Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 17
2.1 Врожденный иммунный ответ 17
2.1.1 Toll-подобные рецепторы 27
2.1.3 Индукция врожденной реакции на инфекцию 37
2.1.4 TNF-a во врожденном иммунитете 46
2.1.5 NK-клетки 52
2.1.6 Рецептор NKG2D 57
2.1.7 TREM-1 рецептор 57
2.1.8 Неканонические лимфоциты 60
2.2 Адаптивный иммунитет. Т - лимфоциты 61
2.2.1 Механизм цитотоксичности CD4+ T-клеток 65
2.2.2 Treg клетки 66
2.3 Механизм действия цитокина IL-2 67
2.4 Механизмы действия цитотоксических лимфоцитов 68
2.5 Рецепторы смерти и их лиганды 71
2.5.1 Рецептор TNF-R1 и его лиганд TNF- 71
2.5.2 Рецептор Fas и его лиганд FasL 73
2.6 Механизмы программируемой клеточной смерти. Апоптоз 73
2.6.1 Митохондриальный путь клеточной смерти 75
2.6.2 Некроптоз 76
2.6.7 Лизосомальный механизм клеточной смерти 81
2.7 Белок Tag7 82
2.7.1 Пептидогликан-распознающие белки 82
2.7.2 Семейство PGRP человека содержит 4 пептидогликан-распознающих белка 88
2.7.3 Tag7 участвует в иммунном ответе у человека 91
2.8 Белок Hsp70 92
2.9 Белок HspBP1 – кошаперон Hsp70 95
3. Материалы и методы 96
4. Результаты и обсуждение 106
4.1 Инкубация лейкоцитов периферической крови человека с цитокином IL-2 приводит к появлению цитотоксических лимфоцитов, способных убивать опухолевые клетки через FasL-Fas взаимодействие 106
4.2 ЛАК клетки индуцируют апоптоз и некроптоз в клетках K562 108
4.3 CD4+CD25+ цитотоксические Т лимфоциты узнают Hsp70 на поверхности опухолевых клеток, используя белок Tag7 112
4.4 Цитотоксические CD3+CD4+CD25+ лимфоциты не являются Treg клетками 121
4.5 Цитотоксичность лимфоцитов, полученных из донорской крови. 123
4.6 CD8+ T лимфоциты распознают молекулу MicA на опухолевых клетках с помощью рецептора NKG2D 124
4.7 CD3+CD8+-лимфоциты выделяют цитотоксический Tag7-Hsp70 комплекс 133
4.8 Введение цитотоксического комплекса Tag7-Hsp70 мышам с трансплантированными опухолями тормозит рост опухоли 139
4.9 Механизмы цитотоксической активности Tag7-Hsp70 комплекса. 142
4.10 Комплекс Tag7-Hsp70 взаимодействует с TNFR1 147
4.11 Tag7 взаимодействует с TNFR1 и блокирует цитотоксические эффекты комплекса Tag7-Hsp70 и TNF- 153
4.12 Пептид 17.1 белка Tag7 взаимодействует с TNFR1 157
4.13 Механизмы некроптоза под действием Tag7-Hsp70 комплекса 165
4.14 HspBP1 является регулятором активности Tag7-Hsp70 комплекса 171
4.15 HspBP1 секретируется клетками CSML-0 в комплексе с Tag7 180
4.16 HspBP1 связан с Tag7 в сыворотке человека 182
4.16 Tag7-Mts1 комплекс выделяется моноцитами, нейтрофилами и Т лимфоцитами и способен вызывать направленную миграцию NK клеток и субпопуляций Т лимфоцитов 184
4.17 Tag7 активирует лимфоциты человека, приводя к активации моноцитов и последующему увеличению экспрессии цитокинов IL-1b, IL-6, и TNF- 190
5. Заключение 194
5.1 Противоопухолевая активность ЛАК клеток 195
5.2 Tag7-Hsp70 комплекс через TNFR1 рецептор вызывает апоптоз и некроптоз в опухолевых клетках. 196
5.3 Tag7-Mts1 комплекс вызывает направленное движение NK клеток и Т-лимфоцитов 198
5.4 Tag7 взаимодействует с TREM-1 рецептором на моноцитах и индуцирует появление таких же цитотоксических для опухолей субпопуляций лимфоцитов, как инкубация с цитокином IL-2 199
Выводы 200
Список литературы 201
- Toll-подобные рецепторы
- Адаптивный иммунитет. Т - лимфоциты
- CD8+ T лимфоциты распознают молекулу MicA на опухолевых клетках с помощью рецептора NKG2D
- Tag7 активирует лимфоциты человека, приводя к активации моноцитов и последующему увеличению экспрессии цитокинов IL-1b, IL-6, и TNF-
Toll-подобные рецепторы
Продукция макрофагами цитокинов и хемокинов является результатом стимуляции сигнальных рецепторов на этих клетках широким кругом компонентов патогенов. Из всего спектра этих рецепторов, toll-подобные рецепторы (tlrs) являются эволюционно древней системой иммунной защиты. Toll белок был впервые идентифицирован как ген, контролирующий правильное дорзо-вентральное расположение эмбриона в плодовой мушке дрозофиле. Но в 1996 году было обнаружено, что во взрослом насекомом Toll сигналинг индуцирует экспрессию ряда ключевых механизмов обороны против инфекции, в том числе антимикробных пептидов, таких как дрозомицин и играет ключевую роль для обороны против грамположительных бактерий и грибковых возбудителей (Lemaitre B, et al. 1996). Антимикробные пептиды представляются сейчас самой эволюционно ранней формой защиты от инфекции, и рецепторы, которые распознают болезнетворные микроорганизмы и посылают сигналы к производству антимикробных пептидов являются хорошими кандидатами на самые ранние рецепторы, появившиеся для защиты от инфекции у многоклеточных организмов. Было установлено, что мутации в Toll рецепторе дрозофилы или в сигнальных белках, активируемых Toll, приводили к снижению производства антимикробных пептидов и приводили к повышенной уязвимости взрослых мух для грибковых заражений. Впоследствии гомологи Toll, называемые Toll-подобные рецепторы были обнаружены у животных, включая млекопитающих, в которых они связаны с устойчивостью к вирусным, бактериальным и грибковым инфекциям. В растениях белки с доменами, напоминающие лиганд-связывающие регионы TLR белков, участвуют в производстве антимикробных пептидов, указывая на древность этих доменов как средства иммунной защиты (Armant MA, et al. 2002).
Toll-подобные рецепторы млекопитающих активизируются различными патогенассоциированными молекулярными паттернами. У людей есть 10 генов TLR, (13 у мышей), и каждый из этих рецепторов распознает определенный набор молекулярных паттернов, которых нет в здоровых клетках позвоночных. Эти паттерны характерны для патогенных микроорганизмов в той или иной стадии развития инфекции и часто называется патогенассоциированные молекулярные паттерны (PAMPs). У млекопитающих системы TLRs распознают молекулярные паттерны, характерные для грамотрицательных и грамположительных бактерий, грибков и вирусов. Бактериальные клеточные стенки и мембраны состоят из повторяющихся массивов белков, углеводов, и липидов, многие из которых не встречаются в клетках животных. Особенно важное значение в распознавании бактерий иммунной системой и распознаванию их TLRs играет липотейхоевая кислота клеточной стенки грамположительных бактерий и липополисахарид (LPS) наружной мембраны грамотрицательных бактерий. Другие микробные компоненты также имеют повторяющиеся структуры. Жгутики бактерий состоят из повторяющихся субъединиц белка, и в бактериальной ДНК в изобилии содержатся неметилированый динуклеотид CpG (который обычно метилирован в ДНК млекопитающих). Вирусы почти всегда производят двухцепочечные РНК, как часть своего жизненного цикла, что нехарактерно для здоровых клеток млекопитающих. Все эти паттерны распознаются системой TLRs. В таблице 1 представлены современные данные о лигандах для TLRs и их клеточной локализации (Jimnez-Dalmaroni MJ, et al. 2016).
Так как существует только сравнительно небольшое количество TLR генов, система TLRs имеют ограниченную специфичность по сравнению с репертуаром рецепторов адаптивной иммунной системы. Тем не менее, они могут распознавать элементы большинства патогенных микробов и экспрессируются многими типами клеток, включая фагоцитирующие макрофаги и дендритные клетки, В-лимфоциты и некоторые эпителиальные клетки, позволяя начать антимикробный ответ во многих тканях. TLRs являются датчиками для микробов, присутствующими во внеклеточном пространстве. Некоторые TLRs млекопитающих являются рецепторами на поверхности клетки и похожи на Toll дрозофилы, а другие находятся внутриклеточно в мембранах эндосом, где они обнаруживают патогенные микроорганизмы или их компоненты, которые были поглощены клетками путем фагоцитоза, рецептор-опосредованного эндоцитоза или макропиноцитоза (Dowling JK, et al. 2016). Toll рецепторы представляют собой трансмембранные белки с внеклеточным доменом, содержащем 18-25 копий лейцин-богатого повтора (LRR). Эти несколько LRR создают подковообразную поверхность на белке, который адаптирована для связывания лигандов и распознавания как на внешней (выпуклой), так и на внутренней (вогнутой) поверхности. Системы TLRs млекопитающих активируются при связывании лиганда, что переводит их к форме димеров или олигомеров. Все TLR белки млекопитающих содержат TIR домен (Toll и IL-1 рецептор) в конце цитоплазматического участка, который взаимодействует с другими TIR-тип доменами, обычно имеющимися у других сигнальных молекул. Это название происходит от того, что рецептор для цитокина интерлейкина 1 (IL-1) имеет TIR домен в цитоплазматической части молекулы и проводит сигнал через тот же путь, что и активируется в некоторых системах TLRs, хотя внеклеточной регионов IL-1 рецептора состоят из иммуноглобулин-подобных доменов и не имеет LRR (Jin MS, et al. 2008). В течение многих лет после открытия у млекопитающих системы TLRs было не известно, связывают ли они непосредственно микробные паттерны или же они распознают присутствие микробов некоторыми косвенными средствами. Toll дрозофил, например, не является классическим паттерн распознающим рецептором. Он не распознает возбудителя напрямую; вместо этого он активизируется, когда связывает расщепленную версию собственного белка, Spatzle. Дрозофила содержит другие молекулы, которые напрямую распознают возбудитель инфекции и этим вызывают протеолитический каскад, который приводит к расщеплению Spatzle. Одним из таких белков является PGRP-S (Kurata S 2014). Однако недавно были получены рентгеновские кристаллические структуры трех димеров TLRs млекопитающих, связанных с их лигандами, что показывают, что по меньшей мере некоторые из системы TLRs млекопитающих могут напрямую распознавать микробные лиганды. TLR-1, TLR-2 и TLR-6 млекопитающих являются рецепторами поверхности клетки, которые активируются различными лигандами, включая липотейхоевую кислоту и диацилированные и триацилированные липопротеины грамотрицательных бактерий. Они находятся на макрофагах, дендритных клетках, эозинофилах, базофилах и тучных клетках. Связывание лиганда индуцирует образование гетеродимеров из TLR -2 и TLR -1, или TLR -2 и TLR -6. Рентгеновская кристаллическая структура комплекса синтетического триацилированного липопептида с гетеродимером TLR-1 и TLR-2 показывает, как именно это связывание индуцирует димеризацию. Две из трех липидных цепей связываются с выпуклой поверхностью TLR-2, а третья связывается с выпуклой поверхностью TLR-1. Димеризация рецепторов приводит к тому, что цитоплазматические TIR домены располагаются в непосредственной близости друг от друга и начинают проведение сигнала (Jin MS et al. 2007). Подобные взаимодействия, как предполагается, происходят и с диацилированными липопептидами, которые индуцируют димеризацию TLR-2 и TLR-6. Для распознания некоторых лигандов комплексом TLR-2: TLR-6, таких как длинноцепочечные жирные кислоты и -гликаны клеточной стенки, требуется наличие корецептора. Скавенжер рецептор CD36, который связывает длинноцепочечные жирные кислоты, и Dectin-1, который связывает -глюканы, являются партнерами TLR-2 в распознавании этих лигандов. TLR-5 экспрессируется на клеточной поверхности макрофагов, дендритных клеток и кишечных эпителиоцитов; он распознает флагеллин, субъединицу белка бактериальных жгутиков. TLR-5 распознает высоко консервативный участок флагеллина, который находится в недоступном для связывания месте в собранном жгутике. Это означает, что рецептор активируется только мономерным флагеллином, который получается только при ферментативном разрушении жгутиковых бактерий в межклеточном пространстве (Song WS, et al. 2017). У мышей есть TLR-11, гомолога которого нет у людей, который также как TLR-5 распознает только интактный белок. TLR-11 экспрессируется макрофагами и дендритными клетками, а также эпителиальными клетками печени, почек и мочевого пузыря. У TLR-11 дефицитных мышей развиваются инфекции мочевыводящих путей, вызванные уропатогенными штаммами кишечной палочки, хотя бактериальные лиганды для TLR-11 еще не определены. TLR-11 может быть активирован актин-связывающим белком млекопитающих профилином. Простейший паразит токсоплазма экспрессирует белок похожий на профилин, и у мышей, не имеющих TLR-11, развиваются более серьезные повреждения тканей при токсоплазменной инфекции, что дает возможность говорить о том, что белок токсоплазмы может быть естественным лигандом для TLR-11 (Kucera K, et al. 2010).
Адаптивный иммунитет. Т - лимфоциты
Адаптивный иммунитет устроен сложнее, чем врожденный. В отличие от врожденного иммунитета, система узнает не определенные классы молекул, присутствующие только у патогенов, а определенный антиген, особенный в каждом случае. Иммунитет после контакта с антигеном сохраняется на протяжении всей жизни. Ключевую роль в адаптивном иммунитете играют лимфоциты. Дифференцировка Т- лимфоцитов происходит в тимусе, В - лимфоцитов – в костном мозге. Лимфоциты циркулируют в крови и лимфоидных органах и активируются после контакта с антигеном. Чужеродный пептид - антиген распознается только в комплексе с МНС при контакте со специализированными клетками - дендритными клетками или макрофагами в лимфоузлах. Лимфоциты одновременно взаимодействуют и с антигеном, и с МНС.
Презентация антигена Т-клеткам в периферических лимфоидных органах приводит к дифференциации Т- лимфоцитов в несколько субпопуляций, одни из которых осуществляют цитотоксическую функцию (CD8+ цитотоксические лимфоциты- ЦТЛ), другие -вспомогательную – активацию эффекторных клеток (CD4: Th1, Th2).
Т лимфоциты имеют специфический рецептор – Т клеточный рецептор (TCR) Он может узнавать пептид - антиген только в комплексе с МНС – главным комплексом гистосовместимости. Главный комплекс гистосовместимости – это белковый комплекс, расположенный на мембране всех клеток организма. Есть несколько типов комплекса MHC, самыми важными из них являются 1 и 2 типы. Пептиды для MHC генерируют протеосомы и лизосомальные ферменты. Собственные белки клетки подвергаются расщеплению в протеосомах, потом попадают в эндоплазматический ретикулум, связываются с МНС и вместе транспортируются на мембрану. Белки внешнего происхождения попадают в лизосомы клетки и оттуда они транспортируются вместе с МНС на мембрану. Иногда возможна кросс-презентация, когда внутриклеточные белки могут попадать в лизосомы, а экзогенные пептиды могут связываться с комплексом МНС при эндоцитозе (Nakayama, et al. 2015).
T-клетки распознают MHC с помощью Т-клеточного рецептора. Однако, для взаимодействия с различными типами MHC лимфоцитам нужны различные корецепторы. Т-хелперы несут CD4 корецептор, узнающий МНС в комплексе с антигеном, Т- киллеры экспрессируют CD8 корецептор, узнающий МНС . Также все Т лимфоциты несут на своей поверхности корецептор CD45 и молекулы адгезии CD11, CD18, которые распознают молекулы ICAM на мембране клетки-мишени.
TCR состоит из двух субъединиц. У классических Т клеток это субъединицы и . Есть также неканоноческая небольшая субпопуляция Т-лимфоцитов, несущие TCR другой структуры - . Они будут рассмотрены отдельно. Все Т-клетки имеют предшественника из гемопоэтических стволовых клеток красного костного мозга, который мигрирует в тимус и дифференцируются в незрелые тимоциты. В тимусе происходит созревание лимфоцитов.
Развитие тимоцитов в тимусе происходит в несколько стадий. На первой стадии лимфоцты не несут корецепторов CD4 или CD8, на второй несут сразу оба корецептора, а на третьей выбираются лимфоциты со специфичностью к MHC I или II. (Zdrojewicz Z, et al. 2016).
Ранние Т клеточные предшественники экспрессируют CD44+CD25+CD117+. Эти клетки уже теряют способность к дифференцировке в другие типы клеток. Далее эти клетки теряют экспрессию CD44 и начинают -селекцию (Zdrojewicz Z, et al. 2016).
Гены, кодирующие Т рецептор, отличаются от большинства других генов. Они состоят из большого количества идущих друг за другом генов, кодирующих один и тот же участок молекулы Т рецептора. В процессе созревания Т лимфоциты, RAG рекомбиназа выбирает в каждой клетке один из этих генов, и удаляет из ее генома все другие. Для каждой из цепей будущего Т рецептора таких массивов генов 3: V (variable), D (diversity) и J (joining). После удаления рекомбиназой остальных участков, 3 выбранных фрагмента соединяются в один ген, кодирующий выбранный случайно Т клеточный рецептор. Такой рецептор имеет случайную специфичность, и теоретически, способен распознать практически любую структуру. Однако случайный характер рекомбинации также означает, что лишь немногоие из собранных рецепторов будут функциональны. Отбор рецепторов происходит в несколько этапов. Первой собирается субединица рецептора. Она образует комплекс с инвариабельной преCR- субъединицей, и такой рецептор проверяется на способность взаимодействовать с собственным MHC I и II. Клетки тимуса экспрессируют оба комплекса гистосовместимости, что позволяет развивающимся лимфоцитам протестировать взаимодействие своего Т рецептора с обоими классами молекул комплекса гистосовместимости. Клетки, чей рецептор неправильно собран и неспособен узнавать свой MHC, погибают по пути апоптоза. Этот процесс называется позитивной селекцией (Klein L, et al. 2014). Затем точно также собирается субединица рецептора, и имеющие функциональный Т рецептор лимфоциты переходят ко второй стадии отбора – негативной селекции. (Roth DB. 2014).
Выжившие при негативной селекции лимфоциты обладают функциональным Т клеточным рецептором, который может распознавать различные антигены в комплексе с MHC I или II. В зависимости от того, с каким комплексом гистосовместимости взаимодействует их рецептор, они экспрессируют или CD8+(если взаимодействуют с MHC I) или CD4+(если мишенью является MHC II). Однако, часть таких лимфоцитов способна распознавать собственные антигены, и вызывать иммунный ответ на клетки своего организма. Эти клетки отсеиваются на следующем этапе, называемом негативная селекция. На нем клетки, имеющие слишком сильное сродство своего Т клеточного рецептора к белкам своего организма, элиминируются (Klein L, et al. 2014).
Созревшие в тимусе лимфоциты затем мигрируют в лимфоузлы на периферию организма, где они ожидают контакта с антигеном, к которому специфичен их уникальный Т рецептор. Такие клетки называются наивными Т лимфоцитами. При встрече со своим антигеном Т лимфоцит активируется и начинает активно делиться. Часть поделившихся клеток становятся эффекторными лимфоцитами, выполняя свою роль в регуляции иммунного ответа и уничножении патогенов, а часть становится клетками памяти, храня информацию о встреченном патогене для более эффективного вторичного иммунного ответа (Moran AE, et al. 2012).
Для активации Т лимфоцита необходимо не только взаимодействие его Т рецептора с антигеном, закрепленном на главном комплексе гистосовместимости, но и дополнительный сигнал от корецепторов, служащий защитой от ошибочных срабатываний иммунной системы. Это молекула В7 на поверхности антигенпрезентирующй клетки и рецептор CD28 на лимфоците (Moran AE, et al. 2012). Только после одновременного получения этих двух сигналов происходит активации Т лимфоцита.
CD8+ и CD4+ Т лимфоциты выполняют разные функции в иммунной системе. CD8+ Т лимфоциты являются эффекторными клетками и в основном выполняют роль уничтожения зараженных патогенами или опасных клеток организма. CD4+ Т-клетки участвуют в регуляции работы других клеток иммунной ситемы: В-клеток, макрофагов, и CD8+ Т клеток.
Активация CD4+Т-клетки приводит к ее дифференцировке в Th1 или Th2 подтип, которые отличаются набором производимых цитокинов. Th1-клетки стимулируют клеточный иммунный ответ, усиливают фагоциоз макрофагов. Th2 стимулируют гуморальный иммунный ответ, активируют дифференцировку B-лимфоцитов в плазматические клетки, способные продуцировать антитела.
CD4+ клетки играют важную роль в цитотоксическом ответе CD8+ лимфоцитов. Они способны выполнять роль антиген презентирующей клетки, а также вырабатывают цитокины, стимулирующие активацию и пролиферацию CD8+ лимфоцитов. CD4+ T-клетки необходимы для образования клеток памяти CD8+ T-клетками.
CD8+ T лимфоциты распознают молекулу MicA на опухолевых клетках с помощью рецептора NKG2D
С самого начала исследования было понятно, что мы имеем дело не с канонической популяцией CD8+ Т лимфоцитов, распознающих свои мишени с помощью Т клеточного рецептора. Такие лимфоциты используют для лизиса клеток-мишеней перфорин и гранзимы, а в нашем случае убийство происходит с участием FasL-Fas. Кроме того, клетки К562 не экспрессируют MHC молекулы, что исключает их распознавание через Т клеточный рецептор. Поэтому сразу было понятно, что нужно рассматривать участие неканонических популяций клеток. Известно, что клетки K562 обычно экспрессируют на их поверхности неканонический антиген MicA, который является лигандом для поверхностного рецептора NKG2D, часто наблюдаемого на CD8+ T-лимфоцитах. Используя специфическое окрашивание антителами, клетки-мишени и лимфоциты тестировали на присутствие соответствующих молекул и, кроме того, белков FasL и Fas.
Для обнаружения клеток, несущих как NKG2D, так и FasL на поверхности, мы провели 3 параметрический анализ популяции CD3+ CD8+ лимфоцитов, очищенных с помощью отрицательной магнитной сепарации, которые одновременно окрашивалось анти-NKG2D (FITC-конъюгированным), анти-FasL (PE-конъюгированным) и анти-CD8 (TC конъюгированным). Результаты проточной цитометрии показали, что 100% очищенной популяции CD3+CD8+ содержит маркер CD8, около 30% популяции также содержит NKG2D, а около 65% NKG2D+ лимфоцитов также имеет FasL+, причем почти все клетки FasL+, экспрессировали NKG2D (рис.27А). Окрашивание общей популяции лимфоцитов показало, что она содержала 20% CD3 + CD8 + клеток. В клетках K562, разделенных посредством положительной магнитной сепарации на Fas+ и Fas- популяции, специфическое окрашивание антител также выявило присутствие MicA на поверхности клеток K562, и этот антиген был более выражен в фракции Fas + (рис.27B).
Чтобы подтвердить, что NKG2D и MicA действительно вовлечены в цитотоксическую активность CD8+ T-лимфоцитов, мы проанализировали эту активность в экспериментах по ее ингибированию с помощью специфических антител. Предварительная инкубация CD8+ T-лимфоцитов с анти-NKG2D-антителами или клеток K562 с анти-MicA-антителами полностью ингибирует цитотоксичность, тогда как добавление преиммунных IgG не оказывает никакого эффекта. Цитотоксическая активность не наблюдалась после удаления либо NKG2D-экспрессирующих лимфоцитов, либо MicA-экспрессирующих клеток K562 (рис.28).
Чтобы проверить эти результаты, мы понижали экспрессию MicA в клетках K562 и затем обрабатывали клетки CD8+ T-лимфоцитами. Мы ввели shRNA к MicA в клетки К562 и выбрали клоны, в которых уровень транскрипции MicA составлял только 20% от уровня MicA в контрольных клетках. Эти клоны не были восприимчивы к цитотоксичности CD8+ Т-лимфоцитов. Таким образом, нокдаун MicA полностью блокировал цитотоксический эффект этих лимфоцитов (рис.28).
Цитотоксическая активность CD8 + лимфоцитов для клеток K562 без и после предварительной инкубации с анти-NKG2D или анти-MicA антителами, или преиммунным IgG, а также после удаления NKG2D-положительных лимфоцитов (NKG2D-neg) или MicA-положительных клеток K562 (MicA-neg), или K562 после нокдауна гена MicA (клоны 1 и 2). Статистика: двухсторонняя ANOVA против контроля для антител и t-тест против контроля для отрицательных клеточных субпопуляций.
Таким образом, FasL-зависимый контактный лизис клеток K562 зависит от взаимодействия между MicA, экспрессируемым на их поверхности, и NKG2D на поверхности CD8+ T-лимфоцитов.
Для того, чтобы проверить, как соотносится полученная нами цитотоксическая субпопуляция CD8+ Т лимфоцитов с классическими ЦТЛ, использующими для распознавания своих клеток-мишеней Т клеточный рецептор, мы провели следующее исследование.
На рисунке 29 приведены расширенные данные по специфичности лизиса опухолевых клеток мишеней лимфоцитами, свежеполученными из донорской крови (Рисунок 29А) и ЛАК клетками на 6 день инкубации с цитокином IL-2 (Рисунок 29В).
Как видно из рисунка, свежеполученные из крови CD8+лимфоциты неспособны лизировать никакие из использованных в качестве клеток-мишеней опухолевых клеточных линий. После активации цитокином IL-2 они приобретают способность лизировать опухолевые клеточные линии, лишенные MHC комплекса. Опухолевые клеточные линии L-929, HeLa, CSML-100, для которых показано наличие на поверхности клеток комплекса MHC, необходимого для представления пептидов раковых клеток Т-клеточному рецептору(TCR) ЦТЛ, по-прежнему остаются устойчивыми к цитотоксическому действию CD8+ Т лимфоцитов.
Далее мы провели следующий эксперимент. Используемые нами культуры опухолевых клеток способны к образованию монослоя на пластике, не смешиваясь с находящимися в растворе лимфоцитами. Мы инкубировали 30 минут лимфоциты, свежеполученные от здорового донора, с образовавшими монослой прикрепившимися опухолевыми клетками, а затем лимфоциты собирали и культивировали в течение 6 суток в присутствии 1000 ед цитокина IL-2. Эти лимфоциты обладали заметным цитотоксическим действием против той клеточной линии, с которой они вступали в контакт (Таблица 6). Однако, их противоопухолевая активность к другим клеточным линиям не превышала естественной гибели клеток в контрольных образцах. Таким образом, нами было показано, что часть CD8+ необученных лимфоцитов из крови донора способна после презентации им антигенов опухолевых клеточных линий активироваться и после стимуляции цитокином IL-2 приобрести цитолитические свойства. Но цитолитическая активность этих клеток была антиген зависимой и в отсутствии антигена, использованного для их активации, они были неспособны к лизису опухолевых клеток.
Интересным фактом является то, что после прединкубации CD8+ Т лимфоциты теряют способность лизировать MHC негативные клетки К562. Также интересным наблюдением является тот факт, что приобретенная после прединкубации цитотоксическая активность CD8+ Т лимфоцитов не является видоспецифичной, так как проявляется человеческим лимфоцитами как в отношении человеческих клеток, несущих MHC человека (HeLa), так и в отношении мышиных опухолевых клеточных линий, несущих мышиный MHC (CSML-100, L-929). В то время как более эволюционно консервативные рецепторы, как например PAMP, способны узнаваться лигандами других организмов, MHC считается одним из самых высоко изменчивых генов в как у различных видов, так и внутри одной популяции. В связи с этим фактом удивительно, что человеческие CD8+ Т лимфоциты хорошо распознают и лизируют мышиные опухолевые клетки после предварительной инкубации. Вполне возможно, что в данной ситуации распознавание происходит не через MHCCR комплекс, а через какой-то более консервативный механизм. Далее мы подробнее проанализировали механизмы, протекающие в клетках после предварительной инкубации с опухолевыми клетками, взяв опухолевые клетки L929.
Мы сравнили цитотоксическую активность CD8+ и CD4+ Т-лимфоцитов, выделенных из пула РВМС без предварительной обработки или после предварительной активации путем инкубации с клетками L929 в течение 1 часа, на клетках К562 и L929. Как необработанные, так и предварительно активированные РВМС (переносимые в новую чашку) инкубировали с IL-2 в течение 6 дней, а затем фракции CD3+CD4+ и CD3+CD8+ выделяли из полученных популяций клеток ЛАК и анализировали их цитотоксическую активность. CD4+ T-лимфоциты из необработанного или предварительно активированного пула PBMC убивали только HLA-отрицательные клетки K562, не проявляя цитотоксичности по отношению к клеткам L929 (рис.30A, 30B). То же самое можно сказать о CD8+ Т-лимфоцитах из необработанного пула РВМС, но ситуация, наблюдавшаяся после их предварительной активации, была иной: CD8+ Т лимфоциты, как оказалось, теряли способность убивать клетки K562, но становились цитотоксичными для клеток L929, с которыми они были предварительно инкубированы (рис.30А, 30В).
Tag7 активирует лимфоциты человека, приводя к активации моноцитов и последующему увеличению экспрессии цитокинов IL-1b, IL-6, и TNF-
Как было показано ранее в нашей работе, Tag7 способен взаимодействовать с рецептором цитокина TNF белком TNFR1. Хотя цитокин TNF и был открыт в связи с его цитотоксичностью на опухолевых клетках, все же основной его ролью в организме является регуляция иммунной системы и пролиферация клеток. Эти процессы запускаются после взаимодействия с тем же TNFR1 рецептором, как и процессы цитотоксические. В связи с этим мы решили проверить, играет ли взаимодействие Tag7 с TNFR1 рецептором какую-либо роль в активации иммунной системы – процессе, в котором центральную роль играет взаимодействие цитокинов, которым является TNF, с их рецепторами.
Для этой цели мы взяли РВМС, выделенные из крови здоровых доноров, и инкубировали их с Tag7 (10-9 М) в течение 6 дней, а затем тестировали на цитотоксическую активность против линии опухолевых клеток K562. Было показано, что активированные Tag7 лимфоциты убивали 27% клеток K562. Таким образом, добавление белка Tag7 приводит к активации лимфоцитов человека и на 6 сутки они приобретают цитотоксическую активность против опухолевых клеток линии К562.
Чтобы понять процессы, происходящие в клетках периферической крови человека под действием Tag7, мы проанализировали картину активации генов в РВМС, обработанных этим белком. Для этой цели РВМС инкубировали в RPMI-1640 с 10% FBS (контроль) или в той же среде, содержащей 10-9 М Tag7 в течение 3 и 24 ч, и общую РНК, экстрагированную из этих клеток, использовали для исследования глобального профиля активности генов с помощью микрочипа Illumina HumanHT-12. Результаты этого анализа опубликованы в работе (Sharapova TN, et al. J Innate Immun. 2017). Мы обратили особое внимание на несколько генов, участвующих в иммунном ответе. В частности, это касается генов, кодирующих цитокины, высвобождаемые моноцитами на начальных стадиях иммунного ответа (IL-1, увеличивается в 3,8 раза через 24 часа, IL-6, увеличивается в 3,5 раза через 3 часа, а TNF- увеличивается в 1,5 раза после 24 часов). Чтобы дополнительно подтвердить эти данные, мы провели дополнительные RT-PCR-анализы активации мРНК этих генов в изолированных моноцитах, которые были обработаны в течение 3 или 24 часов Tag7 (рис.65А).
Можно видеть, что уровни экспрессии IL-1, IL-6 и TNF-, сильно увеличиваются. В качестве контроля мы тестировали популяцию PBMC, лишенную моноцитов, на уровень экспрессии этих генов и не обнаружили изменения (Рис. 65В). Эти данные подтверждают, что гены цитокинов, экспрессируемые моноцитами в начальной фазе иммунного ответа, значительно активируются при инкубации с белком Tag7. Для тестирования участия моноцитов в индукции противоопухолевой активности РВМС, их удаляли из пула PBMC, а оставшиеся клетки обрабатывали Tag7 в течение 6 дней. В этом варианте цитотоксичность не наблюдалась (рис.66).
Затем мы обработали ранее изолированные моноциты Tag7 в течение 24 часов, добавили их в пул PBMC без моноцитов и инкубировали эту смесь клеток в течение 6 дней без Tag7. В результате лимфоциты приобретали цитотоксическую активность против клеток K562 (рис.66).
Это свидетельствует о том, что моноциты действительно необходимы для активации лимфоцитов Tag7. Известно, что гены, кодирующие вышеупомянутые цитокины в моноцитах, могут быть индуцированы при активации TREM-1, инициирующего рецептора, экспрессируемого на миелоидных клетках. Более того, это было показано (Read CB et al. 2015), что Tag7 (PGLYRP1) в комплексе с бактериальным пептидогликаном или в мультимерной форме способен связывать TREM-1 во время иммунных реакций, вызванных бактериями. Они также продемонстрировали прямое связывание этих двух белков. Следовательно, мы предположили, что именно взаимодействие Tag7 с TREM-1 на поверхности моноцитов инициирует развитие субпопуляций лимфоцитов с противоопухолевой активностью. Чтобы проверить эту гипотезу, РВМС обрабатывали Tag7 в присутствии пептида LP17, ингибитора TREM-1. Этот пептид используется для нарушения трансдукции сигнала через рецептор TREM-1. Как и ожидалось, этот пептид полностью блокировал активацию лимфоцитов (рис.66).
Таким образом, нам удалось показать, что белок Tag7 способен взаимодействовать с рецептором врожденного иммунитета TREM-1 на поверхности моноцитов. Взаимодействие с рецептором запускает каскад внутриклеточных событий, результатом которого становится секреция моноцитами в среду цитокинов, секретируемых на первых стадиях провоспалительного иммунного ответа. Эти цитокины вызывают активацию лимфоцитов, придавая им те же противоопухолевые свойства, что и длительная инкубация с цитокином IL-2. Интересно, что концентрация Tag7, необходимая для активации лимфоцитов, на несколько порядков ниже концентрации IL-2, необходимой для активации лимфоцитов, в то время как цитотоксичность лимфоцитов, активированных Tag7 достоверно выше, чем активированных IL-2. Таким образом можно предположить, что Tag7 обладает свойствами цитокина, и способен вызывать активацию цитотоксических лимфоцитов, обладающих противоопухолевым действием на HLA-негативные опухолевые клетки.