Содержание к диссертации
Введение
1. G4 в геномном контексте (обзор литературы) 14
1.1. Общая характеристика G4 структур и методов их исследования 15
1.2. G4 в геноме: условия формирования и особенности локализации 23
1.3. Проблемы формализации и программные инструменты поиска G4 30
2. G-квадруплексы в дизайне аптамеров и супрамолекулярных ДНК структур (обсуждение результатов) 43
2.1. Неканонические “в квадрате” ДНК-структуры (ImGQ) 43
2.1.1. Примеры ImGQ и оценка их термической стабильности при физиологических условиях 45
2.1.2. Динамика ImGQ ядра 52
2.1.3. Взаимодействие ImGQ c низкомолекулярными лигандами 57
2.1.4. Взаимодействие ImGQ c белками 62
2.2. Инструмент поиска ImGQ-мотивов в геномах (ImGQfinder) 70
2.2.1. Возможности ImGQfinder 70
2.2.2. Анализ распределения ImGQ-мотивов в геноме человека 71
2.3. Новые противовирусные аптамеры на основе геномного G4 80
2.3.1. Дизайн на основе G4 скаффолда как альтернатива de novo селекции аптамеров 80
2.3.2. Выбор скаффолдов для аптамеров к белкам ВИЧ-1 и их модификация 82
2.3.3. Проверка противовирусной активности и цитотоксичности аптамеров 87
2.3.4. Проверка гипотезы взаимодействия аптамеров с поверхностными гликопротеинами ВИЧ 90
2.4. Химическая модификация известного G4 аптамера 93
2.4.1. Обзор модификаций, предложенных для оптимизации тромбин-связывающего аптамера TBA15 93
2.4.2. Синтетический базис для оптимизации ТВА (на примере триазольной межнуклеотидной модификации) 95
2.4.3. Оценка влияния модификации на аффинность аптамера к мишени, термическую стабильность, устойчивость к нуклеазному гидролизу и активность 100
2.4.4. Сравнительный анализ эффектов различных химических модификаций TBA и введения дополнительных структурных модулей. 103
2.5. Ассоциаты природных и модифицированных G4 107
2.5.1. G4 мотивы Алу-повторов: общая характеристика 108
2.5.2. Самоассоциация Алу-G4 110
2.5.3. G4 микросателлитов и их модифицированные аналоги: общая характеристика 114
2.5.4. Влияние петель G4 и внешних условий на выход супрамолекулярных структур 124
2.5.5. ДНК-конструкции на основе интеркалированных параллельных дуплексов (i-мотивов) 128
3. Экспериментальная часть 136
3.1. Синтез, очистка и MS-анализ олигонуклеотидов 136
3.2. Синтез фосфорамидита динуклеозидного аналога для триазольной модификации ОДН 137
3.2.1. Реагенты, растворители; ЯМР и ES-MS-анализ нуклеозидных аналогов 137
3.2.2. 3 -O-трет-Бутилдифенилсилил-5 -дезокси-5 -метилентимидин (2) 138
3.2.3. 3 -O-трет-Бутилдифенилсилил-5 -дезокси-5 -(гидроксиметил)тимидин (3) 139
3.2.4. 3 -O-трет-Бутилдифенилсилил-5 -дезокси-5 -формилтимидин (4) 140
3.2.5. 3 -O-трет-Бутилдифенилсилил-5 -дезокси-5 -(2,2-дибромоэтинил)тимидин (5) 141
3.2.6. 3 -O-трет-Бутилдифенилсилил-5 -дезокси-5 -этинилтимидин (6) 141
3.2.7. 4-[3 -O-трет-Бутилдифенилсилил-5 -дезокситимиди-5-ил]-1-[3 -дезокси-5 -О-(4,4 -диметокситритил)тимидин-3-ил]-1H-1,2,3-триазол (7) 142
3.2.8. 1-[3 -Дезокси-5 -О-(4,4 -диметокситритил)тимидин-3-ил]-4-[5 -дезокситимиди-5-ил] -1H-1,2,3-триазол (8) 144
3.2.8. 4-{3 -[(2-цианоэтокси)диизопропиламинофосфанилокси]-5 дезокситимидин-5 -ил}-1-[3 -дезокси-5 -О-(4,4 -диметокситритил)тимидин-3-ил] 1H-1,2,3-триазол (9) 145
3.3. Установление вторичной структуры олигонуклеотидов 146
3.3.1. Приготовление образцов 146
3.3.2. Абсорбционная спектроскопия и спектроскопия КД 146
3.3.3. Флуориметрия 147
3.3.4. ЯМР-спектроскопия 148
3.3.5. Атомно-силовая микроскопия 149
3.3.6. Гель-фильтрационная хроматография 149
3.3.7. Молекулярное моделирование 150
3.4. Исследование G4-белковых взаимодействий 152
3.4.1. Торможение в геле 152
3.4.2. Анализ поляризации флуоресценции 153
3.4.3. Микротермофоретический анализ 154
3.4.4. PCSW-анализ 154
3.4.5. Скрининг с использованием белковых чипов 155
3.5. Оценка активности, цитотоксичности и скорости ферментативной деградации G4 аптамеров 158
3.5.1. Ингибиторная активность аптамеров к тромбину (тест на тромбиновое время) 158
3.5.2. Ингибиторная активность аптамеров к ВИЧ-1 (эксперименты по трансдукции клеток псевдовирусом) 158
3.5.3. Цитотоксичность аптамеров (MTT-тест и FACS-анализ) 159
3.5.4. Нуклеазный гидролиз 160
3.6. Биоинформатический анализ 160
3.6.1. Представленность и локализация ImGQ мотивов в геноме человека 160
3.6.2. Функциональный анализ генов, обогащенных ImGQ мотивами в приграничных участках интронов . 161
4. Заключение 163
5. Выводы 165
6. Литература 166
Благодарности 200
- G4 в геноме: условия формирования и особенности локализации
- Выбор скаффолдов для аптамеров к белкам ВИЧ-1 и их модификация
- ДНК-конструкции на основе интеркалированных параллельных дуплексов (i-мотивов)
- Функциональный анализ генов, обогащенных ImGQ мотивами в приграничных участках интронов
G4 в геноме: условия формирования и особенности локализации
Результаты исследования G4 в геномной ДНК, получаемые различными методами, в основном не противоречат друг другу и результатам биоинформатического анализа [65-66], однако остаются в большой степени фрагментарными. В геноме человека G4-мотивы и подтвержденные сложенные структуры локализованы, прежде всего, в теломерных повторах, промоторных областях (в особенности онкогенов) и микросателлитах. Описание “общей картины” осложняется ее вариативностью, динамикой: формирование G4 зависит от стадий клеточного цикла [67], напрямую связано с транскрицией и репликацией, а также эпигенетическими параметрами. Первые результаты подробного анализа G4 в контексте хроматина были опубликованы в 2016 году. Методом CHIP-seq с G4-специфичными антителами BG4 [68] была установлена кластеризация G4 в регуляторных, ненуклеосомных областях (nucleosome-depleted regions, NDR) генома человека, а также 5 -нетранслируемых областях активно транскрибируемых генов, включая онкогены и гены, ассоциированные с вариациями числа копий в соматических клетках. Показано, что G4 колокализованы с транскрипционно активным эухроматином, маркерами которого были выбраны РНК полимераза II и/или гистоновый вариант H3K4me (гистон H3, триметилированный по остатку лизина 4, характерен для сайтов инициации транскрипции). Представленность геномных G4 по данным ChIP-seq (около 10 000 структур или их кластеров) предсказуемо ниже таковой по данным G4-seq (около 700 000 структур), что отражает решающую роль эпигенетики, позиционирования нуклеосом. Искусственное изменение нуклеосомного контекста в этом случае должно менять профиль G4 распределения. Действительно, ремоделинг (ацетилирование гистона H3K27 в промоторах; H3K27 – маркер активной транскрипции) приводил к образованию новых областей открытого хроматина и квадруплексов в них [68]. В то же время были опубликованы интригующие данные, свидетельствующие о локализации G4 в гетерохроматиновых областях [69] (в работе использовали антитела 1H6), на основании чего была предложена гипотеза G4-опосредованного подавления транскрипции за счет модификации гистонов, объясняющая нарушения экспрессии генов при экспансии G-богатых повторов (синдром ломкой хромосомы Х и ряд нейродегенеративных заболеваний). Эту интерпретацию ставит под сомнения показанная позднее (в 2017 году) кросс-реактивность 1H6 с T-богатой ДНК [70]. Таким образом, на данный момент общепризнанной можно считать колокализацию de-novo формирующихся G4 с эухроматином и связь с активной транскрипцией.
Такой результат представляется закономерным, поскольку фолдинг геномных G4 возможен при условии локального расплетения B-ДНК – например, в нетемплатной цепи напротив РНК/ДНК дуплекса R-петли (при транскрипции) или в репликативной вилке. Кинетика G4-фолдинга – от миллисекунд до нескольких минут в зависимости от последовательности – предполагает, что часть структур образуется из G-богатой оцДНК спонтанно. Формирование прочих возможно лишь при участии шаперонов (белковые факторы, способные инициировать de-novo фолдинг или стабилизировать предсложенные структуры, рассмотрены в обзорах [71-72]). Сформировавшиеся G4 создают структурный барьер для ДНК/РНК полимераз; ключевую роль в снятии данного барьера при элонгации транскрпиции и репликации играют геликазы [73-74] (WRN, BLM, Pif1, FANCJ – при репликации; DEAH-box геликазы, FANCJ, XPB, XPD и др. – при транскрипции), а также топоизомераза I [75].
Нарушение функции шаперонов и геликаз может приводить к потере гистонового кода: не расплетенные G4 блокируют ДНК-полимеразу; для восстановления репликации требуется привлечение белков системы репарации, задержка создает дисбаланс между рециркуляцией исходных и привлечением вновь синтезированных гистонов, в результате происходит сбой позиционирования модифицированных гистонов – маркеров транскрипционно активного/неактивного хроматина; дефекты такого рода вблизи промотора приводят к изменению генной экспрессии [76-77]. Сходный механизм, предположительно, обуславливает роль квадруплексов в потере гистонового кода при репарации.
G4 являются “горячими точками” не только эпигентерической, но и геномной нестабильности за счет участия в формировании двухцепочечных разрывов и последующей рекомбинации [78]. Рекомбинацию по G-богатым фрагментам обычно рассматривают на примере переключения классов иммуноголобулинов (Ig) [65] и связывают с образованием G-петель в ходе транскрипции [79]. G-петли – структуры, включающие гибридный дуплекс растущей РНК-цепи и темплатной ДНК, а также G4 в выпетленном G-богатом участке нетемплатной цепи. В общем случае гибридный дуплекс и выпетленный фрагмент оцДНК называют R-петлей [80]. Формирование R-петель само по себе повышает вероятность разрывов ДНК [81], а наличие G4 мотивов “усугубляет” ситуацию. Торсионный стресс (отрицательная сверхспирализация позади РНК-полимеразного комплекса) и выпетливание нетемплатной ДНК благоприятствуют G4 фолдингу; G4, в свою очередь, дополнительно стабилизирует петлю, препятствуя восстановлению ДНК-ДНК дуплекса. Стабилизированная R-петля (G-петля) блокирует последующие раунды транскрипции [82]. Интересно, что отрицательная сверхспирализация в отсутствие R-петель не является достаточным условием G4-фолдинга G-богатых фрагментов (показано с экспериментах со сверспирализованными плазмидами [83-84]).
Кваруплекс-специфичные нуклеазы (FEN1, EXO1, DNA2 [85-86]) атакуют G4 в R(G)-петлях, что приводит к одноцепочечным разрывам. В то же время никированию могут подвергаться соседние неструктурированные фрагменты ДНК. Например, в случае S-участков иммуноглобулинов оцДНК G-петли становятся мишенью цитидиндезаминазы (переводит остатки дезоксицитина в дезоксиуридин, последний процессируется ферментами эксцизионной репарации) [87-88]. Переход к двухцепочечным разрывам ДНК может осуществляться за счет накопления одноцепочечных. Другой вариант, активно обсуждаемый в литературе, предусматривает роль репликативного стресса, столкновения R-петель и репликативных вилок [89-90]. Конфликт репликативного и транскрипционного аппаратов может способствовать распространению R-петель и дальнейшему повреждению ДНК [91], но в норме ассоциированные с репликацией факторы репарации, по-видимому, участвуют в разрешении структур R-петель [92-93].
Если допустить существование G4 вне R-петель и репликативных вилок, не очевидна геометрия противолежащей цепи. Теоретически С-богатые фрагменты напротив G4 способны формировать i-мотивы (IM) – взаимно интеркалированные параллельные дуплексы, стабилизированные гемипротонированными С-С парами (Рисунок 2А).
Протонирование половины цитозиновых остатков в общем случае требует pH около 4,5 (соответствует рКа изолированного цитозина), что не допускает формирования IM в физиологических условиях. Однако характеристики IM (длина, состав петель, число пар в ядре) [94-95], а также внешние факторы (краудинг-эффект и ионы металлов [96]) существенно влияют на рН-чувствительность (краудинг и ионы магния стабилизируют IM при рН около 7 [97]). Недавно было обнаружено большое число геномных фрагментов, способных формировать термодинамически устойчивые IM при физиологических рН [98].
Вопрос одновременной реализации G4 и IM в дуплексном окружении был рассмотрен еще до верификации принципиальной возможности IM фолдинга геномной ДНК. В ходе in vitro экспериментов в G4 и IM-благоприятствующих условиях (ионы калия, рН 5,5) был установлен взаимоисключающий характер G4 и IM фолдинга для фрагментов повторов, ассоциированных с геном инсулина [99]. Позднее (2016 год) было показано, что стерические затруднения, препятствующие одновременной реализации G4 и IM, являются общим случаем при супротивном расположении неканонических структур, тогда как в микросателлитах и областях с множественными G/С-блоками можно ожидать смещения противолежащих структур относительно друг друга (Рисунок 2А) [100].
Интересно, что G4 и IM в составе и промотора или проксимальных участков (смещенные либо реализуемые попеременно в зависимости от наличия белковых факторов и торсионного стресса) могут выполнять разнонаправленные регуляторные функции. Ярким примером (Рисунок 2Б) является элемент NHE III1 вблизи промотора онкогена с-Myc — область гиперчувствительности к нуклеазам (nuclease hypersensitive element), содержащая 8 G3+-блоков (С3+ блоков в противолежащей цепи). Данный элемент участвует как в репрессии, так и в активации экспрессии c-Myc [101]. Доминирующей неканонической структурой, формирующейся в локально расплавленном вследствие отрицательной сверхспирализации NHE III1 при транскрипции является G4, в котором задействованы 4 центральных G-блока. Его стабилизация нуклеолином [102] или низкомолекулярными лигандами приводит к подавлению транскрипции. С другой стороны, связывание гетерогенного рибокнуклеопротеина К (hnRNP K) с IM, в формировании которого задействован 5 -концевой фрагмент NHE III1, активирует транскрипцию (активация требует дополнительного торсионного напряжения и участия 3 -концевого неструктурированного фрагмента C-богатой цепи NHE III1). Аналогичные разнонаправленные эффекты распознавания IM hnRNP K и стабилизации G4 показаны для промотора онкогена KRAS [103].
Выбор скаффолдов для аптамеров к белкам ВИЧ-1 и их модификация
Вышеупомянутые мультимодальность действия и кросс-реактивность G4 побудили нас использовать в качестве скаффолдов известные аптамеры и геномные структуры, изначально функционально не связанные с ингибированием ВИЧ. Как уже отмечалось, рассматривались исключительно внутримолекулярные структуры. Последовательности всех ОДН приведены в Таблице 11.
Первый выбранный скаффолд – тромбин-связывающий аптамер (TBA) [33], его топология и термостабильность были ранее детально охарактеризованы другими группами. TBA образует двухквартетный антипараллельный G4 типа “кресло” (Рисунок 16А), Тпл = 52С в присутствии 100 мМ KCl [191]. T-богатые петли и антипараллельный фолдинг предполагают возможность противовриусного действия (см. анализ общих структурных паттернов известных анти-ВИЧ аптамеров в предыдущем подразделе). ТВА прежде не проходил проверку на противовирусную активность (нет опубликованных данных по ингибированию вирусов, хотя было показано связывание ТВА с белком нуклеокапсида ВИЧ [192]), но продемонстрировал заментую антипролиферативную активность в экспериментах на культурах клеток человека [193]. Создание противоопухолевых агентов на базе ТВА казалось малоперспективным ввиду доминирования его антикоагуляционного эффекта. Однако, недавно с помощью химической модификации (замена нуклеотидного остатка в петле на дибензильный линкер) удалось подавить тромбин ингибиторующую функцию при сохранении антипролиферативной активности [194]. Это открыло возможности разработки противоопухолевых ТВА производных и стимулировало интерес к данному аптамеру как мультифункциональному квадруплексному скаффолду.
В контексте предотвращения вирусных инфекций выраженый антикоагуляционный эффект является нежелательным, если речь не идет о катетер-ассоциированной инфекции (в этом случае попутно решается проблема предотвращения блокировки катетера [195]). В случае же местного применения препарата на основе аптамера для предотвращения передачи инфекции половым путем антикоагуляционное действие усиливает риск кровотечения (и в итоге заражения) при локальном изъязвлении. Многие известные полианионные микробициды повышают риск кровотечения, т.е. проблема является досточно общей [196-197]. Для подавления антикоагуляционного эффекта ТВА нами была выбрана тиофосфорильная модификация. Она имеет преимущества перед дибензильной модификацией, предложенной итальянской группой при оптимизации ТВА как антипролиферативного агента [194], а именно: 1) возможность автоматического синтеза тио-ОДН без предварительной наработки модифицированного амидита; 2) тройной ожидаемый эффект модификации – подавление тромбин-ингибирующей функции при одновременном усилении противовирусной активности (см. предыдущий раздел, анализ общих структурных паттернов известных аптамеров) и повышение устойчивости аптамера к нуклеазному гидролизу [198]. Недостатком тио-модификации является возможная токсичность аптамеров (рассмотрено подробно в следующем подразделе).
Влияние тио-модификации на термическую стабильность, устойчивость в биологических средах и тромбин-ингибирующую функцию ТВА было исследовано ранее группой Позмоговой Г.Е. [191, 199]. Эффекты варьировались в зависимости от числа и положения модифицированных звеньев. Из производных ТВА, охарактеризованных Позмоговой Г.Е. с соавторами, были отобраны два термостабильных и устойчивых к действию нуклеаз аптамера со сниженной атикогуляционной активностью [199]: ThioBA (модификации в ТТ-петлях, антикоагуляционная активность подавлена частично, термостабильность повышена: Tпл = 54C в присутствии 100mM KCl) и FhioBA (модификация по всему остову, термостабильность снижена: Tпл = 45C в присутствии 100mM KCl, но антикоагуляционная активность подавлена полностью [200]). Оба аналога ТВА сохраняют антипараллельный G4 фолдинг [191].
Второй скаффолд, выбранный для иллюстрации возможности дизайна аптамеров на базе геномных стурктур – охарактеризованный нами в разделе 2.1.1. G4 BclON (консервативный фрагмент генома человека, участвует в модуляции экспрессии гена Bcl-2 [201]). Параллельные 4-квартетные G4 (межмолекулярные) достаточно широко представлены среди известных анти-ВИЧ аптамеров (см. предыдущий подраздел). Последовательность BclON соответствует классической формуле для 3-квартетного мономолекулярного GQ (на упрощенных схемах далее BclON показан как трехквартетный), но по нашим данным BclON способен также формировать 4-квартетный ImGQ - Рисунок 16А (cм. Раздел 2.1.1 – прояснить структуру методом ЯМР не удалось, однако анализ мутантов BclON указывает на ImGQ фолдинг).
Fhio-BclON, тиофосфорильный аналог BclON с модификацией по всему остову, имеет близкие к BclON дифференциальный спектр УФ-абсорбции (присутствует характерный для G4 минимум при 295 нм) и спектр КД (присутствует сигнатура параллельного квадруплекса – положительный пик при 265 нм - и следы антипараллельного/гибридного G4 – минорный положительный пик при 295 нм); термодинамические характеристики (TплFhio-BclON = 62C в присутствии 10mM KCl) также близки (Рисунок 16Б).
Внутримолекулярный фолдинг Fhio-BclON подтверждали методом RRT-анализа [187]. DMThio-BclON – аналог Fhio-BclON с дополнительной 5 -концевой модификацией (получали аналогично Fhio-BclON, пропуская стадию удаления 5 -O-диметокситритильной защитной группы перед выделением целевого ОДН). Дополнительная модификация была введена, исходя из следующих соображений: положительный эффект 5 -концевых гидрофобных фрагментов был отмечен ранее для межмолекулярных параллельных G4
аптамеров к ВИЧ [202] (по мнению авторов, гидрофобные фрагменты повышали сродство к поверхностным гликопротеинам вируса); мы предположили аналогичный эффект в случае мономолекулярного параллельного G4.
ДНК-конструкции на основе интеркалированных параллельных дуплексов (i-мотивов)
Подходы, аналогичные описанным в предыдущем подразделе, были использованы нами в работе с другим типом четырехтяжевых неканонических структур ДНК – i-мотивами (IM, интеркалированные параллельные дуплексы, стабилизированные гемипротонированными С-С парами). Необходимость протонирования половины цитозиновых остатоков обуславливает рН чувствительность таких структур, что открывает дополнительные возможности управления сборкой и применяется в ДНК-оригами [278].
Как было показано в предыдущем подразделе, конструкции на основе G4 весьма разнообразны и включают супрамолекулярные протяженные стурктуры – проволоки. В случае IM до сих пор было показано исключительно формирование мономерных, димерных, тримерных и тетрамерных IM c “монолитным” ядром (т.е. каждый параллельный дуплекс образован непрерывными С-богатыми цепями/фрагментами цепей). Единственным примером IM-подобных структур высокого порядка можно считать полученные группой А. Котляра глобулы протяженных олиго-С-фрагментов (“наносферы”), примечательные высокой электирческой поляризуемостью. Тонкая структура таких “наносфер” не была исследована [279]. Глобулярные структуры, очевидно, неудобны для наноэлектроники и не решают проблем ДНК-оригами. Получение сложных 3D-ДНК-решеток требует компактных развевленных рН-чувствительтельных элементов (узлов).
В нашей совместной работе с группой Д.В. Клинова была исследована зависимость IM-фолдинга от длины С-блока ОДН с верификацией возможности мультимеризации IM (Рисунок 32). Для оценки числа ОДН, участвующих в образовании IM, к С-блокам были добавлены блоки олиго-Т (“хвосты”). Визуальный скрининг АСМ-сканов IM позволяет по числу выступающих из IM ядра “хвостов” напрямую определить число задействованных цепей. В ряду CnT25, n = 2, 5, 7, 9, 12, 25 наблюдали формирование стабильных при комнатной температуре IM (pH 5,2-5,5), начиная с n = 9. В дифференциальных абсорбционных спектрах ОДН присутствовал характерный для IM отрицательный экстремум при 295-300 нм, в спектрах КД также присутстовала сигнатура IM – положительный пик около 285-288 нм (верхняя и средняя панели на Рисунке 32A). ОДН C7T25 формировал метастабильный IM (доля сложенной структуры – около 50% при комнатной температуре, нижняя панель на Рисунке 32A). Данные исследований оптическими методами коррелируют с данными 1H-ЯМР (Рисунок 32B): характерные для гемипротонированных C-C пар сигналы H3 цитозина (около 15.5 м.д.) отчетливо видны в спектрах CnT25 при n 9; cледы H3-cигналов заметны и в спектре C7T25.
IM дополнительно анализировали методом гель-хроматографии (Рисунок 32Б): были подобраны условия, позволяющие разделить по подвижности мономолекулярные (сложенные или расплавленные) и межмолекулярные структуры. Результаты гель-хроматографии не полностью коррелируют с данными, полученными оптическими методами (это можно отчасти отнести за счет разницы в условиях: хроматография потребовала более высоких концентраций ОДН и добавления метанола, который, по-видимому, выступает в роли краудинг-агента). По данным гель-хроматографии, даже ОДН C5T25 формировал некоторое количество IM (время удерживания указывает на тетрамеры, 1 тетрамер на 15-16 неструктурированных мономеров, исходя из соотношения интегральных значений абсорбции 20:80 – нижнаяя панель Рисунка 32Б). В случае C7T25 доминирующей сложенной структурой также был тетрамер (длина С-блока недостаточна для образования устойчивых димеров), в случае C9T25 доминировали димеры. Интересно, что в хроматограммих C12T25 и C25T25 наблюдались пики с малым ( 10 мин.) временем удерживания, предположительно соответствующие мультимерам; переход от быстрого отжига растворов C25T25 к медленному (термодинамический контроль фолдинга) практически полностью смещал равновесие в сторону мультимеров. Мультимеризацию подтверждали методом АСМ (Рисунок 32Г): в сканах C12T25 и C25T25 действительно наблюдалось некоторое количество структур с множественными (более 4) “хвостами”, выступающими из одного ядра. В нижней части Рисунка 32Г приведена гипотетическая структура гексамера C25T25 (схема построена, исходя из принципа максимизации числа С-С пар).
Предложенная организация IM ядра (ядро не монолитно, имеет разрывы, от них отходят T25-хвосты) напоминает описанные для A15G15 “лохматые проволоки” (fried wires) – аналоги классических G-проволок с выступающими A15-хвостами.
В отличие от протяженных мультимеров с G4 ядром, мультимеры с IM-ядром являются замкнутыми структурами. Первые, как уже отмечалось, представляют интерес для бионаноэлектроники, последние могут использоваться в качестве узловых элементов ДНК-оригами.
Помимо разработок в области бионанотехнологии (оригами, рН чувствительные гидрогели и наномоторы), а также медицинской химии (рН чувствительные наноконтейры для контролируемого высвобождения лекарственных препаратов) [280-282], IM, как и G4, имеют перспективы применения в аналитической химии в качестве сенсоров на низкомолекулярные лиганды и IM-распознающие белки [283]. При этом основновной сферой применения IM остается дизайн рН-сенсоров. Такие сенсоры, как правило, предполагают детекцию оптическими методами и включают флуоресцентно меченые IM или их конъюгаты с наночастицами. В одной из первых знаковых работ в рамках данного направления за основу сенсора для мониторинга изменений pH живой клетке (например, при созревании эндосом) был взят межмолекулярный IM [284], однако в целом предпочтительны внутримолекулярные структуры (кинетика фолдинга позволяет отслеживает быстрые процессы). Ключевой характеристикой IM в плане дизайна сенсоров является диапазон рН-чувствительности. Хотя для структур с протяженным ядром и/или дополнительными стабилизирующими элементами (например, тетрады по малой бороздке) не исключена термодинамическая устойчивость в условиях, близких к физиологическим ([285], обсуждалось в Обзоре литературы), немодифицированные IM, как правило, не существуют вне диапазона рН 3-6.5.
Для стабилизации IM и/или смещения диапазона рН-чувствительности было предложено несколько модификаций ОДН, наиболее выразительный эффект был получен при модификациях остова LNA, 2 -F-araC и UNA [286-288], а также при введении терминальных нуклеотидных аналогов с модифицированными гетероциклическими основаниями (производное аденозина с пиреновым заметстителем и др.) [289]. В последнем случае стабилизация достигалась за счет стекинга модифицированного гетероцикла с гемипротонированной С-С парой. В случае LNA положительный эффект давали модификации петель. В случае 2 -F-araC и UNA модификации в ядре IM приводили к заметной стабилизации, но лишь при множественных заменах. Таким образом, на начало 2018 года проблему стабилизации IM нельзя считать окончательно решенной, известные модификации имеют ограничения.
В рамках совместной работы с группой А.В. Аралова, продолжившей исследования группы М. Матуччи по стабилизации антипараллельных ДНК-дуплексов за счет введения в ОДН остатков нуклеозидных анлогов типа “G-clamp”, мы предложили адаптировать clamp-стратегию для IM.“G-clamp” (“зажим на G”) – производное феноксазина с аминоалкильным заместителем, аналог C, формирующий устойчивую пару с G в антипараллельных дуплексах (4 водородные связи против 3 в G-C парах). А.В. Араловым с соавт. было разработано несколько модификаций классического “G-clamp” М. Матуччи, все аналоги С данного типа далее называем обобщенно “clamp” (Рисунок 33А).
Функциональный анализ генов, обогащенных ImGQ мотивами в приграничных участках интронов
Белки, гены которых обогащены ImGQ-мотивами вблизи границ интрон/экзон, анализировали на предмет общей функции, соответствующего биологического процесса и локализации в клетке, используя приложение Bingo программы Cytoscape 3.2.0, базу данных GeneOnthology и коррекцию Бонферрони для множественного тестирования. Пороговое значение p-value (после коррекции) принимали равным 0.05.
В работе объединены исследования по трем взаимодополняющим направлениям: 1) анализ потенциальных квадруплексных сайтов в геноме, 2) дизайн аптамеров, 3) сборка мультимерных ДНК-конструкций. Cвязь между этими направлениями может быть обобщена следующим образом: при конструировании аптамеров и наноструктур (G-проволок и др.) целесообразно использовать в качестве основы геномные квадруплексные структуры, далее оптимизировать их под конкретную задачу с помощью химической модификации.
Один из ключевых практических результатов работы по первому направлению – программный инструмент поиска G4-мотивов ImGQFinder (новаторский на момент размещения в открытом доступе – 2014 г.) на начало 2018 г. имеет несколько аналогов и может быть расценен как один из прототипов предложенного группой чешских исследователей инструмента нового поколения PQSFinder.
К представленным результатам исследования генома человека, имеющим фундаментальную значимость, можно отнести ресширение репертуара квадруплекс-образующих сайтов как потенциальных мишеней терапевтических агентов. Отдельно стоит отметить квадруплекс-образующие сайты Aлу-повторов. Обнаружение мотивов термодинамически стабильных G4 в составе Алу дополняет современные представления о роли данных мобильных элементов в геномных перестройках.
Практическими результатами работы по второму направлению являются выскоактивные G4 аптамеры (ингибиторы тромбина и противовирусные G4). Даже с учетом перспективы применения новых/оптимизированных аптамеров в терапии и диагностике эти результаты можно расценивать как частные. Более значимыми представляются методологические аспекты. Полный или частичный отказ от процедуры SELEX, поиск альтернатив и комбинированных стратегий – актуальные тренды в области дизайна/селекции аптамеров. Существенным итогом наших исследований является демонстрация возможностей дизайна на основе известных G4 структур с последующей оптимизацией аптамеров (включая мультифункциональные, такие как тромбин-связывающий G4 аптамер ТВА) под конкретную задачу.
Для оптимизации аптамеров предложено несколько новых олигонуклеотидных модификаций. Модификация, имитирующая отщепление гетероциклических оснований в петлях G4, не оправдала себя применительно к аптамерам, однако была успешно применена для управления фолдингом и сборкой G4 (стабилизация параллельных G4 и повышение выхода мультимеров).
По результатам анализа полиморфизма параллельных G4 предложена схема-гипотеза, обобщающая закономерности формирования G4-ассоциатов и переходов между ними. В упрощенной форме она может быть формализована следующим образом: “от стопрок к проволокам через сцепление”. Практическим результатом является подбор условий (и олигонуклеотидной модификации), позволяющих максимизировать выход структур высокого порядка – нанопроволок (итог работы по третьему направлению).
В заключительной части работы были рассмотрены возможности сборки мультимерных конструкций на основе другого типа четырехнтяжевых ДНК-структур – IM. Показано, что для IM могут быть адаптированы подходы, отработанные на G4. В частности были получены мультимерные IM c необычной организацией ядра, напоминающей G-проволоки. Подобрана химическая модификация ядра IM, позволяющая повысить термическую стабильность структуры и сместить диапазон рН-чувствительности.