Введение к работе
Актуальность темы
Вирусные гепатиты занимают лидирующее место в группе заболеваний вирусной иолопіи. В 1989 г. был открьп вирус гепатита С (ВГС) (Chou ). Оказалось, что і 80 % посттрансфузионных гепатитов вызывается ВГС. Интерес к вирусному гепата-С (ГС) объясняется еще и тем, что заболевание, часто протекающее бессимптомно, іансформируется в хронические формы почти у 50 % больных, а исходом хроничес->го ГС в 20 % случаев могут быть цирроз печени и гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК) Isteban, 1989). В Европе и Азии ВГС является причинным агентом ГЦК в 50—75 % слу-:ев. По оценке экспертов CDC (Alter et al.,1992), в США ежегодно ожидается около 0 тыс. новых случаев заболевания ВГС, из них у 30 тыс. больных разовьется цирроз :чени, а около 10 тыс. попібнут от этой инфекции. Нельзя исключить вероятность того, о в нашей стране эти цифры могут быть аналогичными или еще выше.
К настоящему времени разработаны четыре поколения тест-систем для серодиаг-)сгаки ВГС. Однако, особенностью ВГС-инфекщш является позднее появление спе-іфических антител в сыворотке крови — от 3-4 месяцев до 2 лет и более от момента іфицирования, — что значительно затрудняет серодиагностику ВГС. Кроме того, ши-іко применяемые в России отечественные тест-системы II поколения уступают зару-жным аналогам. В результате риск передачи ВГС с переливаемой кровью, а также ме-[цинскими работниками остается высоким. Так, среди доноров С.-Петербурга анти-ла к ВГС были обнаружены в 2,4 % случаев, у медработников — в 1,2 %, у работаю-их с кровью лаборантов — в 6,3 % случаев (Мукомолов ,1992).
Представляется очевидным, что в диагностической практике целесообразно нсполъ вать методы прямой детекции ВГС в сыворотке крови, к которым относится и ПЦР-текция. По принятой классификации Симмондса ( Simmonds et al. 1994) ВГС, геном іторого представляет собой однонитевую РНК, можно подразделить на б основных нотипов и большое число субтипов, причем отмечена связь между генотипом вируса, жестью течения и исходоами заболевания (Nousbaum et al., 1995). Поэтому своевре-інная диагностика ГС, а также определение генотипа возбудителя, является важной іедпосьшкой эффективного лечения заболевания.
За рубежом созданы коммерческие диагностические наборы для обнаружения РНК "Сс помощью РТ-ПЦР ("Amplicor", "Inno-Lipa", и т.п.), которые широко использу-гся в зарубежной диагностической практике, однако слишком дорога для активного іименения в России. В нашей стране РТ-ПЦР для выявления РНК ВГС только начнет использоваться. Остается открытым и вопрос о генотипах циркулирующего у нас ~С и его нукяеотидных последовательностях. Имеются лишь единичные публикации по ому вопросу (Васильев, Вязов с соавт., 1994). Данные о нуклеотидных последователь-істях и генотипах циркулирующих в С.-Петербурге штаммов ВГС отсутствуют.
Таким образом, необходимость разработки оригинальных подходов к прямое лекции и определению генотипов ВГС не вызызает сомнения. Использование совремек-іх молекулярно-диагностических методов является особенно актуальным для нашей раны в связи с ограниченным количеством данных по циркуляции ВГС на террито-и России.
Целью настоящей работы явилась разработка высокочувствительного и высокоспе-фичного метода РТ-ПЦР для генодиагностики ВГС, и использование данного мето-ддя разработки подходов к определению генотипов штаммов ВГС, циркулирующих 2. -Петербурге.
Задачи настоящего исследования
-
Разработка методов амплификации фрагментов генс-Ш ВГС.
-
Приложение метода амплификации к диагностике ВГС.
-
Определение нуклеотидвдй последовательности фрагментов генома изолятов BI циркулирующих в С.-Петербурге.
-
Разработка метода генотипирования на основе анализа полиморфизма длин р трицированных фрагментов амшшфикатов и определение генотипов штаммов ВГС, щ кулирующих в С.-Петербурге.
Научная новизна работы
Создана система РТ-ПЦР, позволяющая детектировать ВГС и осуществлять пі винное генотипирование. Получены данные о распространении генотипов ВГС в Сані Петербурге. Впервые определены фрагменты нуклеотидных последовательностей ті изолятов ВГС, циркулирующих в Санкт-Петербурге. Показано, что полученные изо; ты относятся к генотипу lb и родственны "индийским" йзолягам.
Практическая значимость работы
В результате проведенного исследования разработана и внедрена в клиническ практику специализированной клиники вирусных инфекций НИИ гриппа РАМН то система для генодиагностики ВГС и его генотипирования на основе полиморфизма дл рестрицированных фрагментов. Данные о распределении генотипов ВГС, циркулиру щих в С.-Петербурге, могут учитываться при назначении комплексной ггротивовир; ной терапии. Внедрение РТ-ПЦР позволяет выявлять этиологию заболевания у пащк тов с ^верифицированными гепатитами.
Основные положения, выносимые на зашиту
-
Разработан метод генодиагностики ВГС в клиническом материале с использої ниєм оригинальных универсальных и высокоспецифичных праймеров.
-
Разработанный метод РТ-ПЦР, основанный на применении праймеров, флг кирующих консервативную и вариабельную области генома вируса гепатита С, позі ляет, благодаря оригинальной структуре праймеров, проводить не только диагаостш но и генотипирование этого вируса.
-
Разработанная система РТ-ПЦР диагностики, позволяет выявлять этиолопги кую причину заболевания у серонегативных больных вирусным ГС.
-
Определены нулеотидные последовательности фрагмента гена core ВГС.
-
РТ-ПЦР является эффективным методом контроля проводимой терапии в пг. цессе лечения больных гепатитом С.
Адробапия работы
Материалы диссертации были представлены на международной конференц: "Progress in Clinical Virology", Стокгольм, 1994; международном симпозиуме "IX Trienn International Symposium on Viral Hepatitis and Liver Disease", Рим, 1996; X междунарс ном вирусологическом конгрессе "International Congress of Virology", Иерусалим, 195 II Всеросийской конференции "Полимеразная цепная реакция в диагностике и юж роле лечения инфекционных заболеваний", Москва, 199S.
По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ.
Структура, п объем днесерташт
Диссертация состоит из введения; обзора литературы, включающего 3 главы; р зультатов собственных исследований, включающих "Материалы и методы" и "Резулы ты и обсуждение", изложенные в 5 главах; выводов и списка литературы. Работа изл жена на1о5страницах машинописного текста, содержит 12. таблиц,5 рисунков; спио литературы содержит ^^наименований на русском и английском языках.