дозе 50 мкг/г массы или плацебо за 1 сут до заражения, через 2 часа п.з. и далее ежедневно в течение 3 сут п.з. Через 4 сут п.з. ВНО у 8-10 эвтаназированных животных из соответствующей группы извлекали легкие и определяли наличие и титры вируса в 4 %-х гомогенатах этого органа (в lg БОЕ/мл). При заражении ВНО мыши аутбредной популяции ICR п/о получали по 0,2 мл суспензии исследуемых соединений в дозе 60 мкг/г массы или плацебо за 1 сут до заражения, через 2 часа п.з. и далее ежедневно в течение 2 сут п.з. Через 3 сут п.з. ВНО по 6 животных в каждой группе эвтаназировали, извлекали легкие и в 4 %-х гомогенатах этого органа определяли наличие и титры вируса (в lg БОЕ/мл).

Используя полученные результаты, подсчитывали коэффициент защиты мышей от инфицирования (КЗИ = % инфицированных животных в контроле - % инфицированных животных в опыте) и ИППВ в легких (ИППВ = Титр вируса в легких в контроле - Титр вируса в легких в опыте, в lg). Кроме того, у 4 животных из каждой группы, эвтаназированных соответственно через 4 и 3 сут п.з., были взяты легкие для гистологических исследований.

Концентрацию ортопоксвирусов в полученных образцах культуральной жидкости и гомогенатов органов животных определяли стандартным для поксвирусов методом подсчета количества бляшек при внесении последовательных разведений образцов на монослой культуры клеток Vero [140]. Клетки выращивали в 24-луночных планшетах до формирования полного монослоя с посадочной концентрацией 100 тыс. кл./мл (по 1 мл в лунку) в среде RPMI-1640 (ООО «Биолот», Россия) с 5 % инактивированной сыворотки плодов коров («HyClone», США) и антибиотиками (пенициллин 100 МЕ/мл, стрептомицин 100 мкг/мл, Россия) при 37 С и 5 % СОг. Готовили 10-кратные разведения образцов ортопоксвирусов в поддерживающей среде RPMI-1640 (ООО «Биолот», Россия) с 2 % сыворотки и антибиотиками. В лунку вносили по 0,1 мл соответствующего разведения (по 4 лунки на разведение) и по 0,7 мл поддерживающей питательной среды. Инфицированные вирусом клетки инкубировали 4 сут (BOO и ВНО) и 6 сут (ВЭ) при 37 С и 5 % СОг. По окончании срока культивирования монослой окрашивали раствором геннианового фиолетового и подсчитывали количество бляшек в лунках. Для подсчета титра вируса использовали те разведения, при которых количество бляшек в лунках находилось в пределах 10-100. Титр вируса рассчитывали и выражали в lg БОЕ/мл. Значения титров вирусов представлены как M±m, M±SM ИЛИ М±195, где М -среднее значение, т - стандартная ошибка среднего, SM - стандартное отклонение, 195 -95 %-й доверительный интервал.

Определение титров ВЭ в гомогенатах органов у инфицированных мышей. Через 6 сут п.з. ВЭ и введения препаратов НИОХ-3, НИОХ-4, НИОХ-14, НИОХ-32, ST-246 и плацебо в течение 5 сут п.з. у 4-5 аутбредных мышей ICR в соответствующих группах определяли концентрацию вируса в сыворотке крови и 10 %-х гомогенатах органов. В случаях, когда концентрация ВЭ в гомогенатах органов была ниже порога чувствительности метода титрования ( 1,0 lg БОЕ/мл) проводили дополнительное расширенное тестирование исходных образцов [140, 144]. Если концентрация ВЭ в гомогенатах органов была ниже порога чувствительности расширенного тестирования ( 0,3 lg БОЕ/мл), при расчете средней ее величины (М) использовали минимальное значение титра, которое можно было определить при данном способе титрования (0,3 lg БОЕ/мл).

Определение титров BOO в легких инфицированных мышей. Через 7 сут п.з. BOO и введения препаратов НИОХ-14, НИОХ-32, ST-246 и плацебо (за 1 сут до заражения и далее в течение 6 сут п.з.) у 6 мышей аутбредной популяции ICR в соответствующих группах определяли концентрацию вируса в 5 %-х гомогенатах легких. Если концентрация BOO в гомогенатах легких была ниже порога чувствительности метода титрования ( 1,1 lg БОЕ/мл), то при расчете М использовали минимальное значение титра, которое можно было определить при данном способе титрования (1,1 lg БОЕ/мл).

Определение титров ВНО в легких инфицированных мышей. Через 3 сут п.з. ВНО мышей аутбредной популяции ICR и введения препаратов НИОХ-14, ST-246 и плацебо (за 1 сут до заражения и далее в течение 2 сут п.з.) или через 4 сут п.з. ВНО мышей иммунодефицитной линии SCID и введения препаратов НИОХ-14, ST-246 и плацебо (за 1 сут до заражения и далее в течение 3 сут п.з.) у 7-10 мышей в соответствующих группах определяли концентрацию вируса в 4 %-х гомогенатах

Для светооптического исследования образцы легких, взятых от мышей аутбредной популяции ICR через 6 сут п.з. 10 ЛД5о ВЭ или от иммунодефицитной линии SCID через 4 сут п.з. 10 ИД5о ВНО, фиксировали в 4 %-м растворе параформальдегида. Дальнейшая обработка материала проводилась по общепринятой методике: последовательное обезвоживание в спиртах возрастающей концентрации, пропитывание в смеси ксилола с парафином и заливка в парафиновые блоки. Парафиновые срезы толщиной 4-5 мкм готовили с помощью автоматического ротационного микротома НМ-360 (Germany). Срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Светооптическое исследование и микрофотосъемка проводилась на микроскопе Imager Zl (Zeiss, Gottingen, Germany), оснащенном камерой высокого разрешения HRc. При анализе снимков использовался программный пакет AxioVision Rel.4.8.2 (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Germany).

Скрининг и оценка противовирусной активности химических соединений в отношении вирусов осповакцины, оспы коров и эктромелии в культуре клеток Vero 3.1.2

Несмотря на возросшую актуальность разработки новых средств защиты от ортопоксвирусных инфекций, в том числе и от натуральной оспы, в настоящее время в мире не существует официально зарегистрированных химических препаратов для профилактики и лечения ортопоксвирусных инфекций. Вместе с тем, как было показано, несколько субстанций проявляют антиортопоксвирусную активность: это тиосемикарбазоны, аналоги нуклеозидов, нуклеотидов, ациклические нуклеозиды и нуклеотиды, интерфероны и их индукторы [48, 123, 99]. Тем не менее, на стадии клинических испытаний находятся только два разработанных в США противооспенных химических соединения: СМХ001 (Brincidofovir) и ST-246 (Tecovirimat) [98, 119].

При этом известно, что многие аналоги ST-246 - производные трициклодикарбоновой кислоты и конденсированные производные пирролдиона проявляют разного вида биологическую, в том числе и противовирусную активность [31, 92, 14]. Поэтому в данной работе, прежде всего, был проведен скрининг и последовательное изучение in vitro и in vivo антиортопоксвирусной активности химических соединений из числа патентно-чистых аналогов ST-246. Для этой цели в НИОХ им. Н.Н. Ворожцова СО РАН в период с 2009 по 2014 годы было синтезировано более 100 таких соединений. В общем виде оценку антиортопоксвирусной активности этих химических соединений мы осуществляли поэтапно в логической последовательности, согласно структурированной нами методологии: 1) в культуре клеток с использованием слабопатогенных для человека ортопоксвирусов; 2) в культуре клеток с использованием высокопатогенных для человека ортопоксвирусов; 3) на модельных видах животных с использованием слабопатогенных для человека ортопоксвирусов; 4) на модельных видах животных с использованием высокопатогенных для человека ортопоксвирусов.

При проведении культуральных работ на первом и втором этапах исследований мы использовали перевиваемую культуру клеток Vero, инфицированную ВОВ (штамм ЛИВП), ВОК (штамм Гришак), ВЭ (штамм К-1), BOO (штамм V79-1-005) и ВНО (штаммы India-3a, 6-58, Congo-9 и Butler). Другие ученые in vitro использовали более широкий спектр клеток: не только перевиваемые культуры клеток, но и первичные (фибробласты крайней плоти и кератиноциты человека) [81, 129, 103]. Опыты ex vivo проводили на органных культурах крайней плоти человека [129, 55, 85]. При этом использовали не только другие штаммы BOB (WR, Copenhagen, Copenhagen-GFP, Lederle-Chorioallentoic, NYCBH и резистентные к ST-246 или Цидофовиру), ВЭ (Moscow), ВОК (Brighton, Brighton Red и резистентный к Цидофовиру), BOO (Zaire, V78-I-3945, V81-I-179, 2003-USA-039, V77-I-823, V1979-I-005, 2003-RCG-358, MPXV V70-I-266 и резистентный к Цидофовиру) и ВНО (SOM77_ali, BSH74_sol, BRZ6639, JAP51_stwl, UNK52_but, BRZ66-39, SLN68-258, SUD47-juba, BSH74-sol, NEP73-175, Butler и Bangladesh), но и BOBp (Somalia, Iran и резистентный к Цидофовиру), а также ВОКр [144, 127, 66]. Если в экспериментах по оценке защитной эффективности выбранных химических соединений в отношении слабопатогенных для человека ортопоксвирусов мы инфицировали мышей аутбредной популяции ICR только ВЭ (штамм К-1) и ВОК (штамм Гришак), то другие исследователи использовали не только ВЭ (штамм Moscow и MOS-3-P2) и ВОК (штамм Brighton и Brighton Red), но и ВОВ (штамм WR, Lister и IHD-J) и ВОКр (штамм Utrecht), заражая мышей разных линий (C57BL/6, A/Ncr, BALB/c, SCID, Nude NMRI-nu), включая иммунодефицитные, и кроликов [39, 35, 94].

В исследованиях с целью оценки противовирусного действия препаратов в отношении BOO до настоящего времени использовали ранее известные виды модельных животных: иммунодефицитные мыши, суслики, луговые собачки, сони Келлена и приматы M. fascicularis и mulatta) [69, 43]. В наших экспериментах при сравнении противооспенной эффективности НИОХ и ST-246 были использованы новые ранее выбранные виды модельных животных для оспы обезьян: мыши аутбредной популяции ICR и степные сурки [117, 118]. При этом мыши аутбредной популяции ICR при отсутствии симптоматики заболевания воспроизводят в основном начальный этап инфекционного процесса, наблюдаемый у человека и известных видов модельных животных, (репродукцию вируса в таких же первичных клетках-мишенях в респираторных органах и патоморфологические изменения в них) [117]. В связи с этим мыши могут использоваться для оценки профилактической, лечебной и лечебно-профилактической эффективности соединений по результатам регистрации наличия и величины титра вируса в легких этих животных через 7 сут п.з. Степные сурки воспроизводят клиническую симптоматику оспоподобного заболевания, все этапы инфекционного процесса в тех же клетках-мишенях, а также патоморфологические изменения в органах и тканях и могут использоваться для оценки профилактической, лечебной и лечебно-профилактической эффективности исследуемых препаратов по результатам регистрации клинических признаков оспоподобного заболевания (в том числе гибели) [118]. В связи с этим нами были проведены исследования защитной эффективности химических соединений, которые вводили по лечебно-профилактической схеме мышам и суркам, инфицированным вирусом оспы обезьян. В результате этих экспериментов была продемонстрирована выраженная противооспенная эффективность исследуемых нами препаратов НИОХ-14 и ST-246.

Некоторые ученые в своих работах по оценке защитной эффективности препаратов от натуральной оспы использовали единственный вид модельных животных: М. Cynomolgus, которых заражали внутривенно очень большими дозами ВНО (8 и 9 lg БОЕ) [93, 67]. При этом применение данной модели ограничивается определением протективной эффективности препаратов лишь по результатам проявления внешних клинических признаков заболевания, а также патоморфологических изменений органов и тканей на поздних стадиях заболевания (у погибших животных или после эвтаназии выживших животных). При этом оценить, какое влияние оказывают исследуемые препараты на инфекционные процессы, связанные с размножением ВНО в первичных органах-мишенях и его диссеминацией в организме на ранних стадиях заболевания до клинических проявлений, очень проблематично с учетом материальных затрат и биоэтических норм. В наших экспериментах были использованы ранее выбранные виды модельных животных: иммунокомпетентные мыши аутбредной популяции ICR и иммунодефицитные мыши линии SCID, инфицированные ВНО [136]. Эти животные в отличие от приматов при отсутствии клинической картины заболевания воспроизводят только ранние этапы инфекционного процесса, вызванного ВНО, в тех же клетках-мишенях и патоморфологические изменения в респираторных органах. В связи с этим применение данных модельных биосистем является правомерным для изучения эффективности противооспенных препаратов по результатам регистрации наличия и величины титра ВНО в легких через 3 или 4 сут п.з. На этом основании нами были проведены исследования лечебно-профилактического действия химических соединений НИОХ-14 и ST-246 на мышах аутбредной популяции ICR и иммунодефицитной линии SCID, инфицированных ВНО. Полученные результаты этих экспериментов убедительно доказывают, что новое, химически синтезированное соединение НИОХ-14 проявляет в отношении ВНО in vivo не меньшую эффективность, чем соединение ST-246, являющееся разработкой США.

Сравнительная оценка противовирусной активности химических соединений НИОХ-14 и ST-в отношении вируса эктромелии in vitro и in vivo

Другие ученые in vitro использовали более широкий спектр клеток: не только перевиваемые культуры клеток, но и первичные (фибробласты крайней плоти и кератиноциты человека) [81, 129, 103]. Опыты ex vivo проводили на органных культурах крайней плоти человека [129, 55, 85]. При этом использовали не только другие штаммы BOB (WR, Copenhagen, Copenhagen-GFP, Lederle-Chorioallentoic, NYCBH и резистентные к ST-246 или Цидофовиру), ВЭ (Moscow), ВОК (Brighton, Brighton Red и резистентный к Цидофовиру), BOO (Zaire, V78-I-3945, V81-I-179, 2003-USA-039, V77-I-823, V1979-I-005, 2003-RCG-358, MPXV V70-I-266 и резистентный к Цидофовиру) и ВНО (SOM77_ali, BSH74_sol, BRZ6639, JAP51_stwl, UNK52_but, BRZ66-39, SLN68-258, SUD47-juba, BSH74-sol, NEP73-175, Butler и Bangladesh), но и BOBp (Somalia, Iran и резистентный к Цидофовиру), а также ВОКр [144, 127, 66]. Если в экспериментах по оценке защитной эффективности выбранных химических соединений в отношении слабопатогенных для человека ортопоксвирусов мы инфицировали мышей аутбредной популяции ICR только ВЭ (штамм К-1) и ВОК (штамм Гришак), то другие исследователи использовали не только ВЭ (штамм Moscow и MOS-3-P2) и ВОК (штамм Brighton и Brighton Red), но и ВОВ (штамм WR, Lister и IHD-J) и ВОКр (штамм Utrecht), заражая мышей разных линий (C57BL/6, A/Ncr, BALB/c, SCID, Nude NMRI-nu), включая иммунодефицитные, и кроликов [39, 35, 94].

В исследованиях с целью оценки противовирусного действия препаратов в отношении BOO до настоящего времени использовали ранее известные виды модельных животных: иммунодефицитные мыши, суслики, луговые собачки, сони Келлена и приматы M. fascicularis и mulatta) [69, 43]. В наших экспериментах при сравнении противооспенной эффективности НИОХ и ST-246 были использованы новые ранее выбранные виды модельных животных для оспы обезьян: мыши аутбредной популяции ICR и степные сурки [117, 118]. При этом мыши аутбредной популяции ICR при отсутствии симптоматики заболевания воспроизводят в основном начальный этап инфекционного процесса, наблюдаемый у человека и известных видов модельных животных, (репродукцию вируса в таких же первичных клетках-мишенях в респираторных органах и патоморфологические изменения в них) [117]. В связи с этим мыши могут использоваться для оценки профилактической, лечебной и лечебно-профилактической эффективности соединений по результатам регистрации наличия и величины титра вируса в легких этих животных через 7 сут п.з. Степные сурки воспроизводят клиническую симптоматику оспоподобного заболевания, все этапы инфекционного процесса в тех же клетках-мишенях, а также патоморфологические изменения в органах и тканях и могут использоваться для оценки профилактической, лечебной и лечебно-профилактической эффективности исследуемых препаратов по результатам регистрации клинических признаков оспоподобного заболевания (в том числе гибели) [118]. В связи с этим нами были проведены исследования защитной эффективности химических соединений, которые вводили по лечебно-профилактической схеме мышам и суркам, инфицированным вирусом оспы обезьян. В результате этих экспериментов была продемонстрирована выраженная противооспенная эффективность исследуемых нами препаратов НИОХ-14 и ST-

Некоторые ученые в своих работах по оценке защитной эффективности препаратов от натуральной оспы использовали единственный вид модельных животных: М. Cynomolgus, которых заражали внутривенно очень большими дозами ВНО (8 и 9 lg БОЕ) [93, 67]. При этом применение данной модели ограничивается определением протективной эффективности препаратов лишь по результатам проявления внешних клинических признаков заболевания, а также патоморфологических изменений органов и тканей на поздних стадиях заболевания (у погибших животных или после эвтаназии выживших животных). При этом оценить, какое влияние оказывают исследуемые препараты на инфекционные процессы, связанные с размножением ВНО в первичных органах-мишенях и его диссеминацией в организме на ранних стадиях заболевания до клинических проявлений, очень проблематично с учетом материальных затрат и биоэтических норм. В наших экспериментах были использованы ранее выбранные виды модельных животных: иммунокомпетентные мыши аутбредной популяции ICR и иммунодефицитные мыши линии SCID, инфицированные ВНО [136]. Эти животные в отличие от приматов при отсутствии клинической картины заболевания воспроизводят только ранние этапы инфекционного процесса, вызванного ВНО, в тех же клетках-мишенях и патоморфологические изменения в респираторных органах. В связи с этим применение данных модельных биосистем является правомерным для изучения эффективности противооспенных препаратов по результатам регистрации наличия и величины титра ВНО в легких через 3 или 4 сут п.з. На этом основании нами были проведены исследования лечебно-профилактического действия химических соединений НИОХ-14 и ST-246 на мышах аутбредной популяции ICR и иммунодефицитной линии SCID, инфицированных ВНО. Полученные результаты этих экспериментов убедительно доказывают, что новое, химически синтезированное соединение НИОХ-14 проявляет в отношении ВНО in vivo не меньшую эффективность, чем соединение ST-246, являющееся разработкой США. В результате последовательно проведенных исследований в экспериментах in vitro и in vivo с использованием ВОВ, ВЭ, ВОК, BOO и ВНО нами было выбрано химическое соединение НИОХ-14. Данное химическое соединение является предшественником по стадиям синтеза и ближайшим аналогом ST-246 [18]. При этом, несмотря на наличие одинаковых структурных фрагментов в составе химических соединений НИОХ-14 и НИОХ-32 (рисунок 4.1) и их сходства с ST-246 (рисунок 1.1 Б), только НИОХ-14, так же как и ST-246, проявил выраженную противовирусную активность в отношении всех исследованных нами ортопоксвирусов in vivo.