Введение к работе
Актуальность проблемы. Хантавирусные лихорадки - инфекционные заболевания людей, возбудители которых относятся к роду Хштавирус семейства Буньяеириде современной классификации вирусов. Природным резервуаром хантавирусов и источником заражения людей являются дикие грызуны, спонтанно инфицированные этими вирусами.
Термин "геморрагическая лихорадка с почечным синдромом" (ГЛПС) употребляется в настоящее время для обозначения заболевания, возбудителем которого может быть, в зависимости от географического региона, один из 4-х хантавирусов: Хантаан (Hantaan), Пуумала (Puumala), Сеул (Seoul) и Добрава/Белград (Dobrava/Belgrade). В клинической картине ҐЛПС ведущим является своеобразное поражение почек, сопровождающееся у части больных симптомами геморрагического диатеза. ГЛПС распространена, главным образом, в странах Евразии, из которых Китай и Россия лидируют но показателям заболеваемости на 100 тысяч населения. В Российской Федерации ГЛПС занимает ведущее место среди зоонозных'вирусных инфекций и одно из первых мест среди всех природно-очаговых болезней человека.
Название "хантявирусный пудьмональный синдроме—(ХПС) было-
принято для обозначения недавно обнаруженного в США заболевания, вызываемого хантавирусами Син Номбре (Sin Nombre), Блок Крик Канал (Black Creek Canal) и Байо (Bayou). В отличии от ГЛПС в клинической картине ХПС ведущим является поражение легких, сопровождающееся интерстициальной пневмонией и респираторным дистресс-синдромом, приводящим в 50-60% к летальному исходу.
Широкое распространение, высокие показатели заболеваемости людей, значительная частота тяжелых форм течения болезни, отсутствие специфических средств лечения и профилактики обусловливают высокую
социальную и медицинскую значимость проблемы хантавирусных лихорадок.
С момента выделения в 1976 г. в Южной Корее от полевой мыши первого хантавируса до настоящего времени в различных регионах мира было выделено от больных людей, мелких млекопитающих, птиц и клещей более 500 хантавирусных штаммов, в том числе на территории Российской Федерации и Республик бывшего СССР - более 100 штаммов.
Еще на первом этапе изучения штаммов вируса-возбудителя ГЛПС с помощью серологических методов с использованием сывороток крови больных и переболевших ГЛПС людей из разных географических регионов мира была установлена антигенная неоднородность вируса ГЛПС, так называвшегося в то время и считавшегося единственным циркулирующим в природе и инфицирующим людей хантавирусом. Немного позднее было показано также, что антигенные различия возбудителя ГЛПС, которые прежде связывали с территориальным размещением природных очагов, коррелируют, в основном, с видовой принадлежностью мелких млекопитающих - природного резервуара вируса ГЛПС. По мере совершенствования лабораторных методов выявления вирусного антигена и специфических антител, а также в результате разработки и применения моноклональных антител удалось изучить более тонкие антигенные взаимоотношения между вирусными штаммами, что позволило распределить исследованные штаммы по группам, которые было решено рассматривать, как антигенные варианты или серотипы вируса ГЛПС, а позже, как хантавирусные типы. К началу наших исследований в мире было серологически типировано 8 хантавирусных типов: Хантаан, Пуумала, Сеул. Проспект Хилл, Добрава/Белград, Таиланд, Тоттапалаям и Син Номбре, в том числе на территории бывшего СССР - четыре типа. Однако, вопрос с реальном количестве существующих в природе хантавирусов остается открытым, как и вопрос об эпидемиологической значимости и патогенності
еще не открытых хантавирусиых типов, их природных резервуарах и носителях.
Наглядным примером, подтверждающим актуальность этой проблемы,
было обнаружение в 1993 г. в США нового хантавирусного типа и
установление его этнологической связи с тяжелым инфекционным
заболеванием людей. Вместе с тем, было вполне очевидным, что для решения
этих важных вопросов необходимы новые, современные и более эффективные
методические подходы, позволяющие в короткие сроки обнаруживать и
идентифицировать хантавирусы, при этом не только в клетках;
предварительно инфицированных вирусными штаммами, но и
непосредственно з полевых материалах от животных и людей.
В этом плане применение молекулярно-биологических методов, позволяющих выявлять вирусную РНК и анализировать геном вируса, является, на наш взгляд, наиболее перспективным направлением.
Цель работы: Исходя из вышеизложенного, мы предприняли
исследования, направленные на оптимизацию, применительно к
хантавирусам, методов генетической индикации и идентификации, а также выявления с помощью этих методов новых хантавирусов и изучения генетических взаимосвязей между хантавирусными типами.
Задачи работы:
1. Определить оптимальные условия применения полимеразной цепной
реакции (ПЦР) и метода частичного секвенирования генома для индикации и
идентификации хантавирусов.
2. Разработать новый метод ПЦР-ИФА, базирующийся на
комбинированном использовании полимеразной цепной реакции и
иммуноферментного анализа, для детекции и идентификации хантавирусов.
3. Изучить генетическую структуру хантавирусов различного
происхождения с помощью ПЦР и частичного секвенирования генома.
4. Установить эволюционное родство между хантавирусными типами и определить генотипы, циркулирующие на территории Российской Федерации и республик бывшего СССР.
Научная новизна. Обнаружение новых хантавирусных типов, циркулирующих в России (Хабаровск и Таймыр); первое выявление хантавирусного типа Тула в Крыму и установление их эволюционногс родства с известными хантавирусными типами.
Были оптимизированы молекулярно- биологические методы
применительно к хантавирусам, позволившие существенно повысит*
эффективность выявления и идентификации хантавирусов и получить новые
данные, имеющие приоритетное значение в изучении хантавирусов і
хантавирусных лихорадок в нашей стране и за рубежом. К ним относятся
определение генетических характеристик хантавирусных штаммов
выделенных ранее в России республиках бывшего СССР, и их систематизацій по принадлежности к конкретным хантавирусным типам.
Практическая значимость работы. Разработка нового метода ПЦР-ИФ/ и оптимизация применительно к хантавирусам ПЦР и секвенировани: позволяют более эффективно по сравнению с ранее применявшимися методамі обнаруживать и идентифицировать хантавирусы непосредственно в полезы; материалах от животных и человека, что открывает перспективу для оценю активности природных очагов и своевременного проведения соответствующи противоэпидемических мероприятий.
Основные положения, выносимые на защиту.
I. Для индикации и идентификации хантавирусов оптимизирован! условия применения полимеразной цепной реакции и секвенирования геном*
«
а также разработан новый метод ПЦР-ИФЛ, основанный на комбинированном использовании ПЦР и иммуноферментного анализа.
2. Установлены степень генетического родства исследованных
хантавирусных штаммов и эволюционные взаимосвязи между
хантавирусными типами.
3. Доказано существование новых хантавирусных типов на территории
России (Хабаровск и Таймыр) и выявлен впервые в Крыму хантавирусный
тип Тула.
4. Определены эволюционные взаимосвязи между хантавирусными
типами.
Апробация работы. Результаты исследований доложены на Междунар. симпозиуме по ГЛПС (Ленинград, 1991), 2-й Междунар. конференции по ГЛПС (Пекин, Китай, 1992), 3-й Междунар. конференции по ГЛПС (Хельсинки, Финляндия, 1995), а также на заседании межлабораторного Ученого совета по проблемам частной вирусологии Института полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П. Чумакова РАМН.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 научных работ.
Объем и структура работы. Диссертация изложена- на 120 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований (7 глав), заключения с обсуждением, выводов и списка литературы, состоящего из 104 источников (из них 14 -отечественных авторов). Работа иллюстрирована 29 рисунками и 12 таблицами.