Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 14
2.1 Характеристика вируса АЧС 14
2.2 Организация генома вируса АЧС 15
2.3 Механизм репликации вируса АЧС 17
2.4 Клинические формы АЧС 20
2.5 Иммунный ответ при АЧС 22
2.6 Белки вируса АЧС, ответственные за иммунное уклонение и вирулентность 25
2.7 Вариабельность вируса АЧС 32
2.8 Использование клеточных линий для получения делеционных вариантов вируса АЧС 36
2.9 Заключение по обзору литературы 40
3. Собственные исследования 42
3.1 Материалы и оборудование 42
3.1.1 Штаммы и изоляты вируса АЧС 42
3.1.2 Культуры клеток 42
3.1.3 Питательные среды для культивирования, растворы и реактивы 42
3.1.4 Плазмиды и бактериальные штаммы 43
3.1.5 Коммерческие наборы 43
3.1.6 Лабораторное оборудование 44
3.2 Методы исследований 45
3.2.1 Анализ вариабельности белков 45
3.2.2 Анализ нуклеотидных последовательностей вируса АЧС 45
3.2.3 Выделение нуклеиновых кислот 46
3.2.4 Полимеразная цепная реакция с детекцией продуктов амплификации методом электрофореза 46
3.2.5 Нуклеотидное секвенирование 47
3.2.6 Биоинформатический анализ нуклеотидных последовательностей генов вируса АЧС 47
3.2.7 Конструирование рекомбинантных векторов 48
3.2.8 Получение рекомбинантного вируса АЧС 49
3.2.9 Инфекционная активность вируса АЧС 49
3.2.10 Проверка отсутствия исходного родительского типа вируса 50
3.2.11 Проверка контаминации бактериальной, грибной микрофлорой и микоплазмами 50
3.2.12 Ростовые характеристики вируса АЧС 50
3.2.13 Количественная ПЦР в режиме реального времени 51
3.2.14 Количественное обнаружение апоптоза в клетках 51
3.2.15 Статистическая обработка результатов исследований 51
4. Результаты собственных исследований 52
4.1 Сравнительный анализ генов вируса АЧС, участвующих в иммунном уклонении 52
4.1.1 Дизайн специфических праймеров для амплификации копий генов A238L, I329L и DP71L вируса АЧС 58
4.1.2 Амплификация фрагментов генов A238L, I329L и DP71L методом ПЦР 60
4.1.3 Филогенетический анализ генов A238L, I329L и DP71L вируса АЧС 61
4.1.4 Анализ синонимичных и несинонимичных замен псевдопоследовательности генов A238L (5EL), I329L (K11L) и DP71L (I14L) вируса АЧС 71
4.2 Получение рекомбинантного вируса АЧС 72
4.2.1 Олигонуклеотидные праймеры для секвенирования плечей рекомбинации гена А238L 72
4.2.2 Олигонуклеотидные праймеры для создания генетической конструкции на основе плазмидного вектора 75
4.2.3 Генетическая конструкция на основе плазмидного вектора 76
4.2.4 Рекомбинантный вирус АЧС Волгоград/14с A238L, полученный методом гомологичной рекомбинации 83
4.2.5 Инфекционная активность рекомбинантного вируса АЧС (штамм Волгоград/14с A238L) 88
4.2.6 Отсутствие исходного вируса Волгоград/14с в суспензии рекомбинантного вируса 89
4.2.7 Репродукция рекомбинантного вируса Волгоград/14с A238L в перевиваемой культуре клеток COS-1 91
4.2.8 Активность эффекторной каспазы-3 в культуре клеток COS-1, инфицированной вирусом АЧС 94
4.2.9 Полногеномное секвенирование рекомбинантного вируса (штамм Волгоград/14с A238L) 96
5. Заключение 99
5.1 Итоги выполненного исследования 106
5.2 Практические предложения 107
5.3 Перспективы дальнейшей разработки темы 1108
6. Список сокращений и условных обозначений 108
7. Список литературы 110
8. Приложения 137
- Механизм репликации вируса АЧС
- Сравнительный анализ генов вируса АЧС, участвующих в иммунном уклонении
- Генетическая конструкция на основе плазмидного вектора
- Полногеномное секвенирование рекомбинантного вируса (штамм Волгоград/14с A238L)
Механизм репликации вируса АЧС
Инфекционный цикл вируса АЧС начинается с адсорбции вируса на поверхности клеток мононуклеарно-фагоцитарной системы, в том числе резидентных макрофагов кроветворных органов и специфических ретикулярных клеток [164].
Ранние исследования по проникновению вируса АЧС показали, что этот процесс зависит от значений рН, температуры и связан со специфическим рецептор-опосредованным эндоцитозом в клетках Vero и макрофагах свиней [91, 143]. Однако все рецепторы, специфичные для вируса АЧС, остаются неопределенными [143].
Sanchezorres C. с соавт. [142] было показано, что инфицирование моноцитов и макрофагов свиней вирусом АЧС коррелировало с экспрессией рецептора - CD163 «мусорщика» макрофагов. Поэтому эти авторы предположили, что рецептор CD163 может являться потенциальным вирусным рецептором, поскольку моноклональные антитела против этого белка могли блокировать инфицирование первичных альвеолярных макрофагов [60, 142].
Однако более поздние исследования показали, что белок CD163 не является необходимым рецептором для инфицирования свиней референс-штаммом вируса АЧС Georgia 2007/1 [142, 151]. При заражении генно-модифицированных свиней, у которых был удален ген белка CD163, с использованием системы CRISPR/Cas9, не показано различий в проявлении клинических признаков, уровне смертности, патологии или виремии [151]. Таким образом, белок CD163 может быть необходимым, но не единственным рецептором для вируса АЧС. Можно предположить, что другие поверхностные маркеры макрофагов, также могут участвовать в процессе инфицирования [151].
Несмотря на то, что существуют рецептор-зависимые механизмы проникновения вируса, такие как клатрин - и динамин-зависимый рецептор опосредованный эндоцитоз, также имеются данные о том, что для проникновения в клетку вирус АЧС использует механизмы фагоцитоза и макропиноцитоза [60, 74, 87, 88, 109, 159].
Различными авторами показано, что в механизме проникновения вируса АЧС в клетку принимает участие белок p30, который способствует интернализации вируса, а также белки p12 и p54 [96, 97, 237].
После проникновения вируса АЧС в чувствительную клетку и для последующего успешного размножения он должен взаимодействовать с разными популяциями эндосом [134]. Белки семейства Rab GTPase являются основными регуляторами созревания эндосомального пути [232].
Через несколько минут после адсорбции вирус АЧС обнаруживают в ранних эндосомах, помеченных маркерами Rab5 и EEA1. Полностью инкапсулированные вирионы встречаются только на уровне ранних эндосом [134].
Использование ингибитора закисления эндосом - бафиломицина А1 предотвращало декапсидирование вируса, что позволило наблюдать полноразмерные вирионы в мультивезикулярных эндосомах. В отсутствии ингибитора в поздних эндосомах содержатся только коры вируса, лишенные капсидного белка [134]. Декапсидирование вириона АЧС происходит при кислом значении рН в зрелых эндосомальных компартментах клеток между 30 и 45 мин после инфицирования [134]. Зрелые эндосомы представляют собой мультивезикулярные тела, экспрессирующие белок CD63. Зависимость последовательного «раздевания» вируса от эндосомального созревания была также описана и для других вирусов [136, 201].
После декапсидирования вирусных частиц происходит слияние вирусной оболочки с мембраной эндосом и затем обнаженные коры вириона поступают в цитозоль для начала репликации [113]. В этом процессе участвует белок внутренней оболочки вириона pE248R [22]. Блокирование транспорта холестерина способствует сохранению вирионов внутри эндосом, препятствуя прогрессированию инфекции [113].
Механизм репликации ДНК вируса АЧС в цитоплазме клеток аналогичен таковым процессам, характерным для вирусов семейства Poxviridae. После проникновения в клетку, вирионы достигают перинуклеарной области, близкой к центру организации микротрубочек (ЦОМТ), где происходит репликация ДНК вируса АЧС [60, 81]. Ранние гены экспрессируются до начала репликации ДНК, причем обе цепи вирусной ДНК являются альтернативами и используются в качестве кодирующей цепи [143, 223].
После репликации ДНК начинается транскрипция промежуточных и поздних генов, участвующих в транскрипции и модификации мРНК. Этот транскрипционный механизм дает вирусу АЧС относительную независимость от хозяина и тем самым позволяет осуществлять точное позиционное и временное управление экспрессией своих генов [223].
В ранние периоды после инфекции в ядре клеток обнаруживается вирусная ДНК, что указывает на возможное участие клеточных ферментов на начальных стадиях репликации ДНК. Репликативные промежуточные формы ДНК, которые синтезируются как в ядре, так и в цитоплазме клеток, инфицированных вирусом АЧС, состоят из конкатемеров «голова к голове» [221].
Возможно, в ядре клеток синтезируются небольшие транскрипты или другие факторы, необходимые для прайминга репликации вируса или в нем происходит ранняя стадия репликации вирусной ДНК [221].
Для транспортировки вируса в перинуклеарную область клетки необходимы микротрубочки, где происходит репликация и образование вирусных фабрик [160].
Структурный белок p54 вируса АЧС во время вирусной инфекции взаимодействует с легкой цепью динеина, что может служить молекулярным механизмом для передачи вируса, опосредованного микротрубочками [81]. Промежуточные волокна клетки - виментины окружают вирусную фабрику, концентрируют структурные белки и вирусные компоненты в местах сборки в цитоплазме [259].
Формирование сайтов репликации вируса зависит от нескольких клеточных детерминант. Например, ингибиторы Rho GTPase продуцируют вирусные фабрики больших размеров с аккумуляцией предшественников оболочки и незрелых вирионов [231].
Данный специализированный центр организации микротрубочек (ЦОМТ) содержит вирусную ДНК, большую часть вирусных белков, незрелые и зрелые вирионы, и также вирус-индуцированные мембраны. Вирусные фабрики содержат предшественники, которые формируются в икосаэдрические промежуточные соединения путем сборки капсида и домена оболочки [143].
Последней стадией морфогенеза вирионов является инкапсидация вирусной ДНК, приводящая к образованию зрелых частиц. Наконец, новообразованный вирус покидает фабрику и переносится на клеточную поверхность с помощью кинезина, где вирион покрывается дополнительной внешней оболочкой, которую получает во время процесса почкования [105, 259].
Сравнительный анализ генов вируса АЧС, участвующих в иммунном уклонении
На основе анализа данных литературы нами были отобраны гены вируса АЧС, кодирующие белки, участвующие в иммунном уклонении. Эти группы белков участвуют в ингибировании апоптоза, клеточной адгезии белков, препятствуют макрофагам хозяина ингибировать сигнальные пути активации транскрипции генов иммунного ответа (таблица 2) [41, 69, 82, 140].
В нашей работе нуклеотидные и аминокислотные последовательности этих генов были получены из международной базы данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). С целью выявления новых генетических маркеров проводили филогенетический анализ аминокислотных последовательностей 7 ортологичных генов (A179L, A224L, A238L, EP153R, EP402R, I329L, DP71L) от 17 штаммов и изолятов вируса АЧС (Benin 97/1, E75, Georgia2007/1, L60, OURT88/3, BA71, BA71V, Ken05/Tk1, Ken06.Bus, NHV, Malawi Lil-20/1, Tengani 62, Pretorisuskop/96/4, Kenya 1950, Mkuzi 1979, Warthog, Warmbaths), которые были объединены в одну псевдо-последовательность. Далее было построено филогенетическое древо с использованием метода максимального правдоподобия с помощью программы Mega 6.0. и проведен бутстрэп – анализ этого дерева с использованием 1000 случайных выборок. Кластеры со значением выше 70 были признаны достоверными. Топология этого дерева была использована для последующего разделения изолятов на основе их генетической связанности (рисунок 1).
Дополнительно отмечены кластеры (I-IV), в которые сгруппированы изоляты вируса АЧС. В соответствии с рисунком 1, мы можем разделить имеющиеся изоляты на 4 основных кластера, которые коррелируют с их географическим распределением и видам хозяев.
Первый кластер (I) состоял из 6 тесно связанных штаммов и изолятов из европейских стран (Испания и Португалия) и изолята Benin 97/1 из Западной Африки, что подтверждает занос вируса АЧС на территорию Европы из африканского континента.
Во второй кластер (II) были отнесены изоляты Warmbaths и Mkuzi, выделенные от клещей из Южной Африки.
Третий кластер (III) состоял из нескольких изолятов из Южной Африки: изолят Tengani 62 выделен от домашних свиней, Pretorisuskop/96/4 выделен от клещей, а изолят Warthog изолирован от бородавочников из Намибии.
В четвертый кластер (IV) вошли 4 штамма и изолята, выделенные на территории Юго-Восточной Африки: 3 из них (Kenya 1950, Ken05/Tk1, Ken06.Bus) изолированы от домашних свиней, в то время как изолят Malawi Lil-20/1 от клещей.
Изолят Georgia 2007/1, по всей видимости, не связан с вышеуказанными изолятами вируса АЧС с точки зрения общности происхождения, так как не входит ни в одну из групп, образованную европейскими или африканскими изолятами. Данный факт наталкивает на мысль о возможных рекомбинационных процессах, которые происходили у данного изолята вируса. Необходимо дополнительно отметить, что именно изолят Georgia 2007/1 вируса АЧС является родоначальником всех изолятов вируса, циркулирующих в настоящее время в России.
Интересно отметить, что топология филогенетического древа, построенная на основе анализа псевдо-последовательности из 7 иммуномодулирующих генов, полностью совпадает с филогенетическим древом, построенным на основе сравнения полноразмерных геномов изолятов вируса АЧС.
Данный факт может свидетельствовать о наличии генетических маркеров эволюционной изменчивости в иммуномодулирующих генах.
Следующим этапом наших исследований являлось определение консервативных и вариабельных областей в последовательностях аминокислот иммуномодулирующих белков вируса АЧС при помощи веб-сервиса Protein Variability Server методом Симпсона (http://www.expasy.org/proteomics).
По данным Dixon L.K. с соавт. [82] было идентифицировано несколько белков вируса АЧС, которые модулируют иммунную систему хозяина. К ним относятся: ген A238L, кодирующий белок 5EL, который выступает ингибитором активации транскрипции иммуномодулирующих генов хозяина; белок K11L (ген I329L), действующий как ингибитор сигнальных путей Toll-подобных рецепторов; белок I14L (ген DP71L), сходный с ICP34.5 фактором нейровирулентности герпесвируса, регулирующий фосфатазную активность клетки-хозяина при инфицировании, вытесняя ингибирующие субстраты для фосфатазы хозяина PP1 и тем самым, определяющий круг чувствительных хозяев [52, 94, 155]. Кроме того, продукт гена A238L ингибирует зависимые от кальценейрина реакции хозяина путем непосредственного связывания кальценейрин фосфатазы [155].
В нашей работе Нефедьева М.В. с соавт., 2019 показаны результаты анализа вариабельности белков 5EL, I14L и K11L 17 различных штаммов, изолятов (AM712239, FN557520, FR682468, AY261360, AY261361, AY261362, KP843857, AY261363, AY261364, AY261365,AY261366, AM712240, KP055815, NC001659, KM111294, KM111295, KM262844, KM262845) вируса АЧС (рисунок 2).
Вариабельными считаются области со значениями, превышающими пороговое значение 0,46 (горизонтальная линия черного цвета).
Внеклеточные и внутриклеточные топологические домены, а также расположение сайтов расщепления сигнального пептида в аминокислотных последовательностях были выявлены при помощи веб – сервера SignalP 4.1. (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1).
Прогнозирование трансмембранной топологии белков произведено веб-приложением CCTOP (http://cctop.enzim.ttk.mta.hu).
Из рисунка 2 следует, что у белка 5EL наблюдается 13 вариабельных сайтов, часть из которых располагается в участке IB – подобного домена, состоящего из 3 повторов анкиринов (с 87 по 178 аминокислоту) и на С-терминальном конце мотива PxIxITxC/S, который связывает каталитическую субъединицу кальценейрина - серинтреонин фосфатазу (с 200 по 213 аминокислоту).
Генетическая конструкция на основе плазмидного вектора
Для дальнейшего встраивания и клонирования в плазмидный вектор ПЦР продукты плечей рекомбинации и флуоресцентный белок EGFP были наработаны с помощью высокоточной ДНК-полимеразы Phusion High-Fidelity PCR Kit («New England Biolabs», США) по следующей программе амплификации:
В качестве положительного контрольного образца применяли культуральный вирус АЧС штамм «Волгоград/14с» и отрицательный контроль (деионизированная вода).
В проведенных нами исследованиях Шкаликова М.В. с соавт., 2018 плечи рекомбинации представляли собой фрагменты генома вируса АЧС, расположенные слева и справа от гена A238L и имели длину 972 п.о. и 966 п.о. соответственно. Для дальнейшего скрининга рекомбинантных клонов в качестве репортерного гена в конструкции был использован ген, кодирующий зеленый флуоресцентный белок EGFP, под контролем промотера гена B646L (белок р72) вируса АЧС (рисунок 15).
Для дальнейшей работы, полученные ПЦР-продукты, очищали, концентрировали и проводили рестрикцию правого плеча рекомбинации гена A238L и EGFP -белка с помощью рестриктазы XhoI (набор FastDigest Value Pack, «Thermo Fisher Scientific», Германия) в течение 16 часов при температуре 37С.
Далее полученный фрагмент правого плеча рекомбинации гена A238L и EGFP-белка лигировали с плазмидой в соотношении вектор/вставка 1:6 (набор T4 DNA Ligase,«New England Biolabs», США) при температуре 10С в течение ночи.
Полученную лигированную смесь клонировали по тупым концам в состав плазмидного вектора pMiniT 2.0. («New England Biolabs», США) согласно инструкции производителя и проводили трансформацию химически компетентных клеток E.coli XL1-Blue. В качестве положительного контроля трансформации использовали 1 l плазмиды pGEM Easy со встроенным геном D117L (1 ng/l).
В результате проведенной работы была получена рекомбинантная плазмида, содержащая ген флуоресцентного белка EGFP и фрагмент гена A859L с межгенным регионом штамма Волгоград/14с вируса АЧС (рисунок 16).
Наличие специфической вставки нуклеотидной последовательности белка EGFP и правого плеча рекомбинации гена A238L в составе полученной плазмиды подтверждали постановкой ПЦР с применением универсального праймера на тело плазмиды (Cloning Analysis Forward Primer) и обратного праймера, комплементарного правому плечу гена A238L (рисунок 17).
Для дополнительного подтверждения наличия вставок в плазмидах проводили рестрикцию с использованием эндонуклеаз BamHI и Sall с последующим электрофорезом в 1,5% агарозном геле. В результате электрофореза нами были получены фрагменты с необходимым размером вставки (1900 п.н.). Для дальнейшей работы и накопления плазмидной ДНК был выбран клон №2 несущий флуоресцентный белок EGFP+правое плечо рекомбинации.
На следующем этапе с помощью рестриктаз SpeI-HF и Sall из рекомбинантного вектора pMiniT 2.0. вырезали вставку флуоресцентного белка EGFP+правое плечо рекомбинации необходимой длины и очищали из агарозного геля коммерческим набором.
На следующем этапе проводили рестрикцию левого плеча рекомбинации и плазмидного вектора pGEM Easy («Promega», США) с помощью эндонуклеаз SphI и SpeI согласно инструкции изготовителя («NEB», США) с последующим лигированием и трансформацией химически компетентных клеток E.coli XL1-Blue.
Проверку наличия специфической вставки фрагмента гена MGF360-15R с межгенным регионом осуществляли с помощью ПЦР с использованием олигонуклеотидных праймеров, комплементарных последовательности левого плеча рекомбинации гена A238L.
При анализе методом электрофореза использовали положительный контрольный образец (культуральный вирус АЧС штамм «Волгоград/14с») и отрицательный контроль (деионизированная вода) (рисунок 18).
Схема конструирования рекомбинантной плазмиды pGEM Easy с делецией гена A238L и вставкой флуоресцентного белка EGFP представлена на рисунке 19.
Полногеномное секвенирование рекомбинантного вируса (штамм Волгоград/14с A238L)
Первым этапом при проведении полногеномного секвенирования было накопление рекомбинантного вируса Волгоград/14с A238L в культуре клеток COS-1. Для этого в 6-луночные планшеты высевали 1,21 06 клеток и инфицировали рекомбинантным вирусом Волгоград/14с A238L с множественностью заражения 1,0 ТЦДзо/кл и инкубировали в СО2-инкубаторе 3 дня при температуре (37±0,5)С в поддерживающей среде DMEM/F-12 с 5% эмбриональной телячьей сыворотки.
После этого отбирали вируссодержащую культуральную жидкость и клеточный монослой лизировали TEN буфером с 0,2% SDS. Далее образцы переносили в 1,5 мл пробирку типа «Eppendorf», добавляли РНКазу А (0,2 мг/мл) («Thermo Fisher Scientific», Германия) и инкубировали 1 час при 37С. Далее суспензию лизировали Proteinase К (0,4 мг/мл) («QIAGEN», Германия) при 56С в течение 120 мин и затем ДНК переосаждали этанолом.
Для подготовки библиотеки генов были использованы 17 пар олигонуклеотидных праймеров, фланкирующих фрагменты генома вируса АЧС от 2,5 тыс п.н. до 18 тыс. п.н.
Для наработки продуктов амплификации использовали набор для ПЦР с LongAmp Taq ДНК-полимеразой («NEB», США) согласно инструкции производителя по следующей программе амплификации:
Денатурация: 94С - 30 сек;
Амплификация: 94С - 15 сек;
53С- 30 сек; - 30 циклов 65С - 15 мин;
Элонгация: 65 С- 10 мин; 12С- .
Визуализацию ПЦР-продуктов осуществляли методом электрофореза в 1,5% агарозном геле. После наработки ампликонов проводили определение их концентраций с помощью флуориметра Qubit 4 («Thermo Fisher Scientific», Германия) и ДНК очищали методом этанольной преципитации.
Эквимолярная смесь была подготовлена с помощью набора для секвенирования ДНК с лигированием Ligation Sequencing Kit («Oxford Nanopore Technologies», Великобритания). Определение полногеномной последовательности проведено на нанопоровом секвенаторе MinION («Oxford Nanopore Technologies», Великобритания) с использованием проточной ячейки FLO-MIN106D.
Для сборки полученных ридов использовали программу Geneious Prime (https://www.geneious.com).
В результате полногеномного секвенирования получена нуклеотидная последовательность рекомбинантного вируса АЧС Волгоград/14с A238L.
При сравнении полногеномной последовательности рекомбинантного вируса АЧС (штамм Волгоград/14с A238L) с геномом референс - штамма Georgia 2007/1 (FR682468) идентичность составила 99%, что свидетельствует о том, что в рекомбинантном вирусе присутствует незначительное количество нуклеотидных замен.
При анализе полученной нуклеотидной последовательности рекомбинантного вируса обнаружена десятинуклеотидная встройка в области межгенного региона I73R/I329L (TRS+), присутствующая у изолятов, выделенных на территории Российской Федерации после 2012 года.
Наибольший интерес представляет фрагмент генома рекомбинантного вируса (штамм Волгоград/14с A238L), фланкируемый парой праймеров с позициями 35895 п.н. - 53030 п.н., комплементарной геному штамма Georgia 2007/1), поскольку в позиции с 50471 по 51151 п.н. расположен ген A238L.
Таким образом, в результате полногеномного секвенирования рекомбинантного вируса АЧС (штамм Волгоград/14с A238L), нами обнаружена специфическая делеция гена A238L, а вместо этого гена в составе полученного нами вируса выявлен ген флуоресцентного белка EGFP.