Генетическая характеристика штаммов вируса Западного Нила Прилипов Алексей Геннадьевич

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Обзор литературы .22

1.1. Экология, эпидемиология и географическое распространение вируса Западного Нила 22

1.1.1. Экология вируса Западного Нила 22

1.1.2. Эпидемиология вируса Западного Нила 22

1.1.3. Географическое распространение вируса Западного Нила 28

1.2. Филогенетический анализ вируса Западного Нила, его происхождение и эволюция 30

1.2.1. Происхождение и эволюция вируса Западного Нила 30

1.2.2. Молекулярная эволюция ВЗН 34

1.2.3. Генотипы вируса Западного Нила 43

1.3. Генетическая организация и репликативный цикл флавивирусов .44

1.3.1. Общее строение вирусного генома 44

1.3.2. Трансляция вирусного генома 47

1.3.3. Процессинг и биологические функции неструктурных белков 48

1.3.4. Репликация вирусного генома 50

1.3.5. Образование зрелых структурных белков и сборка вириона

1.4. Генетические факторы патогенности ВЗН 53

1.5. Разработка вакцин к вирусу Западного Нила

1.5.1. Требования к вакцине против вируса ЗН 59

1.5.2. Ветеринарные вакцины против вируса Западного Нила .61

1.5.3. Вакцины против вируса Западного Нила для человека 62

1.5.4. Вакцины, проходящие клинические испытания .62

1.5.5. Вакцины, на стадии доклинической разработки

1.5.5.1. Субъединичные вакцины 64

1.5.5.2. ДНК-вакцины 66

1.5.5.3. Нерепликативные вакцины одного цикла .67

1.5.5.4. Инактивированные вирусные вакцины .67

1.5.5.5. Рекомбинантные вакцины на основе вирусных векторов...69

1.5.5.6. Химерные вакцины .69

1.5.5.7. Живые аттеньюированные вакцины, полученные из инфекционных клонов .70

1.5.5.8. Кандидаты в вакцины против ВЗН на базе рекомбинантной вакцины против кори 72

1.5.5.9. Вакцина MVSchw-sEwnv 73

Собственные исследования

Глава 2. Материалы и методы 75

2.1. Места сбора и объем полевого материала .75

2.2. Методы сбора, транспортировки, хранения и подготовки полевых материалов 79

2.3. Вирусологическое обследование 79

2.4. Штаммы, олигонуклеотиды и нуклеотидные последовательности ВЗН, использованные в работе .80

2.5. Компьютерный анализ последовательностей ДНК 87

2.6. Выделение РНК .87

2.7. Реакция обратной транскрипции .88

2.8. Проведение полимеразной цепной реакции 88

2.9. Клонирование кДНК-фрагментов генома 89

2.10. Приготовление компетентных клеток .89

2.11. Трансформация плазмидной ДНК 89

2.12. Электрофорез ДНК в агарозном геле 90

2.13. Выделение фрагментов ДНК из агарозы 90

2.14. Секвенирование ДНК 91

2.15. Сайт-направленный мутагенез ДНК 91

Глава 3. Результаты 93

3.1. Определение и анализ первичной структуры генома штаммов ВЗН, изолированных до 2001 г 93

3.1.1. Стратегия подбора первой пары праймеров для проведения ПЦР 94

3.1.2. Определение и анализ первичной структуры части генома штаммов ВЗН от 5 -конца до праймера 3594Runi 97

3.1.3. Определение и анализ первичной структуры генома штаммов ВЗН генотипа 1 101

3.1.4. Определение и анализ первичной структуры генома штаммов ВЗН генотипов 2,4 и 5 .106

3.1.5. Определение и анализ 5 -концевых последовательностей геномов штаммов ВЗН

3.2. Определение и анализ первичной структуры генома штаммов ВЗН, изолированных после 2001 г 107

3.3. ОТ-ПЦР тест система для обнаружения РНК вируса ЗН 1 3.3.1. Создание ОТ-ПЦР тест системы для обнаружения РНК вируса ЗН в клинических образцах и пробах полевого материала .108

3.3.2. Разработка параметров проведения ПЦР для первого и второго раундов амплификации 113

3.3.3. Определение чувствительности ОТ-ПЦР тест системы 117

3.3.4. Проверка работы ОТ-ПЦР тест-системы на различных генотипах вируса ЗН 121

3.4. Исследование полевого материала 122

3.4.1. Исследование комаров и клещей Астраханской области на наличие вируса ЗН при помощи ОТ-ПЦР системы 122

3.4.2. Анализ зараженности видового состава комаров .124

3.4.3. Анализ положительных проб для определения генотипа вируса при помощи определения частичной нуклеотидной последовательности .128 3.4.4. Статистическая обработка результатов .129 3.5. Клонирование кДНК-копии генома вируса Западного Нила 131

3.5.1. Получение плазмид, несущих кДНК-фрагменты вирусной РНК 131

3.5.2. Транскрипция РНК in vitro 132

Глава 4. Обсуждение результатов 134

4.1. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей штаммов ВЗН 134

4.1.1. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей штаммов ВЗН первого генотипа 134

4.1.2. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей штаммов ВЗН первого генотипа, выделенных после 1999 г 139

4.1.3. Анализ штамма 322 2-го генотипа 143

4.1.4. Анализ штамма Ksnd190 4-го генотипа 148

4.1.5. Анализ штамма Ig2266 5-го генотипа 1 4.2. Анализ генетических детерминант патогенности ВЗН .152

4.3. ОТ-ПЦР тест-система для обнаружения РНК ВЗН 155

4.4. Исследование комаров и клещей Астраханской области на наличие ВЗН при помощи ОТ-ПЦР системы .156

4.5. Клонирование кДНК-копии генома вируса Западного Нила 157

4.6. Значимость полученных данных о нуклеотидных последовательностях ВЗН, заложенных в базу данных .158 ВЫВОДЫ 161

Благодарности 163

Список цитируемой литературы

• Филогенетический анализ вируса Западного Нила, его происхождение и эволюция
• Штаммы, олигонуклеотиды и нуклеотидные последовательности ВЗН, использованные в работе
• Определение и анализ первичной структуры генома штаммов ВЗН, изолированных после 2001 г
• Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей штаммов ВЗН первого генотипа, выделенных после 1999 г

Введение к работе

Актуальность проблемы

Арбовирусы – это экологическая группа вирусов, передающихся восприимчивым позвоночным через укусы кровососущих членистоногих: комаров, клещей, москитов, мошек и мокрецов. Такие арбовирусные инфекции, как лихорадка денге, жёлтая лихорадка, энцефалиты – японский, клещевой, Сент-Луис, лихорадка Западного Нила, и другие – далеко не полный перечень опасных для человека арбовирусных инфекций, представляющих огромное значение для здравоохранения в эндемичных регионах мира.

Вирус Западного Нила приобрел особую значимость после ряда крупных эпидемических вспышек, произошедших в конце 1990-х годов в различных частях света и характеризующихся необычно частыми, для данной инфекции, случаями поражения ЦНС и высокой смертностью. В 1994 году произошла вспышка в Алжире, в ходе которой было зарегистрировано около 50 случаев заболевания с 8 летальными исходами. Последующая вспышка ЛЗН была зарегистрирована в Румынии в 1996 году, где также наблюдался необычно высокий (~9%) уровень смертности. В 1997 году на гусиных фермах в Израиле случилась крупная эпизоотия ЛЗН с острыми неврологическими проявлениями. Среди людей эпидемия случилась в 2000 году, хотя еще в 1999 году было отмечено два смертельных случая заболевания ЛЗН. В общей сложности в 2000 году в Израиле было зарегистрировано 417 подтвержденных случаев заболевания ЛЗН, причем в половине случаев с поражениями ЦНС. Уровень смертности при этом составлял, по разным данным, от 8 до 14 %. В 1999 году почти одновременно эпидемические вспышки ЛЗН произошли на юге России и в Нью-Йорке, США, при сходном (~ 10%) уровне летальности.

Вопрос, чем обусловлено серьезное изменение характера патогенности эпидемических вспышек, вызванных в последнее время вируса Западного Нила, остается открытым. Сравнительный и эволюционный анализ первичной структуры геномов различных изолятов ВЗН, поиск и изучение генетических

детерминант вируса, отвечающих за его патогенные свойства, являются в настоящее время предметом интенсивных исследований.

Степень разработанности темы исследования

В работе научно обоснованы и практически реализованы результаты исследований, которые создают базу для дальнейшего изучения ВЗН. Созданы системы для проведения исследований по выявлению РНК ВЗН в пробах комаров и клещей, оптимизированы подходы по определению полных последовательностей генома для ВЗН различных генотипов, проанализирован состав штаммов ВЗН, распространенных как на территории РФ, так и в мире. Внесен существенный вклад в понимание вариабельности штаммов ВЗН и филогенетические взаимоотношения различных генотипов вируса. Решены некоторые фундаментальные и прикладные вопросы, имеющие важное значение для охраны здоровья населения страны.

Цель исследования

Характеристика, изучение генетических свойств и анализ детерминант патогенности штаммов ВЗН, циркулирующих на эндемичной территории юга России, а также исторических штаммов, находящихся в Государственной коллекции института вирусологии им. Д.И.Ивановского.

Для выполнения этих целей были поставлены следующие задачи:

1. Установить первичную структуру геномов 9 исторических штаммов вируса Западного Нила из Государственной коллекции вирусов института вирусологии им. Д.И.Ивановского.

2. Установить первичную структуру геномов 22 штаммов вируса Западного Нила, изолированных в 1999-2005 гг. на территории Астраханской и Волгоградской областей.

3. Определить принадлежность исследуемых штаммов ВЗН к известным генотипам этого вируса, а в случае выявления вирусов, не принадлежащих к уже известным генотипам, охарактеризовать новые генотипы и предложить среди исследованных штаммов топотипные варианты ВЗН.

4. Разработать оптимальную схему для определения полной первичной структуры генома для вирусов ВЗН субгенотипа 1а.

5. Создать тест-систему на основе ОТ-ПЦР, позволяющую проводить идентификацию РНК ВЗН в пробах членистоногих переносчиков.

6. Охарактеризовать генетические свойства вирусной популяции, циркулировавшей на территории Астраханской области в 2001-2005 гг.

7. Разработать экспериментальную систему для изучения биологических свойств ВЗН методом обратной генетики на основе низкопатогенного штамма.

Научная новизна

В данной работе впервые была определена полная нуклеотидная последовательность генома для 31 штамма ВЗН, в том числе для 24 штаммов, изолированных в России. Это составляет до настоящего времени 45% данных для Евразии и более 82% данных для России. Впервые, на основании полной последовательности генома вируса была показана принадлежность индийского штамма Ig2266 к новому генотипу 5, что в дальнейшем было подтверждено работами исследователей из Индии. Впервые, была показана принадлежность и штамма Krnd88-190 к новому генотипу 4, не известному до настоящей работы, что также было подтверждено позднее работами других исследователей.

Впервые была получена молекулярно-генетическая характеристика данных штаммов, включающая в себя анализ их нуклеотидных и аминокислотных последовательностей, а также поиск известных функциональных детерминант вируса, отвечающих за его патогенные свойства.

В данной работе были предложены оптимизированные стратегии работы для получения полных последовательностей генома для ВЗН субгенотипа 1а, проведен анализ использования большого количества олигонуклеотидных праймеров с точки зрения их эффективности для проведения ПЦР и секвенирования.

Клонирована кДНК копия полного генома вируса Западного Нила, относящегося к IV генотипу на основе низкопатогенного штамма LEIV-Krnd88-190. Создана экспериментальная система для получения вирусной РНК in vitro.

Практическое значение

Разработана система ОТ-ПЦР для детекции РНК ВЗН в пробах полевого материала и продемонстрирована её эффективность и специфичность при работе с пулами комаров и клещей. Проанализирован генотипический состав ВЗН из членистоногих переносчиков в Астраханской области в 2001-2005 гг. Проанализирован процентный состав зараженности для различных видов комаров в Астраханской области в 2001-2005 гг.

Клонирована кДНК копия полного генома вируса Западного Нила, относящегося к IV генотипу на основе низкопатогенного штамма LEIV-Krnd88-190. Создана экспериментальная система для получения вирусной РНК in vitro.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Установлена полная нуклеотидная последовательность геномов 31 штамма ВЗН. Для 28 штаммов ВЗН показана принадлежность к субгенотипу 1a и для одного штамма к генотипу 2.

2. На основании сравнительного анализа полных нуклеотидных последовательностей геномов штамм вируса Krnd88-190 предложено отнести к новому генотипу 4.

3. На основании сравнительного анализа полных нуклеотидных последовательностей геномов штамм вируса Ig2266 предложено отнести к новому генотипу 5.

4. Проведена молекулярно-генетическая характеристика данных штаммов, включающая в себя анализ их нуклеотидных и аминокислотных последовательностей, а также поиск известных функциональных детерминант вируса, отвечающих за его патогенные свойства.

5. Создана ОТ-ПЦР тест система для определения РНК ВЗН, данная система показала высокую специфичность и чувствительность при работе с пробами пулов комаров и клещей.

6. Создана экспериментальная система для транскрипции вирусной РНК in vitro на основе бактериальной высококопийной плазмиды, несущей полноразмерную кДНК копию вирусного генома.

Личный вклад соискателя

Основные результаты диссертационной работы получены лично. Некоторые разделы выполнены при участии сотрудников лаборатории молекулярной генетики ФГБУ "НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского".

Внедрение результатов исследований в практику

Разработанная тест – система для детекции РНК ВЗН защищена патентом РФ №2199589 от 27.02.2003 г.

Апробация диссертации

Апробация диссертации состоялась на заседании Совета по предварительной экспертизе диссертационных работ ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского» Министерства здравоохранения РФ 17 июня 2015 г.

Публикации

Основные результаты диссертационной работы отражены в печати, в том числе, в 14 статьях в отечественных рецензируемых журналах, входящих в Перечень, рекомендованный ВАК, и в двух публикациях в зарубежных журналах, индексируемых в международных системах цитирования (библиографические базы - Web of Science, Scopus, PubMed). Материалы диссертации были так же представлены в виде тезисов на конференциях, в том числе 6 международных.

Объем и структура диссертации

Филогенетический анализ вируса Западного Нила, его происхождение и эволюция

Первоначальные исследования, в которых использовались различные серологические методики, позволили выделить несколько обособленных групп вируса. На основании этих исследований штаммы ВЗН были разделены в две большие серогруппы: африканскую (топотипный штамм Eg101, выделенный в Египте) и индийскую (топотипный штамм Ig2266 из Юго-Восточной Индии). К африканской серогруппе относятся штаммы, выделенные в Северной, Восточой и Центральной Африке, Средней Азии, все штаммы выделенные в Европе. К этой же серогруппе относятся почти все изоляты из Южной Африки и с острова Мадагаскар. К индийской серогруппе относят штаммы изолированные в различных частях Индии, часть изолятов из Южной Африки и с острова Мадагаскар [11].

Секвенирование и анализ последовательностей генома различных изолятов позволили получить значительно более полную картину межштаммовых филогенетических отношений. Следует заметить, что ко времени начала эпидемии ЛЗН в США (1999 г.) в международной базе данных имелась всего одна полная нуклеотидная последовательность генома ВЗН: последовательность вируса генотипа II. Кроме того, была доступна полная нуклеотидная последовательность генома вируса Кунджин, который к тому времени считался самостоятельным вирусом, хотя и родственным ВЗН. Эта ситуация привела к значительным трудностям при первичном определении принадлежности вируса, вызвавшего эпидемическую вспышку 1999 г. в США. Фактически, только последовательность штамма, изолированного в Нью-Йорке в 1999 г., явилась первой полной последовательностью генома для генотипа 1, который является наиболее распространенным и ответственен за наибольшее количество эпидемических вспышек.

Одной из первых и основополагающих стала работа F. Berthet с соавт. [53]. Сравнительное исследование было построено на анализе нуклеотидной последовательности части гена оболочечного белка Е (участок, кодирующий приблизительно от 150-ой по 250-ую а.к. от N-конца белка). Данный регион характеризуется высокой вариабельностью, что связано с формированием ряда антигенных детерминант. Кроме того, в этой области находится единственный для данного белка потенциальный сайт гликозилирования, который у некоторых штаммов может быть изменен или делетирован. В результате, изоляты (в работе использовался 21 штамм) были разделены в две группы, с дивергенцией между группами до 29%. Гомология между штаммами внутри групп составляла минимум 87% для I группы и 80,5% для II-ой. Подобная классификация на основе сравнения небольшой части гена Е оказалась весьма удачной, и, как показали дальнейшие исследования, соответствует наиболее достоверному сравнительному анализу полноразмерных последовательностей генома. В тоже время, в описываемой работе не использовалась частичная нуклеотидная последовательность индийского изолята Ig2266, доступная для анализа к этому времени.

В последующих работах число штаммов ВЗН, используемых для анализа, значительно возросло и подобное разделение на две группы стало общепринятым. Важную роль сыграли работы J.Scherret [295, 296], в которых данные о филогенетических взаимоотношениях штаммов ВЗН были в значительной мере обобщены и структурированы. Помимо прочего, в этих работах было показано, что вирус Кунджин является австралийским субтипом ВЗН. К группе I относят штаммы, выделенные в США, Европе, Среднем Востоке, Центральной, Северной и Западной Африке. Отметим, что к этой группе отнесены штаммы, вызвавшие все крупные эпидемии последних лет в Израиле, Румынии, России и США. К этой же группе относят австралийские изоляты Кунджин и изоляты из Индии. Группа II включает в себя вирусы из Центральной, Восточной и Западной Африки и с острова Мадагаскар [53, 76, 180, 295].

Отнесение индийских изолятов к первой группе, а затем попытка вынести их в субгенотип 1с явились артефактом анализа по небольшому участку последовательности, так как при дальнейших исследованиях и сравнении была доказана принадлежность их к самостоятельному генотипу ВЗН.

В 2002 г. была опубликована работа по анализу последовательности штамма Krsn190, выделенного в 1988 г. на территории Краснодарской области. Его не удалось классифицировать ни в одну группу, т.к. степень его дивергенции по нуклеотидной последовательности открытой рамки считывания составляет приблизительно 30% от штаммов I-ой, II-ой и индийской групп. Подобная проблема возникла и в работе J.Scherret [296]. Для двух штаммов из Сенегала и Индонезии вопрос о групповой принадлежности решить не удалось.

В 1997 г. на территории Моравии был выделен штамм ВЗН, сильно филогенетически удаленный от всех генотипов, известных к тому времени. Авторы Bakonyi с соавт. предложили после проведенного к 2005 г. анализа, вынести штамм Rabensburg (97-103) в отдельный генотип ВЗН [40].

В итоге, к 2007 г. сложилось разделение ВЗН на 5 основных генотипов (lineage): генотип 1 – самый широко распространенный, ответственный за наибольшее количество эпидемических вспышек, подразделяемый на два субгенотипа (clade) (1а и 1 b - ранее австралийский вирус Кунджин); генотип 2 - менее распространенный вариант, но доказано ответственный за некоторое количество эпидемических вспышек; генотипы 3 и 4 (Rabensburg (97-103) и Krsn190 соответственно), представленные фактически каждый одним известным топотипным штаммом и генотип 5, влючающий изоляты ВЗН из Индии. Филогенетическое древо (из работы Bondre и др. [60]) представлено на рис.1. Не исключено, что в будущем число филогенетических групп вируса ЗН, по мере новых исследований будет расширено.

Штаммы, олигонуклеотиды и нуклеотидные последовательности ВЗН, использованные в работе

Несмотря на то, что около 80% заболеваний ЛЗН протекает асимптоматично, у пациентов могут развиваться такие клинические проявления, как лихорадка, головная боль, слабость, боли и, иногда, покраснение кожи. По данным центра по контролю и предотвращению заболеваний США (CDC), менее чем у 1% инфицированных людей развиваются тяжелые нейроинвазивные заболевания, такие как, энцефалит, менингит и синдром напоминающий полиомиелит, однако около 10% таких случаев являются фатальными для пациентов. За рекордный по заболеваемости 2003 г. в США было зарегистрировано более 9000 случаев заболевания ЛЗН, среди которых 265 случаев с летальным исходом.

За последние 15 лет произошло увеличение количества эпидемических вспышек с большим количеством человеческих жертв, вызванных ВЗН, что связано с повышением нейроинвазивности циркулирующих штаммов. Так или иначе, до последнего времени, большинство случаев были спорадическими. В 2012 г. в США произошла вторая сильнейшая вспышка ЛЗН с 5387 зарегистрированными случаями заболевания и, в том числе, с 243 летальными исходами. Треть всех случаев была в штате Техас. В том же году, случаи ЛЗН были зарегистрированы в Италии, Израиле, России, Сербии, Тунисе и Греции (общее количество - 167 случаев) [35].

Последние вспышки ЛЗН характеризуются увеличением пропорции неврологических симптомов у людей и лошадей [38]. Несмотря на то, что в настоящее время существуют коммерческие ветеринарные вакцины для лошадей [47], нет вакцин для защиты людей от ЛЗН [31]. Основным препятствием для их создания является тот факт, что фармацевтические компании заявляют об ограниченности рынка для такой вакцины и о непредсказуемости эпидемических вспышек, что делает крайне затруднительным прогнозирование применения такой вакцины, в случае её создания.

Вакцина против вируса ЗН должна защищать от всех генотипов вируса, а не только от генотипа 1а, что стало особенно очевидно после вспышки нейроинвазивного штамма генотипа 2 в Европе. Последние испытания вакцины Recombiteck canarypox, содержащей в своем составе премембранный и оболочечный белки (PrM/E) генотипа 1а показали её перекрестную защиту и против патогенных штаммов генотипа 2 [211], и кроме того, вакцины, произведенные на база генотипа 2 продемонстрировали защиту, как против гомологичных, так и гетерологичных штаммов вируса [214].

Наибольшему риску заболевания ЛЗН подвержены пожилые люди и люди с нарушением иммунитета. Таким образом, необходимо разработать вакцину к ВЗН, хотя бы для того, чтобы обеспечить защиту этих групп населения. Уровень защиты вакцин к флавивирусам коррелирует с уровнем индукции нейтрализующих антител, что было показано на вакцинах к вирусам желтой лихорадки, японского и клещевого энцефалитов [142]. Белок оболочки вируса (Е) является основной целью для вируснейтрализующих антител, и, таким образом, является основным для выработки защитного иммунитета против флавивирусов [142]. Кристаллическая структура белка Е ВЗН выявила, что он состоит из трех эктодоменов: домен I (EDI), домен II (EDII) и домен III (EDIII) [159, 244], что ранее также было показано для вируса Денге [225, 226, 238] и вируса клещевого энцефалита [274]. Центральный EDII домен содержит иммунодоминантные эпитопы рядом с соединительной петлей [317]. Эти эпитопы стимулируют выработку кросс-реактивных субнейтрализующих антител, которые могут увеличить риск антител-зависимого усиления в клетках несущих Fc рецепторы, после флавивирусной инфекции, что может привести к осложнению протекания болезни [316]. С другой стороны, иммуноглобулиноподобный С-конец домена EDIII, последовательность из 100 ак, стабилизированная дисульфидным мостиком, вовлечена в процесс прикрепления вируса к рецептору и содержит критические нейтрализующие эпитопы, ответственные за прикрепление и дальнейшие этапы проникновения вируса в клетку [111, 261].

Последние исследования, направленные на характеристику гуморального иммунного ответа, запускаемого инфекцией флавивирусов, и работы по картированию эпитопов моноклональных антител приматов показали, что нейтрализующие эпитопы, не содержащиеся в домене EDIII расположены в междоменных регионах белков оболочки флавивирусов. Были также описаны сложные экспонированные эпитопы к четвертичной структуре белка оболочки [340]. Эти эпитопы, существующие в интактных вирионах, но отсутствующие в растворимом рекомбинантном белке Е, состоят из ак, которые взаимодействуют с обоими мономерами в димере белка Е в районе между EDI и EDII [107, 165]. Антитела к этим эпитопам нейтрализуют вирус на этапе после прикрепления вируса, вероятнее всего, препятствуя образованию тримера белка, котрое необходимо для слияния с эндосомами [333]. С другой стороны, сильные нейтрализующие эпитопы, глубоко погруженные в структуру белка Е, вероятно доступны в зависимости от температуры, это подтверждает, что структура белка Е является не такой жесткой, как предполагалось ранее [197].

В настоящее время доступны несколько ветеринарных вакцин против вируса ЗН (таблица №2). Две из них представляют из себя вакцины, содержащие инактивированный вирус: West Nile Innovator (инактивированный формалином вирус) – вакцина, разработанная Fort Dodge Animal Health и коммерциализованная фирмой Pfizer [239]; Vetera vaccine (Boehringer Ingelheim). Производство вакцины West Nile Innovator, одобренной в 2005 г., к настоящему времени прекращено. Доступна рекомбинантная вакцина на основе вируса оспы канареек, содержащая экспрессированные премебранный (PrM) и оболочечный (E) белки штамма NY99 (Recombiteck Equine West Nile Virus Vaccine, Merial-Sanofi Aventis) [34, 115, 161, 287]. Также доступна химерная вакцина, на основе вакцинного штамма вируса желтой лихорадки 17D, в котором белки PrM и Е заменены на аналогичные вируса Западного Нила штамма NY99 (ChimeriVax WN01). Данная вакцина была лицензирована к применению в 2005 г., департаментом сельского хозяйства США (USDA), однако, в 2010 г. несколько серий вакцины были отозваны из продажи после зарегистрированного большого числа случаев анафилактических реакций, респираторных заболеваний и даже смертей. Все три, доступные в настоящее время коммерческие вакцины предполагают двух- или трех- разовую иммунизацию и бустер по истечении года.

Определение и анализ первичной структуры генома штаммов ВЗН, изолированных после 2001 г

Для определения наиболее оптимальных температур отжига праймеров при проведении первого и второго раундов ПЦР были поставлены серии реакций амплификации с градиентом по температуре отжига праймеров на матрице. В качестве матриц использовались кДНК штаммов Ast986 и Krnd88-190, представляющих первый и четвертый генотипы вируса соответственно. Это было сделано в связи с наличием замен в штамме Krnd88-190 в местах посадки праймеров и ожидаемой более низкой температурой, требуемой для отжига на матрице этого штамма.

Определение чувствительности ОТ-ПЦР тест системы Для определения чувствительности ОТ-ПЦР тест системы было проведено титрование штамма LEIV-Ast989 в культуре клеток Vero E6 и параллельное тестирование разведений вируса в ОТ-ПЦР. Титрование вируса проводилось методом бляшек под агаровым покрытием. Результаты этого эксперимента представлены на рис. 28 А, Б, В.

Рисунок 28. Определение чувствительности разработанной ОТ-ПЦР тест – системы (гнездовой). Результаты тестирования в ОТ-ПЦР разведений штамма Ast986 после I-го (А.) и II-го (Б,В) раундов ПЦР. Над лунками указан соответствующий титр вируса.

Как видно на электрофореграмме, после первого раунда ПЦР специфический, положительный ответ детектируется до разведения, соответствующего 103 БОЕ/мл., хотя четкий, хорошо видимый сигнал детектируется до разведения, соответствующего 104 БОЕ/мл. После второго раунда положительный ответ детектируется до разведения, соответствующего 50 БОЕ/мл. Что касается полугнездового варианта, то он продемонстрировал результаты даже хуже, чем однораундовый вариант. До разведения, соответствующего 104 БОЕ/мл. сигнал можно признать удовлетворительным, но при более низких концентрациях матрицы в результате ПЦР нарабатывается набор неспецифических продуктов, образующих характерный «шмер» на электрофореграмме. Данные результаты демонстрируют непригодность полугнездового варианта ОТ-ПЦР тест системы для детектирования низких концентраций РНК вируса в исследуемых образцах, а для более высоких концентраций, очевидно, более приемлим вариант проведения ПЦР в один раунд, так как полугнездовой вариант требует проведения второго раунда, при этом результаты ухудшаются.

Эти данные хорошо согласуются с результатами, полученными при работе с пробами комаров из Астраханской области. На рис.29 представлены результаты проведения гнездового и полугнездового вариантов ПЦР после анализа в агарозном геле.

Сравнение гнездовой (А) и полу-гнездовой (Б) ПЦР тест-систем. При сравнительном анализе электрофорезных гелей можно сделать вывод, что при использовании гнездовой (А) тест-системы значительно сокращается количество неспецифических продуктов амплификации, фрагменты получаются более четкими, что немаловажно при работе с такими объектами, как членистоногие. При анализе членистоногих переносчиков мы сталкиваемся с крайне низким содержанием вирусной РНК и большим количеством неспецифических продуктов амплификации.

Представляло интерес также проверить разработанную тест-систему на способность выявлять РНК ВЗН всех четырех известных к моменту проведения работы генотипах ВЗН. (Рис. 30). Для проведения эксперимента использовали в качестве представителя первого генотипа ВЗН: LEIV-Vlg99-27889-human; второго генотипа вируса ЗН: LEIV-Ukr80-3266-rook; третьего генотипа ВЗН: Ig2266; четвертого генотипа ВЗН: Krnd88-190, титр вируса составлял 100 БОЕ/мл. Как следует из представленных данных, все четыре генотипа детектировались с помощью разработанной ОТ-ПЦР тест-системы.

Таким образом, на данном этапе работы была разработана высоко чувствительная ОТ-ПЦР тест-система для детекции всех четырех генотипов вируса Западного Нила. Определенная нами чувствительность системы как 50 БОЕ/мл является достаточной для исследований, связанных с детекцией ВЗН в биологических образцах. Вместе с этим, универсальность позволяют рассматривать разработанную тест-систему как методический инструмент, который может быть использован и в диагностических целях.

Возникшие в 2001-2004 гг. на юге России вспышки лихорадки Западного Нила (ЛЗН) свидетельствуют о приоритетной значимости проблемы новых и возвращающихся инфекций в системе биобезопасности [11, 12]. Данные по эндемичности территорий по ЛЗН в северной части Каспийского бассейна накапливались на протяжении около 40 лет [3, 4, 5, 26, 27, 28].

Однако эпидемическая вспышка, возникшая в 1999г. отличалась массивной заболеваемостью и высокой смертностью [11, 12]. На основании предшествующих исследований можно предположить, что основным природным очагом инфекции в России является дельта Волги. Сбор репрезентативного полевого материала в этом регионе и его последующей обработкой вирусологическими, серологическими и молекулярно-генетическими методами может дать объяснение возникшей здесь эпидемической вспышки с необычными параметрами. Наравне с использованием патологоанатомических, вирусологических и серологических методов исследования, широко применяются и молекулярно-генетические методы определения вирусной РНК в ОТ-ПЦР.

Метод ОТ-ПЦР должен использоваться наряду с другими методами для изучения степени активности ВЗН в природных очагах. Кроме того, он позволяет выявлять генетические характеристики циркулирующих вирусных популяций. Задачей этого этапа исследования было установление процента зараженности членистоногих переносчиков (комаров и клещей) в различных частях экосистем дельты Волги и Волго-Ахтубинской поймы и молекулярно-биологическая характеристика штаммов циркулирующих здесь ВЗН, материал за 2001-2004 гг.

Для определения наличия РНК вируса Западного Нила в пробах полевого материала, мы использовали ОТ-ПЦР тест систему. При получении положительного результата, мы считали, что в данном пуле комаров (100 комаров) находится одна особь, имеющая РНК ВЗН.

Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей штаммов ВЗН первого генотипа, выделенных после 1999 г

В опытах in vivo было показано, что в низкопатогенном исходно для американского вида ворон Corvus brachyrhynchos штамме ВЗН, единственная замена в белке NS3 по позиции 249 треонина на пролин приводила к существенному изменению патогенных свойств вируса с увеличением титра виремии больше, чем в 105 раз и повышением уровня смертности до 94% (против исходного в 31%). Напротив, в исходно высокопатогенном штамме обратная замена 249 пролин на треонин приводила к снижению титра виремии с 9.4log10 до 3.6 log10 Б.О.Е, а уровень смертности снизился со 100% до 12,5%. Оба штамма принадлежали к первой генетической линии и имели дополнительно 11 аминокислотных различий в геноме [67]. Все штаммы, выделенные в Астраханской области в 1999-2005 гг., включая референтные Ast99-901, Ast99-986, а также штамм Hp94 1963 года, имеют в данной аминокислотной позиции пролин и, таким образом, содержат в себе важный фактор патогенности ВЗН.

Как показали исследования вариантов ОТ-ПЦР (один раунд, 156 «полугнездовой», «гнездовой») тест систем, наилучшим является использование «гнездового» метода, который позволяет обнаружить РНК вируса ЗН до концентрации 50 БОЕ/мл. С учетом того, что объем пробы для выделения РНК составлял 200 мкл., и только половина выделенной РНК использовалась в реакции получения кДНК для дальнейшего проведения ПЦР, это означает, что порог чувствительности данного метода лежит около 5 копий на пробу.

Дополнительно, данная система показала возможность выявлять РНК ВЗН 1-го, 2-го, 4-го и 5-го генотипов. При анализе пулов комаров из Астраханской области, хотя основную часть (96%) положительных проб составляли вирусы ЗН первого генотипа, были выявлены пробы, содержащие РНК вируса Западного Нила 2-го и 4-го генотипов (по 2% соответственно). Все ПЦР фрагменты, для которых была определена первичная нуклеотидная последовательность, содержали предполагаемый участок генома ВЗН, что говорит о высокой специфичности метода.

Так как, нельзя исключить наличия дополнительных, пока неизвестных генотипов и вариантов ВЗН, последовательности которых могут иметь большее количество нуклеотидных замен в местах посадки праймеров и, как следствие, более низкую оптимальную температуру отжига праймеров при проведении ПЦР, эта температура сознательно была снижена до 500С, тем более, что проведенные постановки ПЦР с использованием градиента температур при отжиге праймеров позволяют это сделать. Реакции и при достаточно низких температурах проходят эффективно и чисто (рис. 27).

В результате проведенной работы по определению нуклеотидных последовательностей вируса ЛЗН из положительных пулов комаров можно сделать следующие замечания.

Во-первых, все положительные ПЦР – пробы содержали действительно фрагмент последовательности вируса ЛЗН и не являлись ложно-положительными результатами ПЦР-анализа.

Во-вторых, практически все последовательности хотя бы минимально отличаются друг от друга, что указывает на их независимый первичный источник и отсутствие контаминации при проведении молекулярно-биологических манипуляций с материалом.

В-третьих, впервые показано на пробах полевого материала (пулы комаров) возможность разработанной ранее ОТ-ПЦР тест–системы выявлять наличие РНК вариантов вируса ЛЗН, относящихся ко второй и четвертой группам.

Дополнительно, следует отметить, что РНК ВЗН 4-го генотипа была выявлена в комарах видов, отличающихся от Uranotaenia unguiculata, что говорит о возможном распространении этого генотипа не только комарами вида Uranotaenia unguiculata, хотя, вероятно, этот вид комаров, как переносчик и резервуар, более важен для этого генотипа вируса. Кроме того, топотипный штамм вируса 4-го генотипа LEIV-Krd88-190, исследуемый в данной работе, был изолирован из клеща Dermacenter marginatum, что также указывает на то, что комары вида Uranotaenia unguiculata не являются уникальными резервуарами и переносчиками этого генотипа ВЗН.

Целью данной работы являлось клонирование полноразмерной кДНК копии генома вируса (в рамках работы по созданию обратной генетической системы для ВЗН). Для этой цели был выбран штамм LEIV-Krd88-190, изолированный на территории России в 1988 году из клеща Dermacenter marginatum и относящийся к отдельной, IV филогенетической группе.

Выбор штамма для проведения этой работы был сделан исходя из того, что, в отличии от генотипов 1 и 2, до настоящего времени не показана способность 4-го генотипа ВЗН вызывать заболевания у людей. Распространение вирусов ЗН 5-го (индийского) генотипа до настоящего времени не показано на других территориях, кроме Индии, кроме того, исходя их последних данных, крайне высока вероятность 5-го генотипа вызывать эпидемические вспышки среди людей [60]. Так как, работа по созданию полноразмерной копии генома ВЗН проводилась с расчетом на дальнейшее создание вакцинных штаммов, то данный выбор обоснован, хотя, к потенциальным минусам такого выбора следует отнести возможно, некоторые различия антигенных детерминант вирусов ВЗН разных генотипов [148, 160].

4.6. Значимость полученных данных о нуклеотидных последовательностях ВЗН, заложенных в базу данных

К моменту начала данной работы в 2000 г. в базе данных было 3 последовательности полных геномов ВЗН: две последовательности для первого генотипа, по одной для субгенотипов 1а и 1 b (вирус Кунджин, на тот момент, считавшийся самостоятельным вирусом), одна последовательность для генотипа 2.

Следует отметить, что для вируса ЗН средняя задержка по времени между изоляцией вируса и доступностью его последовательности в базе данных составляла в 2000-х годах около 8 лет. Возможно, это было связано с коммерциализацией проектов по созданию вакцинных препаратов, возможно, с лавинообразным распространением вируса по американскому континенту и, с закрытостью связанных с этим проектов по исследованию свойств вируса. Для иллюстрации приведены сравнительные диаграммы изоляции и доступности последовательностей в GenBank в США за период 1999-2011 гг.