Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 15
1. Понятия о нейротрофических факторах 15
1.1. Классификация нейротрофических факторов 16
1.2. Сравнительная характеристика представителей семейства GDNF лигандов. 17
1.2.1.Артемин (ARTN) 17
1.2.2. Нейртурин (NRTN) 18
1.2.3. Персефин (PSPN) 18
1.2.4. Глия-производный нейротрофический фактор (GDNF) 19
2. Рецепторы нейротрофических факторов. 25
2.1. Рецепторы семейства GDNF 25
2.2. Характеристика GFR рецепторов 28
2.2.1. Особенности структуры GFRs рецепторов семейства GDNF (GFRs) 29
2.3. Характеристика рецептора тирозинкиназы. 31
2.3.1. Особенности структуры RET 33
2.4. Образование GDNF-GFR-RET комплекса 35
3. Влияние GDNF на нейральные клетки 37
4. Возможные способы применения GDNF в клинике. 39
5. Hsp70 промотор, как регулируемая система активации гена 42
5.1. Фактор теплового шока (HSF) 44
5.1.1. Понятие о факторе теплового шока (HSF) 44
5.1.2. Классификация факторов теплового шока (HSF) 45
5.2. Основные характеристики промотора hsp70 48
5.2.1. Этапы регуляции промотора hsp70 48
5.2.2. Особенности строения промотора hsp70 50
Глава 2. Материалы и методы 54
2.1. Объекты 54
2.1.1. Белки, ферменты и реактивы 54
2.2. Общие методы работы с бактериями Escherichia coli. 54
2.2.1.Получение компетентных клеток 54
2.2.2.Трансформация компетентных клеток плазмидами 55
2.3 Методы работы с ДНК 55
2.3.1. Выделение плазмидной ДНК из Е. сoli в малом объеме (Miniprep) 55
2.3.2. Выделение плазмидной ДНК в большом объеме (Maxiprep) 56
2.3.3.Электрофорез в агарозном геле 57
2.4. Методы генетической инженерии 57
3.4.1.Полимеразная цепная реакция (ПЦР). 57
2.4.2.Рестрикция плазмидной ДНК 58
2.4.3. Выделение фрагментов ДНК из геля 58
2.4.4. Лигирование 59
2.4.5. Анализ ДНК-последовательности 59
2.4.6. Схема клонирования продукта амплификации в pGEM - T Easy вектор. 59
2.4.7. Очистка плазмид для введения в культуру клеток млекопитающих. 60
2.5. Работа с культурой клеток НЕК293 60
2.5.1 Ведение культуры клеток НЕК293 60
2.5.2. Введение плазмиды в клетки линии НЕК293 методом трпнсфекции 61
2.5.3.Анализ промотора hsp70 Drosophila melanogaster с регуляторной последовательностью 61
2.5.4. Получение трансгенных клеточных культур. 62
2.6. Определение уровня экспрессии репортерных генов 62
2.6.1. Выделение тотальной РНК из культуры клеток НЕК 293. 62
2.6.2. Получение кДНК к GDNF (Обратная транскрипция). 63
2.6.3. Обратная транскрипция. 63
2.6.4. Выделение белка из клеток для Вестерн-блот гибридизации. 64
2.6.5. Выделение белка из кондиционированной среды культур клеток. 64
2.6.6. Электрофорез белков в полиакриламидном геле. 64
2.6.7. Вестерн-блот гибридизация. 65
2.7. Модели для анализа нейропротекторной способности изоформ GDNF 66
2.7.1. Получение кондиционированных сред с трансгенных клеточных линий. 66
2.7.2. Получение кондиционных сред после культивации трансгенных клеток. 66
2.7.3. Культивация клеток РС12 и анализ образования отростков 67
2.7.4.Методика получения спинальных ганглиев. 68
2.7.5. Оценка апоптоза. 68
2.7.6. Количественная оценки методом ELISA. 69
2.8. Иммуногистохимический анализ. 69
2.8.1.Иммуноцитохимический анализ спинальных ганглиев. 69
2.8.2. Проведение трансплантации. 70
2.8.3. Иммуногистохимический анализ зоны трансплантации. 70
Глава 3. Результаты 73
3.1. Анализ экспрессии и секреции GDNF в зависимости от наличия pre- и pro областей 73
3.2. Изучение фактора GDNF под контролем регулируемого промотора hsp70 Drosophila melanogaster 101
Обсуждение 116
Заключение 122
Выводы 123
Список литературы 124
- Глия-производный нейротрофический фактор (GDNF)
- Особенности строения промотора hsp70
- Анализ экспрессии и секреции GDNF в зависимости от наличия pre- и pro областей
- Изучение фактора GDNF под контролем регулируемого промотора hsp70 Drosophila melanogaster
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Глиальный нейротрофический фактор (GDNF) был идентифицирован в среде, в которой культивировались клетки глиальной клеточной линии. Свойства GDNF были охарактеризованы на основе способности содействовать выживанию клеток, а также увеличению их размера и длины нейритов мезенцефалических дофаминергических нейронов in vitro. (Lin, 1993; Lin, 1994).
GDNF первоначально считали селективным фактором выживания для
дофаминергических нейронов. Это обусловлено его позитивным влиянием на
трофику и жизнеспособность мезенцефалических дофаминергических нейронов.
Массовая гибель этих нейронов наблюдается при социально значимом
нейродегенеративном заболевании болезни Паркинсона (Stromberg, 1993). GDNF
поддерживает выживание мотонейронов спинного мозга (Henderson, 1994) и
норадренэргических нейронов мозга (Arenas, 1995), а также стимулирует
выживание, миграцию и дифференцировку некоторых периферических нейронов
(Trupp, 1995). GDNF также способствует поддержанию моторных, симпатических,
парасимпатических, сенсорных и энтеральных нейронов, и помимо этого, за
пределами нервной системы регулирует развитие почек и сперматогенез
(Airaksinen, 2002; Paratcha, 2008). Столь обширные свойства GDNF не могли не
привлечь внимания специалистов. Однако использование рекомбинантой формы
GDNF для поддерживающей и восстанавливающей терапии при
нейродегенеративных заболеваниях не ознаменовалась успехом, как это
изначально ожидалось. Более поздние работы приводят исследователей к
предположению, что существующие различные изоформы GDNF, обладают
различными свойствами и появляется необходимость изучения строения и
процессинга GDNF. В настоящее время ведутся поиски биологических подходов
применения GDNF в терапии нейродегенеративных заболеваний мозга.
Интенсивное изучение GDNF выявило большое разнообразие его изоформ. Изоформы GDNF имеют особенности в секреции, а также большое количество рецепторных комплексов, на которые они влияют. Однако, многие особенности синтеза, секреции, рецепторных взаимодействий и сигналинга с участием GDNF остаются невыясненными и требуют дальнейшего изучения. Для исследования нейротрофических свойств различных вариантов GDNF человека в нашей работе был проведен анализ влияния делеций pre- и pro- последовательностей на данную функцию GDNF. Использование генетических конструкций с участием GDNF c делециями этих последовательностей помогло выявить интересные особенности экспрессии и секреции GDNF, а также особенности его нейротрофических свойств. Эффективность GDNF с делетированными pre- и pro- последовательностями была проанализирована на разработанных нами клеточных моделях, которые позволили оценить их нейротрофическое воздействие на незрелые клетки. Оптимальный по нейротрофическим свойствам mGDNF был исследован на модельных животных с
гибелью нейронов. Кроме того, для повышения эффективности генно-клеточных препаратов не менее важно обеспечить регулируемый режим экспрессии трансгенного белка. В настоящее время известно, что постоянная экспрессия трансгенного фактора может отрицательно влиять как на трансгенную клетку, так и на окружающие ткани организма при трансплантации (Black J.L. at al., 2003). В связи с этим, особый интерес представляет поиск регулируемых промоторов. В своем исследовании мы предложили модель, где промотор гена белка теплового шока HSP70 Drosophila melanogaster будет выполнять роль промотора и регулировать работу связанного с ним гена. Данный промотор, является представителем из класса регулируемых промоторов, и начинает свою работу в отсутствии воздействия антибиотиков или каких-либо химических агентов. Активация данного промотора происходит не только при нагревании трансгенной клетки, но и при наличии тканевых сигналов воспаления. Наше исследование направлено на комбинацию использования свойств GDNF и промотора теплового шока hsp70 в очаге воспаления при нейродегенеративном заболевании (на примере болезни Паркинсона). Данное сочетание даст локальное и точечное применение нейротрофичесокго фактора, при терапии нейродегенеративных заболеваний.
Степень разработанности темы исследования.
Известно, что болезнь Паркинсона (PD) связана с утратой нейронов
дофаминэргических нейронов среднего мозга (Bjrklund and Dunnett, 2007;
Meissneretal., 2011). Изучалась возможность введения GDNF, (белка или с
использование генной терапии) и его воздействие на дифференцировку новых
нейронов в зоне поражения или поддержание жизнеспособности уже
существующих.
Доклинические исследования, которые были проведены на грызунах
(Becketal., 1995; Hofferetal., 1994; Tomacetal., 1995; Winkleretal. , 1996) и приматах
(Gashetal., 1996) показали эффективность GDNF как потенциального
терапевтического агента. Однако результаты клинических испытаний на людях
оказались противоречивыми. Клинические исследования рекомбинантного GDNF
при интрацеребровентрикулярном введении больным болезнью Паркинсона
показали, что улучшения были незначительны или отсутствовали, стало понятно,
что необходимы дополнительные исследования в области физиологического
воздействия фактора на организм. (Ibezetal., 2017). Изначально, значимый
эффект наблюдался, при введении рекомбинантного GDNF в полосатое тело мозга пациента, с помощью минипомпы, (Gill, et al., 2003.). Однако потом не был подтвержден на двойной слепой фазе II клинических испытаний, которые проводила компания Amgen. В результате компания отказалась от дальнейших клинических исследований. Также были остановлены два других клинических испытания GDNF, с использованием, как белка, так и генетической конструкции с использованием адено-ассоциированного вируса (AAV). Было обнаружено, что
при введении GDNF, наблюдалось аббератное прорастание повторно
иннервирующих аксонов к области инъекции GDNF (Georgievska et al., 2002; Georgievska et al., 2004; Hudsonetal., 1995). Тем не менее, принимая во внимание хорошо известные протективные свойства GDNF, научное и бизнес сообщества не прекращают попыток найти способ применения этого фактора в лечении нейродегенеративных заболеваний. Так компании MedGenesis Therapeutix и Pfizer заключили соглашение по совместной разработке методов применения GDNF и методами расширенной доставки для лечения болезни Паркинсона. Одним из возможным путей достижения эффективности GDNF является изучение свойств и транспорта нейротрофического фактора в зависимости от размеров pro-последовательности GDNF.
В данной работе предложена гипотеза о том, что в организме синтезируются разные формы GDNF, которые обладают различными свойствами. В связи с этим актуально исследование изоформ GDNF и изучение роли pro-последовательности в сохранении вышеописанных свойств фактора.
Целью данной работы является: Исследование путей возможного улучшения и
контроля нейроиндукторных свойств GDNF человека. Для достижения
поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
-
Получение генетических конструкций, содержащих GDNF/GFP с удаленными pre- и pro- областями GDNF в различных комбинациях под контролем CMV-промотора.
-
Исследование эффективности экспрессии и секреции хGDNF/GFP в культуре трансгенных клеток НЕК 293.
-
Анализ свойств химерных белков хGDNF/GFP как стимуляторов нейральной дифференцировки in vitro.
-
Анализ поведения трансгенных клеток, продуцирующих эффективный вариант хGDNF/GFP, при трансплантации в мозг модельных животных.
-
Получение и изучение регулируемой системы экспрессии GDNF на примере использования промотора hsp70 Drosophila melanogaster.
Методология исследования.
Работа выполнена с использованием современного оборудования и
методов молекулярной и клеточной биологии. В ходе выполнения
диссертационной работы был использован широкий диапазон методов,
включающих методики молекулярного клонирования, иммуноцитохимического окрашивания, Вестерн-блот анализа, ELISA, ПЦР, обратной транскрипции, клеточной биологии и т.д.
Научная новизна и практическая значимость работы.
В настоящей работе впервые дана сравнительная характеристика
изменения нейроиндукторных свойств GDNF при последовательной делеции pre- и
pro-последовательностей. Для трансгенных клеточных линий было показано, что
химерные белки, состоящие из нейротрофического фактора GDNF с
делетированными pre- и pro-последовательностями и зеленого флуоресцентного
белка GFP, секретируются из клетки в питательную среду вне зависимости от
модификаций GDNF. Продемонстрировано, что среда, кондиционированная
факторами после культивирования трансгенных клеточных культур с GDNF, может
быть использована, как индуктор нейрональной дифференцировки. В работе
представлена система тонкой регуляции экспрессии трансгена в клетках
млекопитающих с использованием регуляторного промотора hsp70 Drosophila
melanogaster, содержащего 4 и 8 HSE. Преимущество использования данной
системы регуляции состоит в запуске каскада экспрессии гена, используя лишь
состояние стресса (например, повышение температуры) и не требует
использования дополнительных химических агентов.
Полученные результаты позволяют расширить представление о
функциональной необходимости pre- и prо-последовательностей на активность GDNF. В силу обнаруженных характеристик GDNF данная работа позволяет получить оптимальный по своим нейроиндукторным свойствам вариант mGDNF, который может быть применим в терапии при нейродегенеративных заболеваниях. Кроме того, поиск эффективных стимуляторов нейральной дифференцировки, несомненно, должен активизировать интерес к разработке регуляции экспрессии подобных сильных индукторов, чему также посвящена данная работа. В конечном итоге, результаты данной работы направлены на развитие генной и клеточной терапии, которые имеют огромное значение при регенеративной медицине.
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Делеция pre- и prо-последовательностей гена GDNF не нарушает секрецию GDNF из клетки.
-
mGDNF/GFP с делецией pre- и prо-последовательностей секретируется из клетки в среду и обладает нейроиндукторными свойствами.
-
Делеция только pre-последовательности GDNF не нарушает секрецию prо-GDNF/GFP из клетки в среду, но блокирует его способность стимулировать образование нейральных отростков у эмбриональных спинальных ганглиев крысы.
-
Делеция prо-последовательности GDNF, не нарушает секрецию prо-GDNF/GFP из клетки в среду и не снижает способности фактора
стимулировать образование нейральных отростков у спинального эмбрионального ганглия крысы.
-
Имплантация трансгенных клеток НЕК293 продуцирующих mGDNF/GFP редуцирует эффект пронейротоксина MPTP на мышиной модели болезни Паркинсона.
-
Увеличение количества HSE последовательностей с 4 до 8 перед промотором hsp70 Dr.melanogaster значительно усиливает его чувствительность к температурному воздействию в клетках млекопитающих.
-
При трансплантации в мозг мышей с фокальной церебральной ишемией клеток НЕК293 с GDNF/GFP под контролем промотора hsp70 Dr.melanogaster с 4 или 8 HSE последовательностями в предпромоторной области GDNF/GFP активно синтезируется как минимум 5 дней.
Степень достоверности и апробации результатов работы.
Работа выполнена на высоком методическом уровне. Полученные в ходе данной работы результаты согласуются с современными отечественными и зарубежными литературными данными. Выводы, полученные в ходе работы, обоснованы, соответствуют поставленным задачам и четко отражают полученные результаты.
Основные результаты диссертационной работы были представлены на всероссийских и международных конференциях. Достоверность полученных результатов подтверждается публикациями в рецензируемых научных журналах. По материалам работы опубликовано 4 печатные работы и получено два патента РФ (смотри список опубликованных работ).
Личный вклад автора
Автор внесла существенный личный вклад в получение изложенных в диссертации новых научных данных. Автором выполнен основной объем работы: создание генетических конструкций, получение трансгенных линий НЕК 293 с геном GDNF и их анализ. Проведение ПЦР анализа, Вестерн-гибридизация, ELISA. Изучение действия кондиционной среды на моделях in vivo и in vitro выполнено совместно с соавторами, указанными в публикациях. Кроме того, соискатель принимала участие в разработке стратегии научного исследования и написании статей.
Структура и объем работы
Диссертация состоит из следующих разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Осуждение», «Заключение», «Выводы» и «Список литературы». Работа изложена на 153 страницах, включает 3 таблицы и 40 рисунков. Библиография включает 325 источников.
Глия-производный нейротрофический фактор (GDNF)
GDNF был впервые описан, как нейротрофический фактор, который стимулирует сохранение жизнедеятельности дофаминергических нейронов среднего мозга in vitro (Lin et al., 1993). Это открытие вызвало существенный интерес в связи с симптоматической фазой болезни Паркинсона (PD), нарушениями моторной функции и дегенерацией дофаминергических нейронов в компактной зоне черной субстанции среднего мозга (German et al., 1992). Позднее, было обнаружено, что GDNF является также важнейшим трофическим фактором для спинальных мотонейронов (Henderson et al., 1994) и для центральных норадренэргических нейронов (Arenas et al., 1995). GDNF играет немаловажную роль и вне нервной системы, как например, в развитии почек и сперматогенезе (Moore et al., 1996; Pichel et al., 1996; Sanchez et al., 1996; Meng et al., 2000). GDNF широко экспрессируется в центральной и периферической нервных системах (Schaar et al., 1993; Strmberg et al., 1993; Golden et al., 1998), а также и в других тканях и типах клеток (Trupp et al., 1995; Suvanto et al., 1996; Golden et al., 1999). GDNF синтезируется, как 211 аминокислотный прекурсор, в то время, как зрелая секретируемая форма состоит из 134 аминокислот и имеет молекулярный вес 15kDa. (Lin et al., 1993). Однако, как протеолитический процесс, так и секреция GDNF мало изучены.
GDNF белок отличается от других нейротрофических факторов. Во-первых, GDNF белок N-гликозилирован по двум аминокислотным остаткам. Этот факт интересен тем, что, как правило, зрелые факторы роста редко или почти никогда не N-гликолизированы. Во-вторых, GDNF содержит семь цистеиновых остатков в такой же пространственной конфигурации, как и другие участники TGF-p суперсемейства. Аминокислотная последовательность между GDNF и TGF-P суперсемейства гомологична менее, чем на 20%, однако структура цистеиновых остатков позволяет определить GDNF, как отдаленного члена этого семейства (Lin et al., 1993).
Также следует отметить, что GDNF образует «цистиновый узел», как и другие представители семейства TGF-p. (Eigenbrot and Gerber, 1997). «Цистиновый узел» содержит кольцо, состоящее из двух пептидных цепей, скрепленных двумя цистинами. Третий цистин проходит через кольцо, образуя узел (McDonald et al., 1995).
Определение кристаллической структуры рекомбинантного GDNF подтверждает, что конформация GDNF очень схожа с двумя охарактеризованными членами TGF-P семейства—TGF-P2 и BMP-7 (Eigenbrot and Gerber, 1997). При димеризации GDNF по принципу «голова к хвосту» образуется гомодимер, который поддерживается одной дисульфидной связью. Данный гомодимер биологически активен. Молекула GDNF содержит два потенциальных сайта гликозилирования, однако показано, что негликозилированный рекомбинантный GDNF также обладает биологической активностью. (Lin et al., 1993).
Молекула зрелого GDNF содержит 134 аминокислоты. Показано, что N-терминальный участок GDNF, в области 37-40 аминокислоты, структурно мобилен. Кристаллическая структура мономера GDNF, содержит -тяжи, которые формируют два цинковых пальца, и -спираль (рисунок 2). Существует ряд структурных отличий между GDNF и участниками TGF-p семейства. Например, участок цинкового пальца GDNF состоит из непрерывных bp-нитейтяжей, в то время как р-тяжи у TGF-bp2 и ВМР-7 характеризуются срединными разрывами. Кристаллическая структура GDNF представлена в двух конформациях димера, которые отличаются изгибом петли в центральном участке.
Основываясь на этих результатах исследования структуры GDNF, Eigenbrot и Gerber обнаружили, что и другие члены TGF-p суперсемейства могут быть также димерами и могут принимать ряд конформаций в растворе. Кроме того, авторы показали, что при взаимодействии GDNF с рецептором, положительный заряд концентрируется по всей задействованной поверхности -спирали (аминокислоты 81-91), а отрицательный заряд - на участках цинковых пальцев 1 и 2 (Рисунок 1). Незаряженным остается участок в области цинкового пальца 2, образованный аминокислотами: лейцин 118, валин119, и тирозин 120 (Eigenbrot and Gerber, 1997).
Сиквенс GDNF, ARTN и PSPN представлены последовательностями крысы, в то время как NRTN представляет собой последовательность мыши, так как сиквенс NRTN крысы не представлен в базе данных. Регионы с высокой степенью сходства последовательностей показаны жирным шрифтом. Структурные и функциональные свойства выделены: Одиночное подчеркивание; -спираль в соответствии со структурой кристаллов из Eigenbrot и Gerber, 1997 (GDNF) и Silvian et al., 2006(ARTN). Двойное подчеркивание; связывания последовательности гепарина/ остаток согласно Alfano et al.,2007 (GDNF) и Silvian et al.,2006 (ARTN). Фиолетовый: остаток цистеина, который входит в состав внутримолекулярных цистеиновых мостов. Зеленый: сигнальный пептид (согласно UniProt). Синий; пропептид (согласно UniProt). Розовый: остатки, взаимодействующие с GFR соответствии с Wang et al.,2006. (https://helda.helsinki.fi/bitstream/handle/10138/22022/structur.pdf?sequence=1 )
Структурно- функциональный анализ показал, что первые 39 аминокислот на N-конце GDNF не требуются для его биологической активности. 3D-структуры N-концевого фрагмента отсутствуют. С-конец имеет решающее значение для стабильности и биологической активности GDNF, поскольку на С-конце нейротрофина расположены сигнальные последовательности, участвующие в связывании GDNF с GFR1-рецептором (Chen Z.Y., et al., 2000; Chen Z., et al., 2000; Parkash V., et al., 2009). Незрелая молекула GDNF состоит из 211 аминокислот, и содержит участки расщепления сигнальной последовательности и продомена. Зрелые молекулы состоят из 134 аминокислот. В процессе созревания происходит гликозилирование белка и образование гомодимера за счет образования дисульфидных связей (Lin et al., 1993) Именно в форме гликозилированного гомодимера реализуются различные биологические функции данного нейротрофического фактора. GDNF синтезируется в виде белка-предшественника — pro-GDNF.
У многих млекопитающих, например у человека или грызунов, ген GDNF кодируется двумя матричными РНК, которые продуцируются посредством альтернативного сплайсинга: длинно-цепочный транскрипт [pre-()pro-GDNF] и короткий транскрипт [pre-()pro-GDNF] , у которого не хватает 78 н в участке pro-области (Suter-Crazzolara и Unsicker, 1994; Trupp et al., 1995; Matsushita et al., 1997; Grimm et al., 1998). Группа ученых во главе с M.Saarma подтвердили наличие pre-()pro-GDNF и pre-() pro-GDNF в головном мозге взрослого человека и мыши, а также в культуре нейральных клеток гиппокампа головного мозга мыши, с помощью секвенирования кДНК. Кроме того, ими было показано, что обе изоформы экспрессируются в эмбриональных культурах клеток линий E13, E15, E17 (Lonka-Nevalaita et al.,2010). Результаты данных исследований опубликованы в статье Lonka-Nevalaita и M. Saarma, где использовались первичные кортикальные нейроны клеточной линии PC-6.3 и субклональные крысиные феохромоцитомы клеточной линии PC12 для изучения, локализации и секреции белков кодированных форм pre-()pro-GDNF и pre-()pro-GDNF. (Lonka-Nevalaita et al., 2010). Крысиные нейроэндокринные клетки линии PC-6.3 проявляли нейронально-подобный фенотип при воздействии нейрональных индукторов, например NGF (Pittman et al., 1993). Наряду с тем на данной линии клеток было обнаружено, что процессинг и секреция GDNF отличаются от аналогичных процессов, происходящих с BDNF и NGF (Lonka-Nevalaita et al., 2010). В клеточных линиях и первичных нейронах, белки, кодированные pre-()pro-GDNF и pre-()pro-GDNF имеют различную локализацию. Было обнаружено, что продукт pre-()pro-GDNF транспортируется через аппарат Гольжди и везикулы, тогда как фактор, полученный от pre-()pro-GDNF преимущественно секретируется через секреторные везикулы. Такие отличия в пути секреции двух этих продуктов могут говорить о различиях в их функциях.
Дальнейшее изучение процессинга и секреции GDNF показало, что длина pro области и C-терминальные цистеины важны для этих процессов (Oh-hashi et al.,2009).
Наличие pro-областей найдено и у других нейротрофических факторов, у которых, однако, не обнаружен факт наличия двух вариантов длины этой области и взаимосвязи этой длины и пути секреции фактора. Так, например, известно, что фактор роста нервов (NGF) и нейротрофический фактор мозга (BDNF) имеют схожие pro-области и даже описаны pro-формы этих нейротрофических факторов и их функции. Зрелые NGF и BDNF участвуют в поддержании жизнедеятельности нервной клетки, стимулируют дифференцировку и синаптическую модуляцию (Huang и Reichardt, 2001), в то время как pro-BDNF и pro-NGF по ряду исследований, предположительно индуцируют гибель клеток (Lee et al., 2001; Nykjaer et al., 2004; Thomas и Davies, 2005). M. Saarma с коллегами посредством Вестерн-блот анализа выявили, что при оверэкспрессии pre-()pro-GDNF и pre-()-pro-GDNF находятся внутри клеток преимущественно в pro-формах и частично обнаруживаются в pro-формах в клеточной ростовой среде. Также было выяснено, что нерасщепленные ()pro-GDNF и () pro-GDNF и расщепленные pro-участки наряду со зрелым GDNF локализуются на клеточной поверхности (Lonka-Nevalaita et al.,2010). Предварительный эксперимент по связыванию pro-участков ()pro-GDNF и () pro-GDNF с корецептором GFR1 не дал положительного результата, что говорит о том, что с клеточной поверхностью взаимодействуют в основном pro-GDNF белки, а не отдельные pro-участки. Это означает, что протеолитическое расщепление pro-GDNF с образованием m-GDNF может происходить также вне клеток, скорее всего во внеклеточном матриксе. Кроме того, pro-GDNF белки могут оставаться в нерасщепленной форме и выполнять специфические функции вне клеток (Lonka-Nevalaita et al.,2010).
Особенности строения промотора hsp70
HSP70 это основной тепло-индуцируемый внутриклеточный шаперон Drosophila melanogaster, который обеспечивает не только толерантность к стрессу (Feder и Krebs 1998), но и также принимает участие в регулировании клеточного роста и смерти клетки (Zatsepina et al. 2001; Gabai и Sherman 2002). Повышенный уровень HSP70, как правило, выгоден для термотолерантности, но вреден для роста и развития (Krebs и Feder 1997, 1998; Zatsepina et al., 2001). Количество генов, кодирующих HSP70, варьирует. Например, у Drosophila melanogaster, не менее пяти генов кодируют HSP70. У человека существует не менее 11 генов семейства HSP70, которые кодируют белки с молекулярной массой от 66 до 78 кДа. (Bettencourt и Feder 2002). Ввиду строгой регуляции транскрипции генов hsp70, удаленные участники промотора контролируют изменения уровня экспрессии hsp70.
Промотор hsp70 в эволюции животного мира достаточно слабо изменяется. Так, например, было показано при сравнительном анализе сходства промоторов гена hspA1A человека и hspA1A мыши, что идентичность последовательности этими промоторами составила 70%. (Wu et al., 1986; Greene et al., 1987; Williams and Morimoto 1990; Bevilacqua et al., 1997; Bevilacqua et al., 2000).
В работе Reinaв определены 11 элементов необходимых для транскрипции: два элемента теплового шока (HSEs; Hsf1/2),), три GC элемента (Sp1), три AP2 элемента (AP2), два CCAAT элемента (CTF/CBF/CREB связывающий белок (CBP)), и один TATA элемент (TFIID), которые связываются с факторами транскрипции. (Reina 2012). Обнаружены три-четыре различия между регуляцией человеческого и мышиного промоторов: (1) мышиный не имеет GC элемента в области -245, (2) обнаружены замены элемента AP2 у мышей в положении -20 на GC элемент и (3) замены CCAAT элемента в области -152. Вероятно, подобные замены незначительно влияют на регуляцию hsp70. При этом было отмечено, что большое количество элементов регулирующих экспрессию hsp70 позволяет промотору данного гена реагировать на различные изменения в окружающей среде, а также на состояние стресса в организме. Интерес к изучению подобной тонкой регуляции активации промотора не снижается до сих пор. В работах Ray с соавторами исследован промотор в гене человека hspA1A и его регуляторная зона. Было изучено 296 пар азотистых оснований от -259 до +37 относительно сайта инициации транскрипции (Ray et al., 2004); в данной зоне расположены основные и инициируемые элементы регуляции НSP70. Было показано, что помимо элементов HSE, которые необходимы для активации в условиях вызванных стрессом, на данном участке обнаруживается присутствие девяти элементов, таких как три GC участка, два CCAAT, три AP2 элемента и TATA участка. (Wu et al., 1986; Greene et al., 1987; Williams et al., 1989; Williams and Morimoto 1990; Bevilacqua et al., 1997; Christians et al., 1997). Промотор мыши hspa1a наиболее близок к человеческому hsp70 промотору, но имеет незначительные отличия и состоит из элементов HSEs, четырех GC, одного CCAAT участков, одного AP2 элемента, одного AP1 элемента, и TATA участка. (Bevilacqua et al., 1997; Christians et al., 1997; Bevilacqua et al., 2000).
Кроме того, было обнаружено, что к HSE-последовательности примыкает белок, содержащий в своей структуре гидрофобный лейцин- изолейциновый повтор (nLIR) , ответственный за олигомеризацию HSF ( Schaif et al., 1990 , Peteranderl et al., 1992 ). В С-терминальной области расположен третий домен, который выполняет трансактивационную функцию HSF и in vivo в отсутствие стресса подвержен негативной регуляции (Peteranderl et al., 1992 , Chen et al., 1993 , Green et al., 1995 , Shi et al., 1995 , Wisniewski et al., 1996 ). К последнему домену с N-конца примыкает еще один лейцин-изолейциновый повтор (cLIR) (Rabindran et al., 1993, Zuo et al., 1994). Его присутствие или целостность необязательны для трансактивации (Wisniewski et al., 1996).
Интенсивная транскрипция генов hsp70 активируется связыванием фактора теплового шока (HSF) с элементами регуляции теплового шока в промоторе каждого гена hsp70. В то время как HSEs 1 и 2 достаточно для транскрипции нескольких генов HSP70, для полной транскрипции требуется все четыре HSEs (Xiao и Lis 1988; Lee et al., 1994; Shopland et al., 1995). Важным считается так же расстояние между линейно расположенными HSEs факторами. Существование участков из 1-5 и 11-14 нуклеотидов между HSEs 1 и 2 снижает активность промотора на 90%, в то время как участки из 6-10 и 16-18 нуклеотидов в значительной степени восстанавливают активность промотора ( Amin et al., 1994 ).
В ряде работ показано, что HSF млекопитающих способен взаимодействовать с промотором гена HSP70 Dr.melanogaster и активировать его (Павлова Г.В. и др. 2005). Встает вопрос, возможно ли использование этого промотора для активации терапевтических генов. Преимущество данного промотора в том, что он может активироваться при повышении температуры или при воспалительных процессах. Почему интересен именно промотор гена hsp70 Dr.melanogaster? Потому что, промотор млекопитающих активизируется при слишком высоких температурах и не может быть использован. В ряде работ утверждается, что исследуемый промотор в клетках млекопитающих активизируется при 42С, что крайне травматично для клеток, и снижает возможности использования промотора в практике (Glazenburg К et al. l992, Roigas J. Et al. 1997). Тогда как в работах Павловой Г.В. показано, что промотор гена hsp70 Dr.melanogaster, попадая в клетки млекопитающих, не активизируется при 37С, как это могло ожидаться (температура активации в клетках дрозофилы), но и не подчиняется температурному режиму активации млекопитающих 42С. Показано, что его активация наблюдалась с 40С. Тогда встает вопрос о возможности регулируемости данной активации. Ведь если появится возможность снизить активацию промотора до 39 С, то это будет уже приемлемая температура для клеток млекопитающих, не приводящая к термальным повреждениям эти клетки. Обнаруженное в работах изменение температурного воздействия на активацию промотора гена hsp70 Dr.melanogaster может быть связан с факторами регулирующими процесс активации промотора (Павлова Г.В. и др. 2005). Например, помимо триммера HSF в регуляции изучаемого промотора также участвует белок CHBF (constitutive HSE-binding factor). Данный белок в отсутствие воздействия теплового шока конститутивно связан с регуляторной областью промотора hsp70, причем было обнаружено, что даже если спровоцировать тримеризацию HSF, активация HSP70 все равно не произойдет. Белок CHBF освободит место для триммера только после воздействия теплового шока (или другого стрессового воздействия) (Jacoby et al., 1994). В условиях теплового шока CHBF вытесняется HSF. Было обнаружено, что нормальных клетках млекопитающих мягкий тепловой шок (41С), хотя и вызывает активацию HSF, но не приводит к индукции HSP70, и CHBF остается связанным с промотором hsp70. При воздействии более высоких температур CHBF покидает промотор и замещается HSF. Вероятно, на этом и может быть основано изменение температурного интервала для промотора hsp70 дрозофилы в трансфицированных клетках млекопитающих. CHBF млекопитающих имеет меньшую гомологию с участком связывания и соответственно освобождает место для триммера при более низкой температуре, чем температура теплового шока млекопитающих, сдвигая, таким образом, температурный интервал активности может снижаться. Таким обазом, появляется необходимость поиска изменений в регуляции промотора, для достижения снижения температуры активации. В данной работе мы попытались изучить влияние увеличения HSE областей на чувствительность промотора.
Анализ экспрессии и секреции GDNF в зависимости от наличия pre- и pro областей
Строение гена нейротрофического фактора включает в себя область нуклеотидной последовательности соответствующей сигнальному пептиду (pre-область (57пн)), последующая за ним область pro региона (174пн) и область зрелого GDNF представлена 402пн. Мы синтезировали несколько модификаций гена GDNF, каждая из которых отличалась наличием или отсутствием комбинаций pre- и pro- областей (Рисунок 7).
Для анализа экспрессии и секреции GDNF в зависимости от наличия pre- и pro областей были синтезированы генетические конструкции на основе вектора pEGFP-N1.
Все конструкции были построены по принципу хGDNF–фьюжн-GFP для визуализации трансгенных клеток, несущих исследуемый ген. Последовательность гена нейротрофического фактора человека GDNF была синтезирована с помощью ПЦР на основе плазмиды phGDNF, для этого была использована первая изоформа Р39905-1 согласно базе данных UniProtKB Р39905. Для синтеза были использованы коммерческие праймеры Т3 (прямой) и GDNF BamH1 (обратный) (последовательность праймеров представлена в главе материалы и методы), полученный pre-pro-GDNF соответствовал искомому размеру. Данный фрагмент был встроен в коммерческий вектор pGEM Easy (Promega #1360), согласно протоколу. Полученная конструкция pGEM/ pre-pro-GDNF была проверена на наличие вставки с помощью рестрикции по сайту EcoRI в соответствующем буфере согласно протоколу и методом секвенирования. Фрагмент размером 633пн из конструкции pGEM/ pre-pro-GDNF, содержащий ген нейротрофического фактора GDNF был встроен в вектор рEGFP-N1 по сайтам рестрикции XhoI/BamHI. Ген был встроен в рамку считывания зеленого флуоресцентного белка GFP.
Полученная конструкция pre-pro-GDNF/ рEGFP-N1 была проверена методами рестриктного анализа и секвенирования. В результате получен химерный ген pre-pro-GDNF/GFP (1389пн) под контролем CMV (цитомегаловирусного) промотора. Аналогичным образом при использовании метода ПЦР амплификации с определенными праймерами были получены фрагменты mGDNF, pre-GDNF, pro-GDNF. Данные фрагменты были встроены в вектор pGEM Easy с последующим переклонированием в вектор pEGFP-N1 по сайтам рестрикции HindIII / BamHI, XhoI/BamHI, XhoI/BamHI соответственно. В результате были получены химерные гены mGDNF/GFP (1158пн), pre-GDNF/GFP (1215пн) и pro-GDNF/GFP (1335 пн). (Рисунок.8).
Таким образом, первая конструкция содержала ген pre-pro-GDNF. Вторая - pro-GDNF, с делетированной pre-областью. Третья конструкция содержала pre-GDNF, где была исключена pro-область, и добавлен новый старт-кодон с примыкающей последовательностью Kozak – CCACCATG. Четвертая конструкция была получена с использованием mGDNF, в которой исключены pre- pro- области и добавлен новый старт-кодон с примыкающей последовательностью Kozak – CCACCATG.
Правильность конструкций была подтверждена методами рестриктного анализа, а также сиквенированием с использованием универсальных праймеров M13 (обратный) и M13 (прямой). Каждая из конструкций была трансфецирована в клетки линии НЕК293 и получены устойчивые трансгенные культуры.
Трансфекция проводилась с использованием реагента ExGene 500, с последующей селекцией трансфецированных клонов на антибиотике гиницитине G418. В ходе получения трансгенных культур было обнаружено, что трансгенная клеточная культура HEK293/pre-pro-GDNF/GFP не дает свечения фьюжн зеленого флуоресцентного белка GFP на С-конце. При этом остальные трансгенные клеточные линии: HEK293/mGDNF/GFP, HEK293/pre-GDNF/GFP, HEK293/prо-GDNF/GFP, такое свечение обнаруживают. С помощью цитофлуориметра была проведена оценка интенсивности визуально невидимого свечения HEK293/pre-pro-GDNF/GFP и наиболее светящейся культуры HEK293/mGDNF/GFP. На рисунке 9А представлены результаты исследования. Было обнаружено, что культура клеток подверженная трансфекции плазмидной ДНК, содержащей ген pre-pro-GDNF с фьюжн GFP дает только 7% позитивного окрашивания GFP трансгенных клеток, тогда как культура клеток, содержащая в своем составе mGDNF с fusion GFP дает 46% GFP трансгенных клеток. На рисунке 9 Б представлены результаты визуализации свечения в культуре.
Итак, трансгенные клетки, содержащие pre-pro-GDNF/рEGFP-N1 экспрессируют фьюжн белок GDNF/GFP с активным GDNF, и не визуализируемым GFP. Экспрессию химерных белков в трансфецированных клетках мы подтвердили с помощью Вестерн-блот гибридизации с использованием антител как к GFP, так и к GDNF. При использовании антител к GFP, был подтвержден результат, полученный при визуальном анализе. Гибридизация отсутствовала с pre-pro-GDNF/GFP, в то время, как остальные химерные белки гибридизовались с антителами к GFP. (Рисунок 10).
Положительным контролем служил экстракт из мозга трансгенной по GFP гену мыши, отрицательным контролем служила гибридизация с клеточным лизатом нетрасфецированных клеток НЕК293. Далее клетки НЕК293, продуцирующие трансгенные fusion белки были проанализированы методом Вестерн-блот гибридизации с использованием антител к GDNF. Было обнаружено, что все конструкции синтезируют химерные белки GDNF/GFP. Следует отметить, что во всех экспериментах pre-GDNF/GFP синтезировался значительно менее интенсивно по сравнению со всеми остальными фьюжин белками. Также нужно обратить внимание, что подвижнорсть pre-pro-GDNF соответствовала подвижности фьюжн белка pre-pro- GDNF/GFP (рисунок 11).
На основании полученных данных можно сделать следующие выводы. Во-первых, у полученных модификаций GDNF/GFP, у которых удалены либо pro-область, либо prе-область, либо обе эти области одновременно, не выявлялось нарушений секреции фактора из трансфицированных клеток в среду. Следует обратить внимание, что даже удаление prе-области, которая кодирует сигнальную последовательность белка не мешает транспорту химерного белка из клетки в среду. Во-вторых, при исследовании клеток с химерным белком полноценного prе-pro-GDNF с GFP обнаруживалось нарушение флуоресцентного свечения GFP. При анализе этого белка Вестерн-блот гибридизацией было показано, что химерный белок присутствовал в ожидаемом размере (prе-pro-GDNF + GFP), но отсутствовала гибридизация с антителами к GFP. Попадая в аппарат Гольджи GFP- «хвост» вероятнее всего подвергается гликозилированию. Подобные эффекты были описаны в работах Huang и Li с соавторами. (Huang et al.,2005; Li et al., 2002)
Для исследований способности химерных белков стимулировать нейральную дифференцировку использовали три клеточные модели: цельный эмбриональный спинальный ганглий крысы, диссоциированный эмбриональный спинальный ганглий крысы и клетки феохромоцитомы крысы РС12. Для анализа использовалась кондиционная среда, полученная после культивирования трансгенных клеток НЕК293, содержащая равные концентрации химерных белков. Отрицательным контролем служила кондиционная среда, полученная после культивации трансгенных клеток НЕК293 с GFP. Для определения концентрации химерных белков в кондиционных средах использовалась Вестерн-блот гибридизация с антителами против GDNF и метод ELISA.
Было показано, что при культивации трансгенных клеток НЕК293, хGDNF/GFP секретируется в среду. Интенсивность секреции mGDNF/GFP значительно превышала секрецию полноразмерного продукта рre-рro-GDNF/GFP (рисунок 13). Кроме того, можно утверждать, что количество mGDNF в кондиционной среде значительно превышает количество полноразмерного продукта pre-pro-GDNF/GFP. Различия в результатах экспериментов достоверны.
Изучение фактора GDNF под контролем регулируемого промотора hsp70 Drosophila melanogaster
Исследованиям такого контролируемого продуцирования фактора и посвящена вторая часть диссертации.
Необходимо было изучить возможность «включать» и «выключать» синтез GDNF в трансплантированных клетках. Это достаточно легко удается сделать в культуральных условиях, но гораздо сложнее in vivo. В нашей работе выбрана наиболее «мягкая» система регуляции трансгена с помощью температурозависимого промотора гена белка теплового шока Drosophila. Данный этап работы представляет собой подбор системы регуляции трансгена. Система, характеризуется свойствами промотора hsp70 Drosophila melanogaster, такими как: реагировать на температуру выше 28-300С и активировать при этом сцепленный с ним ген. Корочкиным Л.И. было выдвинуто предположение, что такая система может быть очень удобна для использования в клеточной терапии, так как температура тела млекопитающих и человека является автоматическим стимулятором промотора белка теплового шока дрозофилы (Корочкин, 2000). Однако в дальнейшем было показано, что промотор hsp70 Drosophila melanogaster в организме млекопитающих активируется при более низкой температуре. И встал вопрос изучения тонкой регуляции активации данного промотора в клетках млекопитающих.
Были синтезированы два вектора, которые имеют две разные области регуляции промотора. Один из векторов включает в своем составе +100 пар нуклеотидов перед промотором (В7), а другой +500 (F7), соответственно. (Рисунок 27). Данные вектора отличаются лишь количеством элементов теплового шока HSE, необходимых для активации данного промотора. Данные вектора, содержат ген флуоресцентного белка GFP, который будет выступать в качестве маркера, а также ген неомицина, что позволит производить селекцию трансфецированных клеток на G418. Данные фрагменты были переклонированы в вектор pEGFP-N1, по сайтам рестрикции HindIII-EcoRI. Наличие вставки в данных конструкциях были проверены с помощью рестрикционого анализа, с последующим секвенированием полученных конструкций (рисунок 29).
После выделения и очистки эти конструкции были трансфецированы в клетки НЕК293 с использованием реагента ExGene 500.
При анализе тотальной ДНК трансгенных клеток методом ПЦР было подтверждено наличие гена GFP в геноме трансгенных клеточных линий HEK293. Для метода ПЦР использованием праймеров. Также наличие GFP белка было подтверждено Вестерн-блоттингом. Из трансгенной клеточной культуры, подвергшейся температурному воздествию, был выделен белок в SDS буфере, данные белки были разогнаны в 10% акриламидном геле и проанализированы с помощью Вестерн-блот гибридизации. Использовались поликлональные антитела: anti-GFP и вторичные антитела anti-Rabbit, конъюгированные с пероксидазой хрена. Детекция белков осуществлялась при помощи реагента ECL на пероксидазу. Доказано, наличие конструкта в клетках (рисунок 30).
Для культивирования НЕК293 использовалась стандартная среда ДМЕМ инкубация проводилась при 370С в СО2 инкубаторе. Культуры клеток после трансфекции исследуемыми векторами и селекции на гиницитине (G418), в течение 10 дней были рассеяны на культуральные чашки. После 24 часов культивирования анализировали воздействие температуры на культуру клеток. Клетки прогревали в инкубаторе при температурах в диапазоне от 370до 42 0С в течение 60 минут. Экспрессию маркерного белка GFP наблюдали с помощью флуоресцентного микроскопа Olympus. (Рисунок 32).
Было замечено, что в клетках, которые содержат вектор F7 (8 HSE + hsp70), свечение белка GFP было более интенсивное и продолжительное (рисунок 31).
Было обнаружено, что максимальная экспрессия белка GFP наблюдалась при 420С уже спустя 24 часа после прогрева при использовании вектора с 8 последовательностями HSE перед промотором hsp70. Однако следует отметить, что значительная интенсивность свечения наблюдалась и при повышении температуры воздействия до 400С при использовании трансгенной культуры НЕК293 с вектором имеющим 8 HSE областей регуляции. Часть исследуемых клеток, после воздействия температуры, были зафиксированы в 4% растворе параформальдегида и использовались для измерения интенсивности свечения при помощи метода проточной цитофлуориметрии на приборе FACScan (рисунок 32). Данные приведены для температур 40 и 420С с различным интервалом (24 и 48 часов) после температурного воздействия.
Культуры, не подвергающиеся воздействию теплового шока (370C), были использованы в качестве контроля. Доля GFP-позитивных клеток через 24 и 48 часов после теплового шока при 40 и 420 C значительно (p 0.05) отличались от контроля (370 C).
Данные представляют среднее - SD от трех независимых экспериментов. Значительное увеличение доли GFP-положительных клеток в культуре HEK293/B7/GFP наблюдалась только через 48 ч после теплового шока (p 0.05), как представлено на рисунке 33. B то время, как клетки HEK293/F7/GFP активно флуоресцировали уже и через 24 часа как после воздействия температуры в 400C, так и в 420C. Обнаруженный эффект потребовал провести эксперимент с более точной шкалой температурного воздействия. Таким образом, была проанализирована эффективность воздействия на активацию промотора следующих температур: 370C, 380C, 390C, 400C, 410C, 420C.
Было показано, что активация промотора, как при наличии 4 HSE зон, так и при наличии 8 HSE зон наблюдается уже при 380С. Однако интенсивность флуоресценции заметно выше при использовании F7. Было замечено, что при использовании 4-ех HSE перед промотором hsp70 активация промотора в клетках наблюдается при 400С с незначительной интенсивностью (около 10%). При этом падение интенсивности свечения через 48 часов после воздействия было незначительным с 10% до 3%. При воздействии температуры в 420С на трансгенную культуру с В7 обнаруживалось свечение клеток 8,2 %, которое значительно увеличивалось к 48 часам культивирования после температурного воздействия до 23,4%. Таким образом, 4-ех HSE практически «подчиняют» промотор hsp70 Drosophila melanogaster «законам» клеток млекопитающих.
Значительно большую интенсивность мы наблюдали после температурного воздействия на трансгенные клетки, содержащие вектор F7 с 8 последовательностями HSE перед промотором. Увеличение количества HSE зон перед промотором увеличивало интенсивность флуоресценции GFP при температуре в 380С до 15% и эта интенсивность не падала через 48 часов. При температуре в 400С флуоресценция резко увеличивалась до 23,2% и незначительно изменялась через 48 часов (22,1%). Процент светящихся клеток при воздействии температуры в 420С тоже значительно увеличивался и достигал 49,9% через 24 часа и незначительно падал до 47,4% через 48 часов после воздействия (рисунок 33). Таким образом, увеличение количества HSE областей перед промотором hsp70 значительно усиливает его активность и интенсивность ответа на температурное воздействие.
После 72 часов наблюдается уменьшение синтеза белка GFР. Однако при повторном нагревании, наблюдается вторичное активация синтеза белка.
Данная система активации температурно-зависимого промотора работает в культуре клеток НЕК293. Установлено, что оптимальное время действия температурной активации составляет 60 минут, а максимальное свечение зеленого флуоресцентного белка GFP наблюдается с 24 часа до 48 часов после воздействия температуры. Был выявлен эффект повторного включения промотора и возникновения свечения зеленого флуоресцентного белка после повторного воздействия температуры.
На основании данных векторов и для регулирования трансгена нами были созданы генно-инженерные конструкции, содержащие ген нейротрофического фактора GDNF под контролем промотора гена белка теплового шока дрозофилы hsp70.
Для клонирования были использованы полученные вектора, которые были описаны выше и ген нейротрофического фактора GDNF. Экспериментальным методом была подобрана замена в pre-области, позволяющая добиваться флуоресценции GFP. Рre область содержала дополнительный нуклеотид G, в N -концевой сигнальной последовательности. Было показано, что рамка считывания, начинающаяся с ATG сигнальной последовательности GDNF, терминируется, тогда как дополнительный ATG в pre-области позволяет получать неизмененную последовательность mGDNF. Таким образом, в белке вместо последовательности MKLWDVVAVCLVLLHTASA (19аа), кодирующей сигнальный пептид, нами была введена последовательность MSWLSAWCCSTPRPP (15аа). Структура зрелого GDNF нарушена не была. Полученная конструкция с GDNF, содержащая вышеописанную замену, была проанализирована в культуре эмбриональной почки человека HEK293. Далее для клонирования были использованы следующие праймеры: Т3 (5 -attaaccctcactaaaggga- 3 ) и GDNF-BamHI (5 ggatcccagatacatccacaccttttagcgg - 3 ). Фрагмент был встроен в вектор pGEM Easy. Наличие вставки в конструкции pGEM/GDNF было проверено с помощью метода рестрикции по сайту EcoRI, а также методом ПЦР и секвенированием.
Из данной конструкции был вырезан ген нейротрофического фактора GDNF по сайтам рестрикции EcoRV-BamHI (600bp) и встроен в вектора B7 и F7 по сайтам рестрикции SmaI/ BamHI. Наличие вставки в данных конструкциях было проверено с помощью рестриктного анализа по различным сайтам, в том числе по сайтам клонирования методом ПЦР с праймерами GDNF-F (5 -ggaatcggcaggctgcagctg-3 ) и GFP R (5 -aataaagcttgcatggcggtaatacg - 3 ) (рисунок 34).