Содержание к диссертации
Введение
РАЗДЕЛ 1. Обзор литературы 21
1.1. Горизонтальный перенос генов 21
1.1.1. Основные пути коммуникации бактерий 33
1.1.1.1. Трансформация 40
1.1.1.2. Трансдукция 43
1.1.1.3. Абортивная трансдукция 45
1.1.1.4. Неспецифическая (общая, генерализованная) трансдукция 45
1.1.1.5. Ограниченная (специфическая) трансдукция 45
1.1.1.6. Конъюгация и мобилизация плазмид 46
1.1.1.7. Hsd плазмиды и их репликоны: механизмы распределения плазмид между бактериями
1.2. Места коммуникации бактерий и горизонтальный перенос генов 56
1.3. Факторы, ограничивающие горизонтальный перенос генов 62
1.3.1. Роль систем рестрикции-модификации ДНК в горизонтальном переносе генов среди микроорганизмов 63
1.3.1.1. Основные понятия о системах рестрикции-модификации ДНК 67
1.3.1.2. Классификация и номенклатура ферментов систем рестрикции-модификации 70
1.3.1.3. Системы рестрикции-модификации I типа 73
1.3.1.4. Cистемы рестрикции-модификации III типа 83
1.3.1.5. Cистемы рестрикции-модификации IV типа 84
1.3.1.6. ДНК-метилтрансферазы 86
1.4. Эндонуклеазы рестрикции II типа 102
1.4.1. Обнаружение и первые описания эндонуклеаз рестрикции II типа, классификация и их общие свойства 102
1.4.2. Очистка ферментов систем рестрикции-модификации II типа 103
1.4.3. Клонирование и определение нуклеотидных последовательностей генов систем рестрикции-модификации, получение
штаммов – суперпродуцентов этих ферментов 106
1.4.4. Структурные особенности эндонуклеаз рестрикции типа II и их эволюция 107
1.4.5. Процессы связывания и узнавания ДНК эндонуклеазами типа II 113
1.4.6. Подтипы эндонуклеаз рестрикции типа II 118
1.4.7. Группирование эндонуклеаз рестрикции по структуре каталитического центра 131
1.4.8. Механизм каталитического расщепления ДНК эндонуклеазами рестрикции типа II 137
1.4.9. Молекулярная организация генов систем рестрикции-модификации 143
1.5. Горизонтальный перенос генов систем рестрикции-модификациии скоординированная регуляция экспрессии их отдельных генов 146
1.5.1. Регуляция экспрессии генов систем рестрикции-модификации I и III типов 150
1.5.2. Регуляция экспрессии генов систем рестрикции-модификации II типа 152
1.5.3. Роль систем рестрикции–модификации в эволюции бактерий 156
1.5.4. Распространение систем рестрикции-модификации ДНК 161
1.5.5. Локализация генов систем рестрикции-модификации 169
1.5.6. Участие мобильных генетических элементов в переносе генов систем рестрикции-модификации 172
РАЗДЕЛ 2. Материалы и методы исследований 176
2.1. Материалы 176
2.1.1. Штаммы бактерий, бактериофагов и плазмидные вектора 176
2.1.2. Материалы, реактивы и ферменты
1 2.1.2.1. Питательные среды 178
2.1.2.2. Среды и основные буферы 179
2.2. Методы исследования 180
2.2.1. Общие, широко используемые методы 180
2.2.2. Поиск штаммов-продуцентов сайт-специфических эндонуклеаз 180
2.2.3. Получение бактериальной биомассы 181
2.2.4. Выделение ДНК
2.2.4.1. Выделение плазмидных ДНК 182
2.2.4.2. Выделение ДНК фагов cI857 и 80vir 185
2.2.4.3. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 185
2.2.4.4. Препаративное выделение фрагментов ДНК из легкоплавкой агарозы 186
2.2.4.5. Препаративное выделение фрагментов ДНК из полиакриламидных гелей 186
2.2.5. Обнаружение и описание систем рестрикции-модификации 187
2.2.5.1. Периодическое культивирование штаммов 187
2.2.5.2. Выделение и очистка обнаруженных сайт-специфических эндонуклеаз 188
2.2.5.3. Определение ферментативной активности сайт-специфических эндонуклеаз 190
2.2.5.4. Реакция метилирования in vivo и in vitro 190
2.2.5.5. Определение типа цитозинового метилирования, осуществляемое МCfrBI 191
2.2.5.6. Тестирование метилтрансферазной активности ферментов 6His-M Eco29kI и 6His-RM Eco29kI 192
2.2.5.7. Определение сайта узнавания и места расщепления фосфодиэфирной связи на субстратной ДНК, обнаруженных сайт-специфических эндонуклеаз 193
2.2.5.8. Определение точки разрезания фосфодиэфирной связи R CfrBI на молекуле субстратной ДНК 194
2.2.5.9. Определение локализации метилированного основания в последовательности сайта CfrBI 195
2.2.5.10. Определение сайта метилирования ДНК-метилтрансферазы M Eco29kI 198
2.2.6. Определение нуклеотидной последовательности ДНК 198
2.2.6.1. Определение нуклеотидной последовательности плазмиды pECO29 200
2.2.6.2. Определение нуклеотидной последовательности плазмиды pECL18 200
2.2.6.3. Определение нуклеотидной последовательности плазмиды pKPN2 201
2.2.6.4. Определение нуклеотидной последовательности плазмиды pLG13 202
2.2.6.5. Определение нуклеотидной последовательности плазмиды pZE8 202
2.2.6.6. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей плазмид
2 2.2.7. Транскрипция in vitro 203
2.2.8. Определение активности галактокиназы 204
2.2.9. Измерение концентрации белка 205
2.2.10. Определение молекулярной массы белков в нативных условиях 205
2.2.1. Измерение 3H–меченых препаратов 205
РАЗДЕЛ 3. Результаты исследований и их обсуждение 206
3.1. Поиск сайт-специфических эндонуклеаз и анализ коллекции энтеробактерий, несущих гены систем рестрикции-модификации 206
3.2. Зависимость частоты встречаемости активных генов СРМ от состояния окружающей среды 210
3.3. Взаимное расположение генов систем рестрикции-модификации, сравнительный анализ первичной структуры их основные биохимические свойства и явление изошизрмерии 213
3.4. Конструирование штаммов с повышенным уровнем синтеза отдельных белков систем рестрикции – модификации 218
3.5. Основные биохимические свойства выделенных ферментов 222
3.6. Сравнительный анализ каталитических центров различных эндонуклеаз рестрикции 224
3.7. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов СРМ и их окружения 2 3.7.1. Общая характеристика Hsd плазмид 231
3.7.2. Репликаторы плазмид и их несовместимость 232
3.7.3. Мобилизация hsd плазмид 235
3.7.4. Межплазмидная рекомбинация участвует в эволюции hsd плазмид 236
3.7.5. Модель рекомбинации между мультикопийными плазмидами с участием bom и cer генетических детерминант 237
3.7.6. Рекомбинация между мультикопийными плазмидами с участием bom и cer генетических детерминант 240
3.8. Регуляция экспрессии отдельных генов систем рестрикции-модификации 245
3.8.1. Регуляция экспрессии отдельных генов CfrBI 247
3.9. Пути эволюционного процесса для СРМ типа II 253
3.9.1. Конструирование бифункционального гибридного белка, несущего эндонуклеазную и метилтрансферазную активности Eco29kI 254
3.9.2. Роль N-связывающего домена в эволюционном разнообразии эндонуклеаз рестрикции типа II 258
Заключение 265
Выводы 268
Список сокращений 270
Список литературы 272
- Hsd плазмиды и их репликоны: механизмы распределения плазмид между бактериями
- Обнаружение и первые описания эндонуклеаз рестрикции II типа, классификация и их общие свойства
- Определение нуклеотидной последовательности плазмиды pKPN2
- Конструирование бифункционального гибридного белка, несущего эндонуклеазную и метилтрансферазную активности Eco29kI
Введение к работе
Актуальность темы. В течение последних двадцати лет, наблюдается настоящий
бум в изучении горизонтального переноса генов (ГПГ) — процесса, при котором организм
передаёт генетический материал другому организму, не являющемуся его потомком. В
течение долгого времени, эволюционная теория исходила из наличия лишь вертикального
переноса, когда организм получает генетический материал от своего предка. Однако
расчеты показали, что при таком изолированном переносе генов и эволюции отдельных
видов на основе случайной мутации и селекции, жизнь просто не имела достаточно
времени, чтобы в относительно короткий период своего существования эволюционировать
от простейших форм к такой высокоорганизованной форме, как млекопитающие. С
открытием ГПГ между различными видами и даже царствами живых организмов стало
очевидно, что перенос генов является важным фактором эволюции прокариот. Работы в
области геномики доказали, что ГПГ был и остается одним из главных механизмов
видообразования. Возможность ГПГ и закрепления генов в чужеродном окружении делает
"удачное изобретение" одного вида, доступным для других и предоставляет широкие
возможности заимствования почти для любого организма. Биосфера в данном случае,
выступает в качестве общей информационной среды, в которой различные мобильные
генетические элементы (МГЭ) способны распространять информацию. ГПГ включает в
себя обмен генетическим материалом между различными организмами в течение одного
поколения. Вклад ГПГ в эволюцию живых организмов существенен, имеет большие
практические и теоретические последствия, которые включают понимание межвидовой
проницаемость границ, построение дерева жизни, правила таксономической
номенклатуры, а также обеспечения биоразнообразия живых существ. Активный перенос генов может происходить в симбиотических, паразитарных или ассоциативных системах, где осуществляется физический контакт клеток. В сущности, современная генетическая инженерия, использующая разные векторы, базируется на принципах ГПГ, хотя раньше не было четкого понимания того, что такого рода генная инженерия всегда была широко распространена в природе и играет важную роль в эволюции всего живого.
Системы рестрикции-модификации (СРМ), участвующие в ограничении роста фагов
некоторыми штаммами бактерий с последующей модификацией их ДНК ферментативной
системой хозяина, широко распространены среди различных микроорганизмов и играют
важную роль в обеспечении межклеточных барьеров, ограничивающих ГПГ и, тем самым,
способствующих увеличению биологического разнообразия микроорганизмов. Обычно
СРМ включают эндонуклеазу рестрикции (ЭР) и модифицирующую ДНК-
метилтрансферазу (МТ), узнающих одинаковые последовательности ДНК длиной 4-8 пар
оснований. Функционирование СРМ начинается с метилирования последовательностей
узнавания МТ. Все немодифицированные сайты узнавания расщепляются
соответствующей ЭР, таким образом СРМ относятся к системам, обеспечивающими
контроль стабильности бактериальных геномов. СРМ выступают в качестве бактериальной
иммунной системы, которая разрушает, проникающую в клетку чужеродную ДНК,
ограничивает межклеточную бактериальную передачу генов (миграционный контроль) и
отвечает за сохранение и, в конечном итоге, обеспечивает биологическое разнообразие.
Гены СРМ можно рассматривать как простейшую форму жизни, чьё “эгоистичное
существование” не имеет никакой цели, кроме, как целей присущих всем биологическим
организмам и социальным структурам – обеспечение комфортного существования,
эффективное воспроизведение и наиболее широкое распространение. Ярким примером
межклеточных (бактериальных) взаимодействий может служить семейство
энтеробактерий, естественной средой обитания которых является кишечник человека и животных. В научной литературе появляется все больше доказательств об участии СРМ не только в ограничении ГПГ, но и о способности самих генов СРМ к ГПГ между различными отдельными видами микроорганизмов. Изучение СРМ в качестве участника межбактериального переноса генов расширяет наше понимание механизмов этого переноса, его биологического значения. Таким образом, актуальность проведения комплексных исследований СРМ не вызывает сомнений и определяет понимание основных механизмов, обеспечивающих возможность проникновения, существования и закрепления, функционирующих СРМ в бактериальных клетках.
Степень разработанности темы исследования. В настоящей диссертационной работе на примере изучения нескольких СРМ семейства Enterobacteriaceae осуществлено комплексное исследование, включающее в себя сравнительную характеристику этих систем с рассмотрением явления изошизомерии, изучение генетической локализации и организации генов ряда этих систем, детальный анализ особенностей регуляции экспрессии отдельных генов СРМ, а, также путей возможной их эволюции.
Объекты исследования, цель и задачи работы. СРМ плазмидной локализации из различных видов и штаммов семейства Enterobacteriaceae выбраны в качестве объекта исследования по нескольким причинам. СРМ представляют интерес для проведения перекрестных сравнительных биохимических и молекулярно-биологических исследований в связи с наличием множества изошизомеров – ферментов с одинаковой специфичностью узнавания выделенных из различных видов микроорганизмов. Основные подходы в исследовании ГПГ СРМ включают клонирование, определение первичной структуры генов СРМ, их генетического окружения, проведение сравнительного анализа самих генов и белков, кодирующих эти системы, а также моделирование процессов их эволюции. Комплексный подход в изучении СРМ позволяет провести анализ возможных механизмов распространения генов СРМ, их переноса в чужеродное генетическое окружение и закрепления в новых хозяйских клетках. Многие СРМ локализованы на мультикопийных плазмидах сравнительно малого размера (hsd плазмиды). Небольшой размер этих плазмид позволяет значительно упростить описания генетического окружения генов СРМ, локализованных на hsd плазмидах. Выяснение структурной организации подобных
плазмид дает понимание причин широкого распространения этих систем, т.е. в изучении
путей ГПГ. Наличие множества подтипов СРМ может говорить о том, что процесс
формирования СРМ происходит до сих пор и обеспечивает возможность
экспериментальной реконструкции этих процессов.
Целью настоящей работы явилось проведение комплексного исследования СРМ энтеробактерий для выяснения путей и механизмов ГПГ СРМ II типа. Для достижения поставленной цели, решались следующие задачи:
-
Провести широкий поиск СРМ среди различных видов и штаммов Enterobacteriaceae.
-
Определить локализацию генов, обнаруженных СРМ.
-
Сконструировать штаммы с повышенным синтезом ферментов СРМ, разработать схемы получения функционально чистых и гомогенных препаратов ферментов, необходимых для проведения фундаментальных исследований их ферментативных свойств.
-
Провести анализ биохимических свойств ферментов, определить последовательность узнавания, идентифицировать как природу метилирования, так и нуклеотид, несущий метильную группу, а для ЭР определить место расщепления ДНК.
-
Охарактеризовать ДНК-связывающие и каталитические свойства отдельных ЭР, а также описать механизм гидролиза ДНК этими ферментами.
6. Выявить особенности структуры каталитических центров отдельных ЭР.
-
Провести сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов СРМ и их генетического окружения.
-
Определить полные нуклеотидные последовательности отдельных природных hsd – плазмид, описать их организацию.
-
Исследовать репликативные свойства, механизмы мобилизации и детерминанты стабильного наследования hsd плазмид и путей возможного межплазмидного переноса генов СРМ.
-
Определить основные принципы скоординированной регуляции экспрессии отдельных генов СРМ.
-
В качестве моделей эволюционного процесса, приводящего к возникновению новых подтипов СРМ, сконструировать слитый в единый полипептид, бифункциональный гибридный белок RM.Eco29kI, и гибридный белок, содержащий N-концевой домен EcoRII и полноразмерный Ecl18kI на одной полипептидной цепи.
Научная новизна и практическая ценность работы. В работе проведено комплексное исследование СРМ. Разработаны методы очистки более 40 сайт-специфических ЭР из коллекции штаммов семейства Enterobacteriaceae. Предложен биологический метод, основанный на определении частот встречаемости СРМ среди микроорганизмов который позволит фиксировать изменения в экосистемах в условиях слабого радиоактивного или иного загрязнения для оценки риска и прогнозирования последствий проживания людей на этих территориях. Показана плазмидная локализация генов СРМ II типа Eco15zI, Eco19nI,
Eco29kI, Eco30kI, Eco35kI, Eco41vI, Eco63cI, Eco3122I, EcoA2I, EcoKI, EcovkI, Ecl64kI,
Ecl80kI, Kpn2kI и Kpn48kII и определены их субстратные специфичности, точки
расщепления ДНК и некоторые биохимические характеристики ферментов этих систем.
Для отдельных МТ, впервые определены типы метилирования ДНК и место введения
метильной группы. Проведено генетическое картирование и впервые установлена
структурно-функциональная организация генов и плазмид, несущих СРМ II типа: EcoRV,
CfrBI, Ecl18kI, Eco29kI. Установлено, что первые три СРМ имеют дивергентный тип
организации генов. Промоторные области генов в различной степени перекрываются в
случае СРМ CfrBI, Ecl18kI и не перекрываются у генов EcoRV. Гены СРМ Eco29kI
расположены друг за другом, при этом ген, кодирующий ЭР, расположен перед геном МТ,
и стартовая точка трансляции МТ перекрывается со стоп кодоном ЭР. Определена полная
структура ряда hsd плазмид. Впервые продемонстрирована роль bom и cer локусов в
рекомбинации и в структурной эволюции мультикопийных плазмид. Экспериментально
подтверждена предложенная модель рекомбинации между плазмидами. Все описанные
нами hsd плазмиды можно разделить на две группы, отличающиеся, по размеру, структуре
участка cer и по наличию генов мобилизации, что определяет возможность использования
мультикопийными плазмидами разных механизмов переноса из одних энтеробактерий в
другие с помощью коньюгативных плазмид. Полученные в работе данные, расширяют
современные представления о структурной организации и регуляции активности генов в
СРМ II типа, а также возможных путях, и механизмах закрепления генов СРМ в
чужеродном окружении при ГПГ. Предложена и экспериментально подтверждена модель
регуляции экспрессии генов СРМ CfrBI, основанная на зависимости эффективности
транскрипции с промоторов генов системы от метилирования цитозинов в
последовательности уникального сайта узнавания ферментов этой системы,
расположенного в перекрывающихся промоторных областях генов СРМ. Механизм
регуляции активности генов в СРМ CfrBI представляет собой новый способ регуляции
экспрессии генов в СРМ II типа. Особенности структуры и каталитических свойств
отдельных ферментов СРМ могут определять возможность переноса их генов в
чужеродное окружение, за счет задержки или отставания рестрикции относительно
модификации ДНК. Исследование эндонуклеазы СРМ Ecl18kI, узнающей и
катализирующей последовательность нуклеотидов /CCNGG показало присутствие этого
белка в растворе в виде димера, в то время как его функционирование, включая
специфическое узнавание ДНК, требовало тетрамерной структуры. Необходимость
создания тетрамерной структуры диктует требование высокой концентрации мономеров в
бактериальной клетке, которое может обеспечивать некоторую задержку
функционирования ЭР относительно МТ, активной в мономерной форме и не требующей ионов Mg2+ для осуществления ферментативной реакции. Продемонстрировано, что активный центр Ecl18kI включает последовательность аминокислот 159VDX21RKX12E, отличающуюся от канонической для многих ЭР. Eco29kI, независимо от наличия Mg2+,
узнает палиндром, характерный для IIP подкласса. Мономеры этого фермента димеризуются на субстрате подобно ЭР IIS подкласса, причем за один оборот реакции Eco29kI расщепляет обе цепи ДНК как ферменты подкласса IIP. Мутационный анализ продемонстрировал наличие структурного подобия каталитического центра эндонуклеазы Eco29kI с интронными эндонуклеазами семейства “GIY-YIG”. Полученный результат может говорить о возможных путях эволюции самих СРМ. Искусственно получен и охарактеризован бифункциональный гибридный фермент RM.Eco29kI, содержащий в составе одной полипептидной цепи обе активности, как для СРМ IIC, причем, метилтрансферазная активность гибридного RM.Eco29kI составляет 80% от активности нативного белка, в то время как для эндонуклеазной реакции удельная активность гибридного белка - 33%, что также может обеспечивать задержку проявления рестрикции относительно модификации ДНК. Функциональное слияние белков в процессе эволюции возможно не только полными последовательностями, но и отдельными доменами. Такое слияние изменяет доменную структуру белка и как следствие может изменять его общую структурную организацию и функциональные свойства ферментов. Получен и охарактеризован функционально активный гибридный полипептид NCRII-18 на базе ЭР Ecl18kI с пришивкой N-концевого ДНК-связывающего домена EcoRII. Показано, что рекомбинантный белок NCRII-18 при сохранении специфичности Ecl18kI имеет пониженную гидролитическую активность по сравнению с интактной ЭР Ecl18kI. В результате изменился способ взаимодействия с субстратом. Гибридный белок NCRII-18 подобно EcoRII связывает субстрат с двумя сайтами узнавания с меньшей константой диссоциации, чем субстрат с одним сайтом. Таким образом, N-домен в гибридном ферменте выступает в роли негативного регулятора гидролитической активности и способен оказывать воздействие на его ДНК-связывающие свойства.
Методология и методы исследования. В работе используется широкий спектр генетических, микробиологических, биохимических и молекулярно-биологических современных методов, необходимых для проведения комплексного исследования СРМ Методы исследования, соответствуют поставленным в работе целям и задачам.
Основные результаты исследования, выносимые на защиту. Проведены
систематический поиск, очистка, идентификация и анализ специфичности продуктов генов СРМ в штаммах семейства Enterobacteriaceae. Получены доказательства горизонтального распространения генов СРМ плазмидной локализации среди представителей этого семейства. Плазмиды, несущие гены СРМ, относятся к двум группам несовместимости с реликаторами типа ColE1. Описанные нами hsd плазмиды можно разделить на две группы, отличающиеся, по размеру, структуре участка cer и по наличию генов мобилизации, что определяет использование разных механизмов переноса из одних энтеробактерий в другие в присутствии коньюгативных плазмид. На основании определения последовательностей геномов плазмид с генами СРМ II типа предложен и экспериментально доказан механизм межплазмидной рекомбинации, пути коньгативного переноса этих плазмид и структурной
эволюции плазмид, обусловленных сопряжением bomХсer рекомбинации. Предложена и
экспериментально подтверждена модель «маятниковой» регуляции экспрессии генов СРМ
CfrBI. Скоординированная работа промоторов генов cfrBIM и cfrBIR, обеспечивается
регулируемой модификацией ДНК в сайте CfrBI и отражает основной смысл регуляции
генов СРМ, который заключается в опережении экспрессии гена МТ относительно
экспрессии гена ЭР. Детальное изучение кинетики взаимодействия белков СРМ с
участками узнавания на ДНК демонстрирует наличие дополнительных возможностей
регуляции этих систем на белковом уровне для обеспечения их существования в
бактериальной клетке и ГПГ этих систем в чужеродное окружение. Приведены прямые
доказательства того, что в результате нескольких точечных мутаций может возникнуть
мультифункциональный белок с новыми биохимическими свойствами. Эволюционный
процесс ЭР EcoRII возможно пошел путем уменьшения эффективности и скорости
гидролиза ДНК, обеспечивая значительную задержку гидролиза ДНК относительно ее
модификации за счет перестройки общей структуры фермента введением дополнительного
домена, изменяющего механизм взаимодействия ЭР с ДНК. Наличие этой задержки
является существенным при ГПГ СРМ. Степень достоверности, публикации и
апробация результатов. Достоверность результатов исследования подтверждается
большим количеством публикаций в рецензируемых изданиях. За время проведения этой
работы вышло в свет более 100 статей и патентов: из них непосредственно по материалам
представляемой работы 48 экспериментальных статей, 5 обзорных статей,
зарегистрировано более 20 авторских свидетельств и патентов РФ. Результаты работы были представлены на многих всесоюзных, всероссийских и международных конференциях. Использование в качестве основного объекта исследований СРМ, локализованных на hsd плазмидах, позволили с достоверностью определить пути и механизмы ГПГ СРМ и их закрепления в другом микроорганизме. Научные положения, выводы, сформулированные в диссертации, подкреплены убедительными фактическими данными, наглядно представленными в приведенных таблицах и рисунках. Подготовка, анализ и интерпретация полученных результатов проведены с использованием современных методов обработки информации.
Основные положения диссертации были представлены на совместном семинаре отдела молекулярной биологии и генетики микроорганизмов и на Ученом Совете ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН.
Личный вклад автора. В комплексных исследованиях, включенных в работу, автору принадлежит решающая роль в выборе основного направления исследований, экспериментальной стратегии, в обсуждении, интерпретации, обобщении полученных результатов. Автор принял деятельное участие в разработке экспериментальных походов, использованных в работе. Обсуждаемые в работе результаты были получены либо лично автором, либо руководимыми им студентами, магистрантами, аспирантами и научными сотрудниками. Работа выполнена в 1981-2017 годах в ИБФМ РАН. На различных этапах в
ней принимали участие научные сотрудники отдела молекулярной биологии и генетики
микроорганизмов ИБФМ РАН и ряда других подразделений этого и других институтов
РАН, а также некоторые иностранные исследователи.
Благодарности. Автор выражает благодарность всем сотрудникам отдела молекулярной
биологии и генетики микроорганизмов ИБФМ РАН, принимающим участие в данной
работе. Их вклад адекватно отражен в соответствующих публикациях.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы,
Hsd плазмиды и их репликоны: механизмы распределения плазмид между бактериями
Последние 20 лет широко проводятся работы по определению полных геномом как прокариотических, так и эукариотических организмов. Одним из важнейших результатов этого тотального исследования является вывод о мозаичности геномов [Koonin. et al.,2001; Nakamura et al., 2004; McDaniel et al., 2010]. Филогенетический анализ 144 геномов прокариот показал, что, хотя практически вся генетическая информация передается вертикально (организм получает генетический материал от своего предка), гены часто передаются по горизонтали в результате процесса, в котором организм передаёт генетический материал другому организму, не являющемуся ему потомком. [Beiko et al. 2005]. Долгое время эволюционная теория базировалась на представлении о том, что отдельные виды не могут обмениваться друг с другом наследственной информацией. На сегодня ясно, что любое "удачное приобретение" одного из организмов становится общедоступным и может быть использовано всеми остальными, живущими рядом, способными к физическому контакту напрямую или через посредников. Одной из важнейших проблем в области исследований ГПГ, является сложность в понимании и определении факторов, от которых зависит возможность успешной передачи генов и их сохранения после переноса в эволюционном процессе.
В течение последних двадцати лет появилось множество работ, в которых продемонстрирована ключевая роль ГПГ в адаптации организмов к новым экологическим нишам [Gogarten, Townsend 2005], в приобретении целых популяций и отдельных бактерий новых функций [Pennisi 2004; Gogarten & Townsend 2005], в развитии метаболических сетей [Pal et al., 2005], и главное в видообразовании [Lawrence 1999]. Таким образом, у прокариотических организмов ГПГ является мощной силой эволюционных изменений и адаптации микроорганизмов. ГПГ позволяет бактериям адаптироваться к экологическим нишам и выживать в стрессовых условиях, когда недостаточно традиционной регуляции генов [Ragan & Beiko 2009]. Поток генов между различными видами представляет собой особую форму генетических изменений, последствия которых еще не оценены по достоинству. Передача генов среди бактерий также имеет важное медицинское значение, в связи с тем, что проявляется за счет ГПГ как в возникновении новых вирулентных штаммов [Keen 2012], так и в широком распространении множественной устойчивости к антибиотикам [Holden et al. 2004; Gal-Mor, & Finlay 2006]. Итак, изучение динамики и факторов, которые определяют эффективность ГПГ, являются важными в эволюционных, экологических и молекулярно-биологических исследованиях. ГПГ широко распространенное, но реально редкое явление, которое при определенном селективном давлении приобретает важное значение во всех выше перечисленных процессах. Этот тип потока генов настолько распространен, что лежит в основе многих современных тем в области микробиологии. Например, ГПГ несет ответственность за глобальное распространение устойчивости к антибиотикам [de la Cruz, F., Davies, J. 2000; Wellington E.M. et al., 2013], он формирует микробные сообщества у человека и животных [Tamames, J., Moya A. 2008], эти процессы связаны с формированием биопленок [Madsen J.S. et al., 2012], СРМ [Oliveira P.H. et al., 2014], системы CRISPR / CAS иммунитета [Marraffini, L.A., Sontheimer E.J. 2008], вирулентности [Moreno Switt A.L. et al. 2012; Wiles T.J. et al. 2013], и другие критические клеточные функции. Тем не менее, многие аспекты ГПГ до сих пор плохо изучены, и его общее воздействие на геномную эволюцию является предметом активного исследования [Aminov R. 2011; Darmon, E., Leach D.R. 2014]. Роль ГПГ в геномной эволюции, например, иллюстрируется на E. coli: в большинстве штаммов E. coli, 40% генома состоит из вариабельных генетических островов [Rasko et al. 2008]. Эти генетические элементы, как правило, кодируют конкретные свойства, определяющие способность выживания в определенной экологической нише и образ жизни E. coli [Chaudhuri, Henderson 2012]. Разнообразие настолько велико, что пангемон (полный комплект генов), обнаруженных среди всех штаммов E. coli, более девяти раз больше, чем набор основных генов у всех описанных штаммов кишечной палочки [Vieira et al. 2011]. Основными признаками, обеспечивающими выживание любой биологической системы от микроорганизмов до социумов и бизнеса, является наличие трех главных взаимозависимых признаков: комфортное существование, максимально широкое распространение и эффективное размножение. Отсутствие одного из этих условий резко ограничивает возможности выживания. Огромное количество потенциально важных генов, участвующих в ГПГ обеспечивает быстрое развитие новых штаммов со специфическими чертами, определяющими выживание и комфортное существование в различных экологических нишах [Boucher Y et al. 2003; de la Cruz, Davies, J. 2000; Didelot X et al., 2012].
Окончательное закрепление генов в чужеродном окружении зависит от наличия молекулярных механизмов для встраивания чужеродных кусков ДНК в хозяйский геном за счет общей гомологичной или негомологичной рекомбинации [Didelot et al., 2012]. Для эффективного ГПГ, кроме некого посредника для "транспортировки" генетической информации между организмами и клетками необходим молекулярный механизм для встраивания чужеродных кусков ДНК в хозяйский геном и (или) селективное поддержания перенесенных генов. Эффективность ГПГ в некоторых случаях зависит от возможности поддержания чужеродной генетической информации в виде отдельных генетических структур, например, таких как плазмиды и бактериофаги. [Kingston, et al., 2015]. Бактериофаги для бактерий, а вирусы для эукариотических клеток, способны выполнять функции ГПГ, поскольку они могут включать в свой геном участки хромосомальной ДНК и "пересекать" видовые границы [Benveniste et al., 1976, Bishop, 1981]. В сущности, современная генетическая инженерия, использующая разного типа векторы, базируется на принципах ГПГ, хотя еще недавно не было четкого понимания того, что такого рода генная инженерия широко распространена в природе и играет важную роль в эволюции. Вклад ГПГ в эволюцию живых организмов достаточно велик и имеет большие практические и теоретические последствия. К последним, можно отнести понимание проницаемости межвидовых границ, построения древа жизни, правила таксономической номенклатуры, а также обеспечения биоразнообразия. Изучение горизонтального переноса генов может повлиять на наши представления об эволюционной изменчивости, включая значение создания филогенетических деревьев в качестве основной модели биологической истории вплоть до поиска универсального общего предка и переосмысление общей (высшей) таксономической номенклатуры. В эволюции бактерий горизонтальный генетический обмен играет ту же роль, что и половое размножение у высших организмов. У организмов, размножающихся половым путем, гены родителей перемешиваются в геноме потомства. Это позволяет естественному отбору работать не с целыми геномами, а с отдельными генами, поддерживая удачные варианты и отбраковывая неудачные. Считалось, что у бактерий отбор работает в основном на уровне целых геномов, что менее эффективно. Теоретически, горизонтальный обмен генами может отчасти заменить бактериям половое размножение. Однако было неясно, в какой степени - это характерно для природных популяций микробов. Изучив две близкородственные популяции морских бактерий Vibrio tasmaniensis sp. nov., выделенных из атлантического лосося и морских креветок, недавно начавших приспосабливаться к разным экологическим нишам, пришли к выводу, что адаптивная эволюция бактерий идет за счет распространения отдельных генов, а не целых геномов, то есть так же, как у организмов, размножающихся половым путем [Thompson et al., 2003]. Из этого следует, что в ходе адаптации к новым условиям горизонтальный генетический обмен успешно заменяет бактериям половое размножение.
Обнаружение и первые описания эндонуклеаз рестрикции II типа, классификация и их общие свойства
Одним из основных участников горизонтального переноса генов является системы рестрикции-модификации, которые обеспечивают ограничение проникновения чужеродной ДНК. Основная функция этих систем предотвращать проникновение чужеродных ДНК в клетку и, таким образом, обеспечивать стабильность бактериальных геномов. Эти системы выступают существенным фактором, определяющим биоразнообразие среди микроорганизмов.
Со времени открытия феномена ограничения роста фагов некоторыми штаммами бактерий и последующей модификации их ДНК ферментативной системой хозяина, широко дискутируется вопрос относительно механизмов распространения и биологической роли СРМ. Эти системы широко распространены среди различных микроорганизмов: их последовательности могут составлять до 10% генома микроорганизмов. В некоторых штаммах одновременно присутствует до 22 СРМ [Lin et al., 2001]. К настоящему времени обнаружено и охарактеризовано СРМ только типа II свыше 10000 с более чем 400 специфичностями узнавания нуклеотидных последовательностей. МТ защищает хозяйскую ДНК от расщепления соответствующей ЭР. СРМ служат защитным механизмом от проникновения в клетку чужеродной ДНК, обеспечивая поддержание целостности генома микроорганизмов, способствуют увеличению разнообразия их видов. Гены СРМ являются генами, обеспечивающими контроль стабильности бактериальных геномов. Это в свою очередь позволяет их относить к так называемым генам эволюции. СРМ играют важную селективную роль, например, в колонизации бактериями новых местообитаний [Korona et al., 1993]. Несмотря на определенную вероятность того, что фаги могут преодолеть защиту СРМ, бактерии, обладающие СРМ, оказываются более устойчивы к бактериофагам и, следовательно, получают преимущество при колонизации нового местообитания [Korona and Levin 1993]. Это преимущество авторы оценивают, как величину, обратную эффективности фаговой рестрикции – 10–108. Защитный эффект СРМ позволяет уменьшить плотность популяции, необходимой для заселения нового местообитания [Korona and Levin 1993]. Их функция состоит в генерации генетической изменчивости, способствуя увеличению скорости эволюции данной бактериальной популяции и увеличению её приспособляемости. СРМ играют важную селективную роль, например, в колонизации бактериями новых местообитаний. Некоторые авторы рассматривают гены СРМ как простейшую форму жизни, чьё “эгоистичное существование” не имеет никакой цели, кроме, как присущей всем биологическим организмам, – адаптироваться к экологической нише, воспроизводиться и распространяться. Таким образом, можно сказать, что исследования, касающиеся СРМ, пересекаются с вопросами, которые впрямую связанны с ГПГ.
Существует ряд доказательств, что гены этих систем подвержены горизонтальному переносу и обнаруживаются на различных мобильных генетических элементах [Sadykov et al., 2003], таких как, плазмиды, транспозоны, геномные островки и интегроны. В связи с этим гены СРМ способны быстро распространяться среди различных микроорганизмов. В 1996 году была опубликована работа, посвященная выяснению механизмов широкого распространения генов СРМ II типа за счет их горизонтального переноса между различными бактериальными популяциями [Jeltsch and Pingoud, 1996]. При сравнении частот встречаемости кодонов в известных нуклеотидных последовательностях ДНК генов 29 СРМ II типа и известных участках ДНК генома бактериальных клеток-хозяев, было обнаружено, что нуклеотидные последовательности ДНК генов СРМ: EcoRI, EcoRV, KpnI, SinI, SmaI и TthHB81 и ДНК штаммов-продуцентов значительно различаются между собой. Также было показано, что нуклеотидные последовательности ДНК генов различных ЭР существенно различаются по частоте использования кодонов между собой, тогда как между нуклеотидными последовательностями ДНК генов МТ такого различия не обнаружено. Полученные авторами данные свидетельствуют о том, что горизонтальная передача генов СРМ II типа между различными бактериальными штаммами может осуществляться посредством передачи сначала гена МТ и за тем уже гена ЭР.
В процессе установления этих систем в новых хозяйских клетках необходимо опережение экспрессии генов метилтрансфераз относительно генов эндонуклеаз рестрикции, так как ЭР способны атаковать немодифицированную хозяйскую ДНК и вызывать гибель клеток. С другой стороны, как отмечено ранее, существуют специальные механизмы, обеспечивающие поддержание этих систем в хозяйских клетках –так называемая «эгоистичность» генов. Гены СРМ могут включаться в геном как внутрь оперонов, так и в межгенные области. Введение СРМ индуцирует другие перестройки генома, такие как усиления и инверсии. Такая мобильность расширяет биологическое значение СРМ. ГПГ может осуществляться не только полной системой генов, но и отдельными частями генов, перенося определенные домены, обеспечивая эволюционно выгодные перестройки СРМ. Многоуровневое участие мобильных систем в качестве эпигенетических элементов обеспечивают широту прокариотической эволюции как различных генов бактерий, так и генов самих СРМ. С другой стороны, эгоистичность генов СРМ, которая выражается в гибели бактериальных клеток при потере этих генов обеспечивает поддержание этих систем в хозяйских клетках. Исследование механизмов ГПГ СРМ определит степень нашего понимания путей этого переноса среди микроорганизмов вообще, и эволюционных механизмов горизонтального переноса такого важного класса мобильных генов, как гены СРМ. Изучение СРМ в качестве участника межбактериального переноса генов расширяет наше понимание механизмов этого переноса, его биологического значения. Это определяет актуальность проведения комплексных исследований СРМ, включающих в себя (1) сравнительную характеристику различных СРМ и их компонентов, (2) выявление локализации этих генов вместе с описанием нуклеотидных последовательностей, входящих в окружение генов СРМ, (3) детальное описание механизмов регуляции экспрессии генов СРМ и (4) биохимическую характеристику продуктов этих генов (5) определение путей эволюции генов СРМ.
Определение нуклеотидной последовательности плазмиды pKPN2
Метилирование ДНК эукариотических организмов исследуется уже почти пять десятилетий: впервые в 1948 году 5-метилцитозин (m5C) в ДНК многоклеточных был обнаружен у животных, а затем в 1951 году у растений. За эти десятилетия сформировалось представление о видовой, онтогенетической, тканевой и клеточной специфичности явления метилирования ДНК. Уникальность этого явления заключается в том, что это, пожалуй, единственный тип модификации первичной структуры ДНК эукариотической клетки, контролируемый ее геномом.
Трудно сейчас назвать такие генетические процессы, на которые не оказывало бы влияние метилирования цитозиновых остатков в ДНК. Изменение статуса метилирования определенных сайтов в геноме может влиять на рестрикцию и экспрессию генов [Ehrlich, Ehrlich, 1993]; репарацию и репликацию ДНК [Tasheva, Roufa, 1994]; трансформацию, трансфекцию, транспозицию и рекомбинацию [Fedoroff, 1989; Engler et al., 1993]; частоту мутаций и полиморфизм генов [Sved, Bird, 1990]; (де) конденсацию, (ин) активацию хромосом и импритинг [Razin, Cedar, 1994]; разрывы, обмен и аберрации хромосом [Hare, Taylor, 1985; Bird, 1986]; образование Z-формы ДНК [Lock et al., 1987]; дифференцировку и иммортализацию клеток и другие процессы [Seyfert et al., 1990; Tollefsbol, Andrews, 1993; Vertino et al., 1996].
По мнению большинства исследователей, универсальная роль метилирования ДНК может осуществляться путем изменения доступности функционально важных участков генов для связывания с соответствующими регуляторными белками. Тем самым, этой модификации отводится роль высокоспециализированного эпигенетического кода, передающегося по наследству. Вместе с тем пока не ясно, например, что первично: влияние ли метилирования регуляторных элементов генов на их способность связываться с белковыми факторами, контролирующими эти гены или наоборот - активация генов в результате связывания с этими белками делает их регуляторные участки недоступными для МТ (Мазин и Ванюшин, 1987). Остается также полностью открытым вопрос о том, какие механизмы контролируют само метилирование ДНК.
Более того, идею об участии метилирования ДНК в генетической регуляции в принципе трудно совместить с тремя группами фактов. Во-первых, если метилирование ДНК действительно осуществляет какие-то жизненно важные функции, то, как объяснить полное отсутствие этой системы у многих видов эукариот, например, у дрозофиллы [Мазин и др., 1984]. Во-вторых, оказалось, что метилирование ДНК является одним из мощных генераторов мутаций в клетке и может, поэтому серьезно дестабилизировать работу генов [Мазин и Ванюшин, 1987 I; Мазин и Ванюшин, 1987 II]. В-третьих, обнаружена стохастическая потеря большей части, если не всех, остатков m5C из ДНК при старении тканей организма [Мазин, 1993] и клеточных структур [Мазин, 1993]. Таким образом, почти через 50 лет после открытия биологическая функция энзиматического метилирования ДНК все еще остается окончательно не установленной.
В приведенном в этом обзоре кратком анализе бактериальных МТ мы не затронули детальные механизмы переноса метильной группы разными подсемействами МТ, каталитические механизмы этих ферментов, роль ионов металлов в ферментативных реакциях, разнообразия кинетических механизмов ДНК-МТ и многое другое. Как представляется, детальный анализ этих ферментов требует отдельного обзора, хотя информации представленной выше, по-видимому, достаточно для общего понимания возможного участия генов, кодирующих МТ в горизонтальном переносе генов среди микроорганизмов. Как сказано выше у прокариотических организмов, изменения в экспрессии генов часто сопряжено с наблюдением изменений в метилировании ДНК. Такие изменения передаются по наследству из поколения в поколение без изменений в последовательности ДНК. Метилирование ДНК влияет на термодинамическую стабильность ДНК в тоже время метилирование специфических остатков на ДНК может влиять на различные белок-ДНК взаимодействия. Метилирование ДНК у микроорганизмов регулирует множество физиологических процессов в бактериальной клетке, включая транскрипцию ДНК репарацию и инициацию репликации и т.д. В научной литературе представлено множество сообщения указывающих на роль метилирования ДНК в регуляции экспрессии ряда генов вирулентности и в патогенезе, таким образом, делая ДНК МТ возможными мишенями для разработки терапевтических средств [Kumar R., Rao D.N. 2013].
Первой выделенной и очищенной ЭР типа II является HindII из Haemophilus influenzae Rd. Это событие было описано Хамильтоном Смитом в его Нобелевской лекции 8 декабря 1978 года. Со слов автора доклада в этот период фермент удалось выделить за счет использования вяскозиметров, т. к. ДНК фага Р22 после обработки отдельными фракциями экстракта бактериальных клеток резко теряла вязкость. В дальнейшем Смит с коллегами очистили фермент R.HindII и охарактеризовали структуру участков узнавания и место расщепления участка ДНК [Smith and Wilcox, 1970; Kelly и Smith, 1970].
На сегодняшний день в базе данных REBASE (www. rebase.neb.com/rebase/rebase.html) насчитывается более 9300 потенциальных СРМ типа II. Биохимические свойства этих ферментов могут сильно различаться. К настоящему моменту опубликовано довольно много обзоров. Подробная информация, касающаяся различных сторон исследования этих ферментов представлена в обзорах [Pingoud et al., 2004, 2005, 2014]. Наиболее полные сведения на начало 2000 годов собраны в книге под редакцией Альфреда Пингуда [Pingoud 2004], а также в более ранних замечательных обзорах [Modrich, Roberts 1982; Roberts, Halford 1993].
Конструирование бифункционального гибридного белка, несущего эндонуклеазную и метилтрансферазную активности Eco29kI
Определение места гидролиза фосфодиэфирной связи позволило подтвердить, что ЭР R.Eco29kI, R.Ecl18kI (R.Kpn2kI), R.CfrBI являются “истинными” изошизомерами SacII, SsoII и StyI, соответственно. Гены СРМ eco29kIRM, kpn2kIRM, ecl18kIRM, ecoRVRM и cfrBIRM кодируют белки размерами, характерными для белков СРМ II класса. Наименьший размер имеет белок R.Eco29kI- 216 а.о., наибольший - MEco29kI –382 а.о. Соответствие обнаруженных открытых рамок считывания (ОРС) генам СРМ Eco29kI, Ecl18kI и CfrBI было подтверждено делеционным картированием генов и клонированием ПЦР фрагментов с ОРС потенциальных генов СРМ в экспрессионные плазмидные вектора. Определение места гидролиза фосфодиэфирной связи позволило подтвердить, что ЭР R.Eco29kI, R.Ecl18kI (R.Kpn2kI), R.CfrBI являются “истинными” изошизомерами SacII, SsoII и StyI, соответственно. Гены СРМ eco29kIRM, kpn2kIRM, ecl18kIRM, ecoRVRM и cfrBIRM кодируют белки размерами, характерными для белков СРМ II класса. Наименьший размер имеет белок R.Eco29kI- 214 а.о., наибольший - MEco29kI –382 а.о. В соответствие с принятой классификацией, МТ MEco29kI, MEcl18kI (MKpn2kI) относятся к m5C МТ, MEcoRV к m6A МТ (класс ), а MCfrBI к m4C МТ (класс ). Для всех описанных ДНК метилтрансфераз определено расположение метилированных нуклеотидов.
Исходя из номенклатуры эндонуклеаз рестрикции, ферменты с одинаковой специфичностью, но выделенные из разных микробных источников называются изошизомерами. Различают истинные изошизомеры и ложные. Первые имеют не только одинаковую специфичность, но и гидролизуют фосфорно-диэфирную связь в идентичном месте. В рамках этой работы мы попытались разобраться изошизомеры обнаруженные нами в энтеробактериях это одинаковые белки, которые распространились за счет горизонтального переноса, кодирующих их генов или это все-таки белки различной природы, но выполняющие одинаковые функции. При скрининге сотен клинических штаммов семейства Enterobacteriaceae коллекции Киевского НИИ эпидемиологии и инфекционных болезней им. Л.В.Громашевского на наличие специфической эндонуклеазной активности, в шести штаммах Escherichia coli нами были обнаружены сайт специфические эндонуклеазы - изошизомеры EcoRV (EcoA2I, Eco63cI, Eco19nI, Eco41vI Eco15zI и Eco3122). Гены, кодирующие эндонуклеазы и метилтрансферазы расположены на небольших мультикопийных hsd плазмидах идентичного размера (6,2 т.п.н.). Все плазмиды успешно перенесены в лабораторный штамм Escherichia coli WA802. Для всех этих плазмид построены физические карты, которые совпадают с картой, ранее обнаруженной плазмиды pLB1 [Glatman et al., 1980; Захарова и др., 1991; Кравец и др., 1992], несущей гены системы рестрикции-модификации EcoRV. Сравнение электрофоретических профилей фрагментов ДНК плазмид, полученных при гидролизе различными сайт-специфическими эндонуклеазами показало высокую гомологию как с плазмидой pLB1, так и генов, кодирующих СРМ [Кравец и др., 1998].
В нашей коллекции микроорганизмов были выявлены штаммы содержащие СРМ - изошизомеры SsoII, такие как Ecl1831kI, Ecok1, EcovkI, Kpn2kI [Деньмухаметов и др., 1997], Kpn49kII [Kravetz et al., 1993], Eco13kI, Eco21kI, Eco137kI [Деньмухаметов и др. 1997]. При трансформации лабораторных штаммов E. coli K802 и B834 плазмидами, выделенными из пяти этих природных штаммов были отобраны клоны, которые обеспечивали синтез ЭР и содержали плазмиды размером 4,2 (pECO21, pECO137, pKPN2) и 5.5 (pECO13, pECL18) т.п.н. Перечисленные плазмиды кодируют идентичные СРМ и имеют специфичность фермента- прототипа SsoII [Деньмухаметов и др., 1997]. Гены СРМ были локализованы одинаковых по размеру PvuII фрагментах ДНК этих плазмид между районом cer (район, ответственный за стабильное наследование плазмид и участвующий в разрешении мономерных форм в процессе их репликации) и oriV (район ответственный за репликацию плазмид). Нуклеотидная последовательность района генов СРМ была практически идентична опубликованной ранее последовательности ДНК генов ssoIIRM [Karyagina et al., 1993] и отличалась лишь в восьми положениях. Четыре из них, расположенные в гене МТ, и два в гене ЭР не изменяли предполагаемой аминокислотной последовательности так как затрагивали третью букву в следующих кодонах 142 Сys (кодон TGT ssoIIM заменен на кодон TGC ecl18kI), 149 Gly (GGC на GGG), 187 Gly (GGA на GGG) и 199 Asp (AAC на AAT) – для МТ и 18 Lys (AAA на AAG), 252 Leu (CTT на CTA) – для ЭР. В структурной части гена ecl18kIM обнаружена одна замена 56 Ile ssoIIM на Met (ATA на ATG), а в гене ecl18kIR Ile132Val (ATA на GTA). Аминокислотные замены, скорее всего не являются существенными для функционирования этих ферментов. Последнее заключение следует из сравнительного анализа их оптимумов реакции для всех шести изошизомеров, обнаруженных нами. Сравнение генов ecl18kIRМ с kpn2kIRM продемонстрировало шесть замен, которые были также несущественными. Cреди изошизомеров SsoII, описанных нами, таких как Ecok11, EcovkI [Кравец и др., 1994], Kpn49kII [Kravetz et al., 1993], Eco13kI, Eco137kI [Деньмухаметов и др. 1997], анализ первичной аминокислотной структуры не проводился. Однако, анализ нуклеотидных последовательностей большого количества генов СРМ позволяет заключить, что многие ЭР энтеробактерий, ранее считавшиеся изошизомерами на самом деле практически идентичны по первичной структуре аминокислот и, могут являться продуктом ГПГ. В качестве яркого примера можно привести результат анализа нуклеотидных последовательностей генов СРМ Ecl18kI и СРМ, описанной в Японии Sty4DI [Miyahara et al., 1997]. Они оказались идентичными с двумя заменами в третьем положении кодонов, которые не вызывают изменения аминокислотной последовательности, что указывает на высокую консервативность этих последовательностей независимо от географической локализации. В межгенных областях исследуемых плазмид нуклеотидные замены не обнаружены. Несколько позже выявлена 100% идентичность последовательностей нуклеотидов в районе генов СРМ, изошизомеров эндонуклеазы SacII (Eco29kI и Eco30kI).