Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы
Синтез и метаболизм NO
NO-синтазы
Диффузия NO
Окисленные производные NO
Концентрационные эффекты NO
Рецепторы NO
Белки, содержащие гем
Гуанилатциклаза и система cGMP Цитохромоксидаза
Белки, содержащие негемовое железо Аконитаза
Пролилгидроксилазы PHD и FIH и транскрипционный фактор HIF-1
Белки, содержащие активные SH-группы
G-белки семейства Ras
Тиоредоксин
Зависимые от NO сигнальные системы
Протеинкиназы MAP и транскрипционный фактор AP-1 19 19
3.1.1. Структура AP-1 и его участков связывания с ДНК 43
3.1.1.1. Субъединичный состав 45
3.1.1.2. Участки связывания с ДНК 47
3.1.2. Регуляция AP-1 48
3.1.2.1. Протеинкиназные системы 48
3.1.2.2. Регуляция факторов семейств Jun и Fos 50
3.1.2.3. Регуляция факторов семейства ATF/CREB 51
3.1. 3. AP-1 и рецепторы межклеточных сигнальных молекул 52
3.1.3.1. Рецепторы ростовых факторов 52
3.1.3.2. Семейство рецепторов TNF 57
3.1.3.3. Рецепторы IL-1 и TLR 59
3.1.4. Кооперация AP-1 с другими транскрипционными факторами 61
3.1.4.1. Взаимодействия, опосредованные CBP/p300 61
3.1.4.2. Непосредственные контакты AP-1 с другими транскрипционными факторами
3.2. Сигнальная система Keap1/Nrf2 66
3.2.1. Зависимые от Nrf2 защитные системы клеток 66
3.2.2. Регуляция экспрессии защитных генов, фактор Nrf2 68
3.2.3. Регуляция функциональной активности Nrf2 70
3.2.4. Сенсорная функция тиольных групп Keap1 77
3.2.5. Алкилирование тиольных групп Keap1 в условиях in vivo 80
3.2.6. Эффекты электрофильных соединений, несвязанные с индукцией зависимых от Nrf2 генов
3.2.7. Природные соединения активирующие сигнальную систему Keap1/Nrf2
3.2.8. Фармакологическое применение активаторов системы Keap1/Nrf2
Материалы и методы
1. Культура хондроцитов и выделение РНК 94
2. Культуры моноцитарных клеток 95
3. Другие клеточные линии 95
4. Получение ядерной фракции клеток 96
5. Использованные реагенты 96
6. Плазмиды, получение меченых зондов и блот-гибридизация РНК
7. Выделение и электорофорез ДНК 98
8. Вычитающая гибридизация 99
9. Определение N2O3 по флуоресценции DAF 99
10. Определение экспрессии генов с использованием олигонуклотидных микроматриц
11. Количественная ПЦР 101
12. Блот-гибридизация белков 105
13. Трансфекция клеток и экспрессия репортерного гена 105
14. Определение апоптоза в моноцитах методом проточной 106 цитометрии
15. Колориметрическое определение токсичности 107
16. Определение токсичности в бета-клетках 107
17 Определение генерации АФК клетками 107
18. Синтез соединений АМН 108
19. Измерение спектра поглощения конъюгатов АМН и GSH 108
20. Анализ конъюгатов АМН и GSH с использованием хромато- 109 масс-спектроскопии
21. Определение нитрита
22 Определение связанной с белком радиоактивной метки 109
23 Определение секреции инсулина 110
24. Статистический анализ 111
Результаты и обсуждение 112
1. Транскрипционный ответ клеток на действие NO 112
1.1. Экспрессия зависимых от NO генов в первичных хондроцитах
1.2. Экспрессия зависимых от NO генов в моноцитарных клетках
Анализ зависимых от NO сигнальных систем
2.1. Исследование фосфобелков 136
2.2. Ингибиторный анализ сигнальных путей 146
2.3. Особенности индукции гена KLF2 153
3. Модуляция экспрессии генов в присутствии фармакологических соединений, влияющих на метаболизм NO 156
3.1. Применение антиоксидантов для подавления АФА 156
3.2. Фармакологическая стимуляция окисления NO 158
3.3. Умеренная гипоксия и индукция NO-зависимых генов 161
3.4. Внеклеточная каталаза активирует экспрессию генов в культуре хондроцитов
4. Активация экспрессии NO-зависимых и защитных генов при фармакологическом воздействии на регуляторную систему Keap1/Nrf2 170
4.1. Влияние БМН тирфостинов на экспрессию NO-зависимых 170 генов
4.2. Структурно-функциональный анализ соединений АМН 175
4.3. Образование аддуктов в реакции соединений БМН с тиолами 181
4.4. Защитное действие соединений АМН на клетки U937 185
4.5. Защитное действие соединений АМН на бета-клетки
4.5.1. Индукция защитных геновHO-1 и NQO1, активация Nrf2, 197 подавление окислительного стресса
4.5.2. Подавление индукции iNOS и токсического действия про- 209 воспалительных цитокинов
4.6. Подавление ответа бета-клеток на про-воспалительные 217 цитокины в присутствии брусатола
4.7. Симуляция продукции NO в клетках TC6 при их совместном культивировании со стволовыми клетками нервной системы 235
Заключение 238
Краткое изложение результатов исследования 238
1. Спектр зависимых от NO генов 238
2. Зависимые от NO сигнальные пути 239
3. Фармакологическая модуляция ответа клеток на действие NO 239
4. Фармакологическое воздействие на систему Keap1/Nrf2 239
5. Подавление токсического действия про-воспалительных 239 цитокинов на бета-клетки 6. Другие эффекты
Выводы 243
Список сокращений 245
Список публикаций по теме диссертации 249
Список литературы
- Концентрационные эффекты
- Кооперация AP-1 с другими транскрипционными факторами
- Плазмиды, получение меченых зондов и блот-гибридизация РНК
- Модуляция экспрессии генов в присутствии фармакологических соединений, влияющих на метаболизм NO
Введение к работе
Актуальность проблемы
Окись азота – подвижная сигнальная молекула, которая вызывает в эффекторных клетках множественные ответные реакции. В продуцирующих клетках NO производят специфические NO-синтазы активность которых зависит от цитокинов и ряда других факторов межклеточной сигнализации. В клетках-мишенях функцию рецепторов NO выполняют белки, которые содержат гем, железо-серные центры и SH-группы. За исключением гуанилатциклазы, эти рецепторы выполняют сенсорную функцию в дополнение к другим задачам и значительно различаются между собой по чувствительности к NO и ее производным. Долговременный ответ на действие NO обусловлен изменением экспрессии специфических генов.
Непосредственную активацию целого ряда рецепторов осуществляют окисленные производные NO, обозначаемые также как активные формы азота (АФА). Реактивные SH-группы таких клеточных рецепторов NO в реакции с короткоживущими АФА образуют нитрозотиолы (Рис. 1). Наличие дополнительных условий создает возможность для внешнего воздействия на чувствительные к NO сигнальные системы клеток. Представляет интерес выявление фармакологических соединений способных избирательно модифицировать SH-группы соответствующих рецепторов, активировать эти рецепторы и действовать как агонисты NO.
В группу чувствительных к NO сигнальных систем входит система
Keap1/Nrf2. Транскрипционный фактор Nrf2 контролирует экспрессию
большой группы генов, повышающих устойчивость клеток к АФК,
эндогенным электрофильным соединениям и ксенобиотикам. Активность
Nrf2 контролирует репрессорный белок Keap1. Модификация реактивных
SH-групп Keap1 вызывает активацию Nrf2. Параллельно с индукцией защитных генов система Keap1/Nrf2 участвует в негативной регуляции транскрипционного фактора NF-B.
Представляет интерес выявление соединений способных воздействовать на сигнальную систему Keap1/Nrf2. Хроническая активация Nrf2 и повышенная экспрессия защитных генов сопровождают и затрудняют лечение ряда заболеваний. Немногие известные в настоящее время ингибиторы Keap1/Nrf2, это брусатол и родственные по структуре природные терпеноиды. Определение молекулярного механизма действия брусатола может способствовать выявлению новых подходов для фармакологического воздействия на внутриклеточные сигнальные процессы.
Рисунок 1. Схема классического (cGMP-зависимого) и альтернативных путей сигнального действия NO.
Образование NO в клетках происходит при окислении аргинина кислородом в реакции, катализируемой изоферментами NO-синтаз. Классический сигнальный путь обусловлен активацией растворимой гуанилатциклазы (sGC). Основные альтернативные пути обусловлены (1) подавлением цитохромоксидазы (CcO), что воспроизводит состояние гипоксии и (2) нитрозилированием SH-групп белков (Pr-SH) в присутствии ионов металлов (Me+n) и окисленными производными NO.
Цель и задачи исследования
Определение спектра и поиск новых зависимых от NO генов в хондроцитах и клетках моноцитарного происхождения.
Классификация этих генов по чувствительности их экспрессии к разным пороговым концентрациям NO.
Изучение влияния антиоксидантов и других соединений, влияющих на образование АФК и АФА, на индукцию зависимых от NO генов.
Выявление сигнальных систем, участвующих в транскрипционной активации зависимых от NO генов.
Использование соединений, способных избирательно модифицировать тиольные группы рецепторных белков, для стимуляции регуляторной системы Keapl/Nrf2, подавления экспрессии про-воспалительных генов и повышения устойчивости клеток к цитотоксическим воздействиям.
Определение клеточных эффектов и механизма действия брусатола, ингибитора системы Keapl/Nrf2.
Общий план исследования можно представить в виде схемы (Рис. 2).
Работа была проведена в Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН и Центре теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН.
Научная новизна и теоретическая значимость работы
В проведенной работе было исследовано влияние NO на экспрессию широкого спектра генов в клетках разных типов. Источником NO были генерирующие соединения, примененные в относительно высокой концентрации. При таких экспериментальных условиях рецепторами NO служат белки, содержащие реактивные SH-группы модификация которых
вызывает параллельную активацию нескольких сигнальных путей. Мы
показали, что под действием доноров NO в клетках разных типов происходит изменение экспрессии характерной группы генов. Чувствительность ряда этих генов к NO ранее не была известна. Многие зависимые от NO гены участвуют в воспалительных процессах, регуляции клеточного роста, апоптоза и синтеза белка. При исследовании чувствительных к NO сигнальных путей мы показали, что для индукции зависимых от NO генов критически необходима параллельная активация MAP киназ и тирозиновых протеинкиназ. Далее мы показали, что внешняя стимуляция окисления NO до АФА усиливает индукцию ряда зависимых от NO генов. Напротив, антиоксиданты подавляют экспрессию многих зависимых от NO генов. При этом антиоксиданты разных типов избирательно подавляют зависимую от NO активацию разных генов.
Нами было показано, что индукцию многих NO-зависимых генов вызывают ароматические метиленмалононитрилы (АМН). Эти соединения имеют свойства сильных активаторов чувствительных к NO сигнальных систем Keap1/Nrf2 и MAPK/AP-1. При действии на клетки разных типов, соединения АМН вызывают значительную индукцию гемоксигеназы 1 (HO-1) и ряда других защитных генов. Индукция HO-1 соединениями АМН опосредована параллельной активацией факторов Nrf2 и c-Jun. Известно, что система Keap1/Nrf2 контролирует два отдельных регуляторных каскада, что проявляется в индукции зависимых от Nrf2 и подавлении зависимых от NF-B генов. Соединения АМН высокоэффективны в подавлении активации экспрессии iNOS и окислительного стресса в бета-клетках, вызванных действием про-воспалительных цитокинов. Также мы обнаружили, что в бета-клетках брусатол, известный ранее как ингибитор системы Keap1/Nrf2, не только подавлял активацию зависимых от Nrf2 генов, но и полностью предотвращал цитотоксические эффекты про-воспалительных цитокинов. В частности, брусатол подавлял зависимую от цитокинов активацию экспрессии iNOS. В отличие от соединений АМН, брусатол ингибировал экспрессию iNOS на уровне трансляции мРНК.
Рисунок 2. Задачи проведенного исследования. Обобщенная схема.
Вопросы, которые были
затронуты в нашей работе,
пронумерованы. Участие
АФА в индукции
зависимых от NO генов
[1]. Внешнее воздействие
на экспрессию этих генов
через изменение
клеточных уровней АФК
[2] и NO [3]. Выявление
рецепторов АФА [4] и поиск агонистов этих рецепторов [5]. Определение
сигнальных систем, которые контролируют экспрессию зависимых от NO
генов [6]. Поиск ингибиторов этих сигнальных систем [7]. Выявление общего
спектра зависимых от NO генов и генов, зависимость которых от NO ранее
не была известна [8].
Практическая значимость работы
Характерная особенность NO как сигнальной молекулы, это способность активировать несколько разнородных рецепторов и вызывать множественные ответные реакции в клетках-мишенях. Полученные результаты указывают на возможность избирательно подавлять или, напротив, усиливать экспрессию NO-зависимых генов и модифицировать тем самым те или иные эффекты NO.
Избыточная генерация NO служит одним из факторов развития
аутоиммунных и ряда других заболевания. Так, например, одна из основных
причин гибели производящих инсулин бета-клеток при диабете 1-го и,
отчасти, 2-го типа, это поражающее действие клеток иммунной системы, опосредованное вырабатываемыми ими про-воспалительными цитокинами. Исследованные нами соединения АМН, способны подавлять индукцию генов под действием цитокинов IL-1 и IFN. Также мы обнаружили, что брусатол полностью блокирует ответ бета-клеток на IL-1 и IFN, что проявляется в предотвращении гибели бета-клеток, подавлении индукции iNOS, окислительного стресса нарушений секреции инсулина. Фармакологическое воздействие на регуляторную систему Keap1/Nrf2 и сигнальные пути, зависимые от цитокинов, может быть использовано для противодействия многим патологическим процессам.
Основные положения, выносимые на защиту
В клетках-мишенях NO вызывает параллельное изменение активности нескольких сигнальных систем и влияет на экспрессию характерной группы генов.
Транскрипционный ответ на NO зависит от клеточных уровней АФК и АФА.
Активацию ряда зависимых от NO генов можно воспроизвести соединениями АМН, которые алкилируют сульфгидрильные группы рецепторных белков и активируют сигнальные системы Keapl/Nrf2 и МАРК/АР-1.
Соединения АМН подавляют ответ инсулин-производящих бета-клеток на ряд цитотоксических воздействий.
Брусатол подавляет токсическое действие про-воспалительных цитокинов IL-1 и IFN на бета-клетки.
Апробация результатов работы
Материалы диссертации были представлены и обсуждены на российских и международных конгрессах и конференциях: Конференция по программе «Геном человека», Черноголовка, 1999. Annual meeting of European macrophage and dendritic cell society, Базель, октябрь 2002. Second joint French-German meeting on NO research, Гамбург, октябрь 2006. 9-th FENS Forum (Federation of European neuroscience societies), Милан, июнь 2014.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 26 статей в рецензируемых научных журналах.
Структура и объем работы
Концентрационные эффекты
В значительной степени действие NO на клетки опосредовано высокореактивными окисленными производными, известными как активные формы азота (АФА). Образование окисленных производных NO происходит в реакциях с АФК, металлами с переменной валентностью и кислородом. В более широком смысле к АФА можно отнести не только соединения типа NOx, но также нитрозотиолы R-SNO и нитрозильные комплексы металлов (RS")2Fe+ (NO+)2 в которых N0 находится в виде иона нитрозония (N0+) (Рис. 4). Динитрозильные комплексы с участием железа и глутатиона стабильны и могут быть использованы как фармакологические доноры N0. Такие комплексы нетоксичны и могут быть использованы как гипотензивное средство, а также для предотвращения гибели клеток под действием про-воспалительных цитокинов и в условиях ишемии и реперфузии (Конcтантинова Т.C. и др., 2012; Шупик М.А. и др., 2011). В физиологических условиях динитрозильные комплексы легко образуются в реакции Fe(II), эндогенной N0 и тиолов и могут играть роль буфера хранения N0 в производящих клетках и как переносчик N0 по тканям организма (Власова М.А. и др., 2006; Vanin A.F., 2009). Образование динитрозильных комплексов железа в организме происходит в реакциях между эндогенным NO, GSH и Fe2+ или с участием других тиолов и белков, содержащих негемовое железо (II) и выявляется по характерному сигналу ЭПР (g = 2,03) (Ванин А.Ф., 2001).
При окислении N0 кислородом происходит образование азотистого ангидрида N2O3 и двуокиси азота NO2. В реакции N0 с супероксидом образуется пероксинитрит ONOO", который вступает в реакцию с С02 с образованием интермедиата ONOOC02". Все эти соединения имеют исключительно высокую реактивность с клеточными компонентами (Thomas D.D. et al., 2008).
В водной среде окисление N0 кислородом и пероксинитритом и дальнейший метаболизм продуктов протекают согласно следующим реакциям (Raines K.W. et al., 2007): 2NO + 02 2N02 (2) =3,5- lOМ с1 N02 + NO N2O3 (3) Л=1,1109 М-1 с"1 NO + O2- ONOO" (4) =6,7 109 М-1 с"1 ONOO" + NO NO2 + N02" (5) ONOO" + H2O [HO] + NO2 NO3" + H+ (6) Кинетически реакция между NO и O2 второго порядка относительно NO и скорость окисления NO значительно зависит от концентрации вступающих в реакцию соединений. В гидрофобной среде растворимость NO и O2 примерно в 10 раз выше, чем в воде и там реакция окисления NO протекает там значительно (возможно, до 103 раз) быстрее. Метаболизм NO и образование АФА зависят от содержания в клетках кислорода, АФК и металлов с переменной валентностью. В приведенных реакциях при окислении NO происходит образование АФА, которые вступают в реакцию с разными компонентами клеток. По-видимому, образование N2O3 при окислении NO кислородом преимущественно происходит в липидной фазе мембран, синтез ONOO- в реакции между NO и супероксидом - в зонах примыкающих к митохондриям, где локализованы производящие супероксид системы переноса электронов и вблизи содержащих NAD(P)H оксидазы эндоплазматического ретикулума и плазматических мембран (Mller M.N. et al., 2009; Thomas D.D. et al., 2008).
Наряду с низкомолекулярными АФК, NO легко вступает в реакции с продуктами перекисного окисления липидов – алкильными (L), алькоксильными (LO) и гидропероксильными (LOO) радикалами. Образование подобных соединений происходит при одноэлектронном окислении ненасыщенных жирных кислот. Эти радикальные соединения имеют высокую реакционную способность, сопоставимую с гидроксильным (HO) радикалам. В реакции NO с LO и LOO происходит образование LONO и LOONO, соответственно. Тем самым NO проявляет себя как эффективный антиоксидант, который обрывает цепную реакцию перекисного окисления жирных кислот и липидов. Взаимодействие NO с метаболитами арахидоновой кислоты препятствует их участию во внутриклеточной сигнализации (Шупик М.А. и др., 2011; Rudolph and Freeman, 2009). Hитрозация SH-групп может происходить в реакции тиильного радикала непосредственно с NO (Raines K.W. et al., 2007): NO + R-S R-SNO (7) k=1109 М-1 с-1 (для GSH) в реакции с участием металлов: NO + R-SH + Me+x R-SNO + Me+x-1 + H+ (8) или в реакции тиолов с короткоживущим азотистым ангидридом: N2O3 + R-SH R-SNO + NO2- + H+ (9) k=1,6103 М-1 с-1 (для GSH) Образование азотистого ангидрида (3) и тиильного радикала: NO2 + R-SH R-S + NO2- + H+ (10) k=2107 М-1 с-1 (для GSH) происходит в реакциях с участием двуокиси азота.
Ход реакции (8), по-видимому, ограничен тем, что железо и другие металлы с переменной валентностью прочно связаны с клеточными белками. Вместе с тем, показано, что динитрозильные комплексы железа участвуют в нитрозилировании тиолов. Другие реакции, приводящие к нитрозации SH-групп (6 и 9) требуют предварительного окисления NO до NO2. В физиологических условиях известны два основных пути образования NO2. Первый из них – реакция NO с молекулярным кислородом, которая протекает медленно и, по-видимому, в липидной фазе мембран. По-видимому, большее значение для образования NO2 имеют реакции с участием супероксида и пероксинитрита (4 и 5). Еще один путь образования нитрозотиолов: энзиматическое нитрозилирование GSH при окислении NO цитохромом c (Broniowska K.A. et al., 2012). Образование нитрозотиолов также происходит в реакции с участием динитрозильных комплексов железа, в которых NO находится в окисленной форме иона нитрозония NO+ (Vanin A.F., 2009).
Клеточные компоненты имеют разную чувствительность к NO и ее производным. В низкой ( 1 нМ) концентрации действие NO опосредовано связыванием с гем-содержащими белками. В более высокой концентрации ( 100 нМ), при значительном увеличении синтеза АФА, NO вызывает нитрозилирование глутатиона (GSH) с образованием нитрозлглутатиона (GSNO), белков по остаткам цистеина и нитрование белков по остаткам тирозина. Нитрозилирование белков преимущественно происходит по остаткам цистеина, расположенным между полярными аминокислотами (Broniowska and Hogg, 2012; Thomas D.D. et al., 2008). 1.4. Концентрационные эффекты NO
В отличие от других известных факторов межклеточной сигнализации, NO при достижении тех или иных пороговых концентрациях приводит в действие разные внутриклеточные сигнальные пути (Рис. 5). В клетках MCF-7 (аденокарцинома) при концентрации NO 10-30 нМ происходит активация протеинкиназы MAP ERK, обусловленная активацией гуанилатциклазы и PKG. При 30-60 нМ NO происходит рост фосфорилирования протеинкиназы AKT (Ser472), что указывает на активацию системы PIP3K. Далее, с возрастанием концентрации NO до 100 нМ происходит стабилизация фактора транскрипции HIF-1, до 300 нМ – рецептора эпидермального фактора роста EGFR, до 500 нМ – фактора p53. При повышении уровня NO до 1 мкМ происходит множественная нитрозация клеточных белков и подавление митохондриального дыхания (Рис. 6). Тем самым, в зависимости от концентрации, в широком диапазоне от 1 до 1000 нМ, NO может вызывать разные и даже противоположные друг другу клеточные ответы. В концентрации около 1 нМ NO действие проявляется в стимуляции клеточного роста, при 50 нМ в результате активации протеинкиназы AKT – подавление апоптоза, что связано с фосфорилированием фактора Bad и каспазы 6. Напротив, активация фактора p53 при действии высоких доз NO вызывает подавление циклин-зависимых протеинкиназ, снижение фосфорилирования фактора Rb, томожение репликации ДНК и клеточного роста и включение программы апоптоза. Активация фактора p53 обусловлена алкилированием и повреждением ДНК (Lu Q. et al., 2007; Villalobo A., 2006). В высокой концентрации NO также подавляет синтез белка (Switzer C.H. et al., 2011; Thomas D.D. et al., 2008).
Кооперация AP-1 с другими транскрипционными факторами
К семейству G-белков Ras относятся пять белков (H, K, M, N и R). По структуре к ним близки G-белки Rap (1,2) и Ral. Эти регуляторные белки представляют собой ферменты с низкой GTPазной активностью. Они расположены на внутренней стороне клеточной мембраны к которой прикреплены после посттрансляционного ковалентного присоединения остатков ненасыщенных жирных килот. В связанной с GDP форме белки Ras лишены функциональной активности, которую они приобретают после замены GDP на GTP. Этот процесс контролируют специфические факторы GEF (GDP/GTP exchange factors). Напротив, гидролиз GTP после которого образовавшийся GDP остается связанной с G-белком состоянии, стимулируют факторы, входящие в функциональную группу GAP (GTPase activation proteins). Для Ras в качестве фактора GEF наиболее известен адаптерный белок SOS, который участвует в передаче сигналов, исходящих от рецепторных тирозиновых киназ. В связанной с GTP форме Ras активирует серин-треониновую протеинкиназу Raf, которая контролирует каскад MAP киназ ERK, G-белки Rac и CDC42, тирозиновую киназу Src и другие сигнальные системы (Kolch W., 2005; Raines K.W. et al., 2007). Рисунок 9. Механизм зависимой от NO активации G-белка Ras.
В связанной с GTP форме G-белок Ras активирует зависимые сигнальные системы, в том числе, протеинкиназы MAP (см. также ниже Рис. 14). При расщеплении GTP до GDP, которое стимулируют факторы GAP (GTPase activating proteins), Ras утрачивает свою функциональную активность. Для ее восстановления необходима конформационная перестройка, приводящая к диссоциации GDP и присоединение новой молекулы GTP. Этот процесс стимулируют факторы GEF (guanine nucleotide exchange factors). Окисленные производные NO (например, NO2) или АФА через промежуточное образование тиильного радикала по Cys118 ковалентно модифицируют связанный с Ras GDP, что способствует его диссоциации и замену на GTP.Тем самыым, действие NO на G-белки семейства Ras функционально соответствкет действию факторов GEF.
Известно, что NO стимулирует переход белков Ras в активную, связанную с GTP форму, то есть стимулирует диссоциацию GDP и в функциональном отношении действует аналогично факторам GEP. Первоначальное предположение, что активирующий эффект NO обусловлен нитрозацией остатка Cys118 (для H-Ras) было впоследствии уточнено. Диссоциацию GDP вызывает образование тиильного радикала (R-S) по остатку Cys118 в реакции с NO2 с последующим образованием 5-нитро-GDP (Рис. 9). Аналогичный механизм обуславливает активацию Ras под действием супероксида. Нитрозация остатка Cys118 не влияет на активность Ras но подавляет его способность к редокс-чувствительной регуляции. Антиоксиданты (аскорбат и токоферол) предотвращают окисление Cys118 и частичную инактивацию Ras. Под действием NO (после окисления до АФА) также происходит активация структурно близких с Ras G-белков семейства Rho (Rac1 и CDC42). В отличие от них, производные NO ингибируют RhoA. Эффект основан на том, что образование тиильного радикала по расположенному в активном центре RhoA остатку Cys18 приводит к ковалентной модификации через внутримолекулярную дисульфидную связь (Raines K.W. et al., 2007; Sha and Marshall, 2012).
В условиях высокой выработки АФА в клетках происходит нитрозилирование GSH, самого распространенного тиольного соединения и накопление GSNO. Возможно, нитрозилирование GSH митохондриями с участием цитохрома c вносит не меньший вклад в синтез GSNO, чем прямая реакция АФА и NO (Li and Lancaster, 2012). Перенос нитрозильных групп с GSNO на белки может происходить в ходе реакции транснитрозилирования. Реакция, хотя и с низкой эффективностью (константы скорости для разных субстратов составляют от 0,1 до 500 М-1с-1) может проходить без участия ферментов (Broniowska and Hogg, 2012): RS-H + R -SNO R-SNO + R -SH (11) Рисунок 10. Реакции окисления и нитрозилирования тиоредоксина.
При высоком уровне АФК в клетках происходит накопление тиоредоксина (Trx) в окисленной форме (Trx-S2). Восстановление Trx-S2 катализирует тиоредоксинредуктаза (TrxR1). При накоплении Trx-S2 становится возможным нитрозилирование Trx по SH-группе остатка Cys73. Образование SNOrx-S2 может проходить в неэнзиматических реакциях, прямой - с АФА или при транснитрозилировании с участием GSNO. Далее SNOrx-S2 может нитрозилировать другие клеточные белки (Pr-NO) по остаткам цистеина, а также высвобождать NO в реакции денитрозилирования с участием с Trx-(SH)2. Денитрозилирование белков происходит также в ходе реакции с Trx-(SH)2.
Также транснитрозилирование может проходить в ходе последовательных реакций с участием тиоредоксина 1 (Trx1). На первом этапе нитрозильная группа переносится с GSNO на Cys73 окисленного Trx1 (с внутримолекулярной дисульфидной связью между Cys32 и Cys35). Далее Trx1 вступает в реакцию транснитрозилирования с белковыми субстратами (Рис. 10) (Sengupta and Holmgren, 2012). В настоящее время подтверждено опосредованное SNOrx1 нитрозилирование каспазы 3 и пероксиредоксина 1. Восстановленный Trx1 выполняет противоположную функцию – осуществляет денитрозилирование белков (Рис. 11). Тем самым, образование SNOrx1 и последующее нитрозилирование белков происходят при сочетании двух условий: высокой генерации NO и АФК. При этом нитрозилирование может блокировать окисление реактивных SH-групп белков и модулировать сигнальные системы (например, через ингибирование каспазы 3) (Benhar M. et al., 2009; Wu C. et al., 2011).
Плазмиды, получение меченых зондов и блот-гибридизация РНК
В эту группу входит около 30 рецепторов чувствительных к цитокинам и поверхностным антигенам. Эти рецепторы при связывании со своими лигандами соединяются в 3-компонентные комплексы и приобретают способность присоединять цитоплазматические адаптерные белки. Активация МАР киназ опосредована присоединением к рецепторам белков TRAF (TNF receptor associated factors, TRAF1 RAF7), которые при этом также образуют тримеры. Рецептор фактора некроза опухолей 1-го типа и родственные рецепторы, содержащие характерный домен DD (death domen), присоединяют к себе адаптерные белки TRAF1 и 2 через промежуточный фактор TRADD. Рецептор TNF 2-го типа и родственные рецепторы CD30, CD40 и RANK не содержат домен DD и связывают TRAF1 и 2 непосредственно (Белецкий И.П. и др., 2002; Chung J.Y. et аі., 2002; Dempsey P.W. et al., 2003). TRAF2 активирует протеинкиназы MEKK-1,3 и ASK1 и подчиненный им MAP киназный каскад JNK (Рис. 15). Следует отметить, что тиоредоксин в восстановленной форме связывается с ASK1 и подавляет эту протеинкиназу. Поэтому для активации ASK1 необходимо дополнительное условие: высокий уровень образования в клетках активных форм кислорода (АФК), которые окисляют тиоредоксин. Помимо тиоредоксина, в редокс-зависимой регуляции АР-1 также участвуют белки Ref-1 и GST (Brigelius-Flohe and Flohe , 2011; Liu H. et al., 2005). В многокомпонентные комплексы образуемые рецепторами TNF и TRAF2 также входит серин-треониновая протеинкиназы семейства RIP. Участие RIP1 необходимо для активации протеинкиназу ГКК и подчиненного ей транскрипционного фактора NF-B (Meylan Е. et al., 2005; Windheim M. et al., 2007). Наряду с TRAF1 и 2, рецепторы, родственные рецептору TNF 2-го типа - CD40 и RANK - также связывают адаптерный белок TRAF6 и через него контролируют системы MAP киназ JNK и р38 (Chung J.Y. et al., 2002; Dempsey P.W. et al., 2003). Помимо адаптерных белков семейства TRAF, рецептор TNF 1-го типа через белок TRADD может присоединять фактор FADD и через него -прокаспазу 8 и инициировать ее активацию, происходящую после перемещения в цитоплазму комплекса многокомпонентного комплекса, состоящего из этой прокаспазы с FADD и RIP1 (Meylan Е. et al., 2005). Вместе с тем, рецепторы Fas и TRAIL-R1,2, основное действие которых направлено на стимуляцию апоптоза, связывают адаптерный белок FADD напрямую и активируют каспазу 8 намного более эффективно, чем рецепторы TNF. Вместе с тем, рецептор Fas через адаптерный белок Daxx контролирует активность MAP киназы ASK1 (Shakibaei М., et al., 2005).
После связывания с лигандами мембранные рецепторы образуют 3-компонентные комплексы и присоединяют адаптерные белки (в овальных рамках) и протеинкиназы (в прямоугольных рамках). Ключевые элементы регуляторных систем, зависимых от рецептора TNF и родственных рецепторов, приведены в затененных рамках. Многокомпонентные внутриклеточные сигнальные пути приведены с упрощениями и обозначены пунктирными стрелками
Структура цитоплазматических доменов рецепторов родственных цитокинов IL-1 и IL-18 имеет сходство с аналогичными участками рецепторов семейства TLR (Toll-like receptors, т. е. гомологичные рецепторам Toll дрозофилы, которые отвечают за дифференцировку и, одновременно, за врожденный иммунитет). Известно 10 типов рецепторов TLR, их лиганды – различные продукты бактериального и вирусного происхождения. Лигандами для рецепторов TLR1, TLR2 и TLR6 служат разные липопротеины, для TLR3 – двуспиральная РНК, для TLR4 –липополисахариды, для TLR5 – флагеллин, для TLR9 – неметилированная ДНК (Martin and Wesche, 2002; . Takeda and Akira, 2002) При связывании со своими лигандами рецепторы IL-1 и IL-18 образуют парные комплексы с трансмембранным белком ACP. TLR образуют как однородные димеры (TLR4) так и гетеродимеры - либо между TLR разных типов либо с дополнительным белком CD14. Дальнейшее действие рецептора IL-1 и большинства TLR на подчиненные сигнальные системы опосредовано адаптерным белком MyD88 (Рис. 16) (Martin and Wesche, 2002). После присоединения к рецептору MyD88 образует активный комплекс с серин-треониновыми киназами IRAK (interleukin receptor activated kinase). Сначала с рецептором связывается IRAK4 и фосфорилирует и активирует протеинкиназу IRAK1, которая далее дополнительно фосфорилирует саму себя. В дальнейшем IRAK1 перемещается в цитоплазму в составе многокомпонентного комплекса с адаптерным белком TRAF6, протеинкиназой TAK1 (TGF activated protein kinase) и факторами TAB1 и TAB2 (TAK1 binding protein) (Takeda and Akira, 2002; Suzuki N., et al., 2002). Как уже было отмечено, TAK1 фосфорилирует и активирует MKK3, MKK6 и MKK4, а через них – MAP киназы JNK, и p38 (Рис. 13 и 16). Кроме того, TAK1 фосфорилирует протеинкиназу IKK, которая контролирует транскрипционный фактор NF-B (Verstrepen L. et al., 2008). Фактор TAB1 может напрямую связывать протеинкиназу p38 и стимулировать ее аутофосфорилирование и активацию в обход обычных регуляторных путей (Tanno M. et al., 2003). Наконец, TRAF6 способствует активации тирозиновых киназ Src и Syk, которым подчинены многочисленные регуляторные системы, в частности, PI3K и протеинкиназа PKB/Akt, а также сфингомиелиназа и зависимая от церамида протеинкиназы PKC (Martin and Wesche, 2002). Рисунок 16. Сигнальные системы, контролируемые рецепторами цитокинов IL-1 и TLR.
После связывания с лигандами (L)происходит димеризация рецепторов (или образование парных комплексов с трансмембранными белками ACP или CD14). Далее рецепторы связывают адаптерный белок MyD88 и протеинкиназу IRAK-4, которая фосфорилирует протеинкиназу IRAK-1. Активация подчиненных сигнальных систем (в затененных рамках) происходит после перемещения IRAK-1 в цитоплазму в составе многокомпонентного белкового комплекса. В цитоплазме происходит протеолитическая деградация IRAK-1.
Клеточное действие некоторых TLR опосредовано адаптерными белками TIRAP/MAL и TRIF. Первый из них связывается с TLR2 и TLR4 и действует на регуляторные системы совместно с MyD88. Адаптерный белок TRIF вступает в контакт с рецепторами TLR3 и TLR4 независимо от MyD88 (Martin and Wesche, 2002; Takeda and Akira, 2002). TRIF стимулирует активность протеинкиназ IKK и TBK1, которые через подчиненные им транскрипционные факторы NF-B, IRF3 и IRF7 контролируют экспрессию гена интерферона (Verstrepen L. et al., 2008). В отличие от рецептора IL-1, рецепторы остальных интерлейкинов (IL-2 – IL-15), интерферонов и GM-CSF контролируют экспрессию зависимых генов через ассоциированные с ними тирозиновые киназы JAK и транскрипционные факторы семейства STAT (Paukku and Silvennoinen, 2004).
Модуляция экспрессии генов в присутствии фармакологических соединений, влияющих на метаболизм NO
Уровень транскриптов генов СОХ, VEGF, IL-8, ММР-3 и НОХ-1 используя метод блот-гибридизации РНК. Для этого 10 мкг суммарной РНК из клеток первичных хондроцитов человека разделяли электрофоретически в денатурирующем 1,2% агарозном геле, содержащим формальдегид и переносили на нейлоновую мембрану Hybond N (Amersham Biosciences). Нанесение и перенос контролировали по уровню мРНК гена GAPDH. Гибридизацию с 32Р-мечеными ДНК-зондами проводили в стандартных условиях с 50% формамидом при 42С в течении 16 час. После гибридизации мембраны последовательно отмывали в растворах 2х SSC, 0,1% SDS, затем 0,5х SSC, 0,1% SDS при комнатной температуре, а затем в 0,1х SSC, 0,1% SDS при 42С. Радиоактивный сигнал на мембране считывали с помощью Phosphorimager Cyclone (Packard) или Phosphorimager (Molecular Dynamics). Для определения сравнительной интенсивности радиоактивных сигналов использовали программу OptiQuant 3.00.
После обработки донорами NO хондроциты лизировли в буферном растворе, содержавшем 40 мМ Трис-HCL pH 8,0; 20 мМ ЭДТА и 0,5% лаурилсаркозина. Образцы обрабатывали 1 ч свободной от ДНКаз РНКазой (Promega) и инкубировали с протеиназой К (100 мкг/мл, 6 ч, 50С). Потом проводили очистку ДНК смесью фенол/хлороформ и хлороформом и осаждение этанолом. Электорофорез проводили в 1,8% агарозном геле (80 В, 2 ч). Для окраски ДНК использовали бромистый этидий. 8. Вычитающая гибридизация
Для получения вычтенной клонотеки кДНК источником мРНК были первичные хондроциты кролика, контрольные или обработанные 0,5 мМ GSNO в течение 2 ч. В качестве вычитаемой пробы (трейсер) использовали мРНК, выделенную из обработанных GSNO клеток, а для синтеза кДНК - праймер T1: 5 -CGCAGTCGACCG(T)13-3 . Для вычитающей пробы (драйвер) использовали мРНК контрольных клеток и праймер T2: 5 -GAGCCACGACCG (T)13-3 . Вычитаемую пробу модифицировали в ходе 1 цикла ПЦР с праймером L1: 5 -AGCACTCTCCAGCCTCTCACCGCAGTCGACCG(T)13-3 в присутствии [33P]dCTP (0,3 Ки/ммоль). После электрофоретической очистки 200 нг 33P-меченой кДНК использовали для вычитающей гибридизации. кДНК вычитающей фракции метили биотинилированием (Tarantul V.Z., et al., 2000). После проведения гибридизации концевые участки вычтенной пробы достраивали Taq полимеразой и амплифицировали (27 циклов ПЦР) используя праймеры S1: 5 -AGCACTCTCCAGCCTCTCACCGCA-3 . Вычтенную кДНК инкубировали с рестриктазой Sal1 (Fermentas) и встраивали в плазмиду pBS SK, которую использовали для трансфецирования бактерий E. coli TG-1. Клоны переносили на 8-см фильтры Hybond и проводили гибридизацию с 32P-меченой кДНК вычитаемой или вычтенной проб. Для последующего анализа отбирали клоны, дающие сигнал только с вычитаемой пробой. Нуклеотидную структуру клонов определяли на автоматическом сиквенаторе Applied Biosystems и сопоставляли с последовательностями баз данных GenBank и EMBL. 9. Определение N2O3 по флуоресценции DAF 4,5-диаминофлуоресцеин (DAF) (Calbiochem) растворяли в ДМСО (2 мМ). Инкубационная смесь содержала 100 мкМ DAF, 50 мкМ хелатора DTPA (диэтилентриаминпентауксусная кислота), DPTA-NO и PTIO в обозначенных концентрациях. Реакцию проводили в 10 мкл буфера PBS (10 мин, 37С) и останавливали добавлением 50 мкл Трис-HCl pH 7,5. Флуоресценцию определяли на флуориметре Perkin-Elmer Victor 2D в режиме экстинкции 485 и эмиссии 535 нм. 10. Определение экспрессии генов с использованием олигонуклотидных микроматриц
Мы использовали олигонуклотидные микроматрицы (cDNA microarray slides) приобретенные у двух разных производителей: (1) Toronto University Microarray Center, эти матрицы (19К) содержали фрагменты кДНК 19.008 генов и (2) Service de Genomique Fonctionelle CEA (Evry, France) – матрицы (26К) содержащие олигонуклеотидные фрагменты 26.068 генов. На матрицах 19К кДНК всех генов были нанесены дважды. Мечение мРНК проводили при помощи набора реактивов Fair Play Microarray labeling kit (Stratagene). Для этого 12 мкг суммарной фракции РНК использовали для синтеза кДНК с праймерами олиго(дТ) (0,5 мкг), обратной транскриптазой AMV (50 ед) и модифицированными dNTP. После очистки на колонках образцы кДНК дополнительно модифицировали флуоресцентными метками Cy3 или Cy5 для материала, полученного из мРНК из контрольных и обработанных клеток, соответственно. Образцы кДНК, меченые по Cy3 и Cy5, смешивали и проводили гибридизацию с микроматрицами при 65С в течение 18 ч, которые потом промывали на установке Genomix Solutions. После этого микроматрицы сканировали на сканере GenePix 4000B (экстинкция 532 и 635 нм для Cy3 и Cy5, соответственно) и обрабатывали показания на программном обеспечении Axon Instruments Inc, CA и Mango Software (UK) (Rickman D.S. et al., 2003). Для последующего анализа отбирали гены, для которых соотношение сигналов обработанных и контрольных клеток было больше или меньше 2. Для проверки полученных на микроматрицах результатов наряду с обычно применяемой количественной ПЦР (см ниже) также был использован метод количественной ПЦР на 384-луночных пластинах (TaqMan low-density arrays) на приборе 7900 HT RT-PCR System (Applied Biosystems, CA). Амплификацию проводили в ходе 40 циклов (95С – 30 с, 60С – 1 мин). Нормализацию исходных данных проводили по уровню 18S рРНК. Синтез кДНК проводили обратной транскриптазой MMTV с использованием 6-нуклеотидных затравок в смеси со случайной структурой. Праймеры к отобранным генам подбирались производителем пластин (Applied Biosystems).