Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 12
Сперматогенез у D.melanogaster 12
Сигнальный путь JAK-STAT 15
Сигнальный путь BMP 18
Cигнальный путь Headgehog 21
Сигнальный путь EGFR 23
Инсулиновый сигнальный путь 26
Трансляционная репрессия 27
Взаимодействие сигнальных путей 27
Ассиметричное деление и репрограммирование герминальных клеток 29
DEAD-бокс содержащие РНК-хеликазы 30
Общие сведения 30
Структурные характеристики DEAD-бокс содержащих РНК-хеликаз 31
Биохимическая активность DEAD-бокс содержащих РНК-хеликаз 32
Функциональные особенности DEAD-бокс содержащих РНК-хеликаз 34
Подсемейства DEAD-бокс содержащих РНК-хеликаз 37
Функции белков DDX3 39
Ядерный экспорт 40
Транскрипция 40 Трансляция 41
Формирование РНП-гранул 42
Регуляция клеточного цикла 42
Туморогенез 43
Belle - представитель подсемейства DDX3 у Drosophila 45
Заключение 47
Материалы и методы 49
Линии Drosophila melanogaster и клетки, использованные в работе 49
Иммунофлуоресцентное окрашивание препаратов целых семенников 50
Анализ клеточной смерти при помощи метода TUNEL 50
Конфокальная микроскопия 51
Подсчет среднего объёма ядер 51
Анализ личиночных гонад 52
Получение лизатов для электрофореза и Вестерн-блот анализа 52
Электрофорез в полиакриламидном геле (метод Лэммли) и Вестерн-блот-анализ 52
Антитела, использованные в работе 54
Получение кДНК при помощи метода обратной транскрипции 55
ПЦР в реальном времени 55
Получение антител к Belle 56
PAT-анализ длины поли-А хвостов мРНК 57
Проведение теста на фертильность 58
Результаты 59
РНК-хеликаза Belle необходима для поддержания герминальных клеток в семенниках Drosophila 59
Поддержание соматических клеток в семенниках мух с мутацией bel 64
РНК-хеликаза Belle необходима как внутриклеточный фактор для поддержания герминальных клеток 70
Потеря герминальных клеток происходит в результате клеточной гибели 75
РНК-хеликаза Belle необходима для поддержаниягерминальных клеток в личинках Drosophila 78
Уровень митотических циклинов падает в гонадах мух с мутацией bel 81
Эктопическая экспрессия циклина В, но не циклина А, приводит к восстановлению сперматогенеза на
фоне герминального нокдауна bel 85 Обсуждение 89
Выводы 97
Список цитируемой литературы 98
Благодарности 117
- Cигнальный путь Headgehog
- Функциональные особенности DEAD-бокс содержащих РНК-хеликаз
- Анализ клеточной смерти при помощи метода TUNEL
- Поддержание соматических клеток в семенниках мух с мутацией bel
Введение к работе
Актуальность проблемы
Поддержание процесса гаметогенеза у разнополых организмов критично для воспроизводства и выживаемости видов. Мужские герминальные стволовые клетки (ГСК) обладают способностью к ассиметричному делению, производя две дочерние клетки, самообновленную ГСК и гониабласт, который подвергается дальнейшим митотическим делениям. Пролиферация и дифференцировка герминальных клеток тщательно регулируются в организме. Семенники Drosophila melanogaster являются ценной модельной системой для изучения комплексного фундаментального процесса сперматогенеза. Анатомическая структура семенников Drosophila представляет собой хорошо упорядоченную систему клеточных популяций. Это позволяет ясно интерпретировать генетические эффекты на уровне определенных типов клеток, включая стволовые клетки, что весьма затруднительно при изучении сперматогенеза у млекопитающих.
Семенники Drosophila формируются в течение среднего и позднего эмбриогенеза слиянием клеток соматических предшественников гонад и эмбриональных герминальных клеток. На апикальном конце семенника взрослого самца располагается герминальный пролиферативный центр. Он включает в себя 10-15 мелких соматических клеток, формирующих структуру, называемую «хабом». Хаб экспрессирует сигнальные молекулы, необходимые для поддержания двух соседних популяций стволовых клеток: 6-12 ГСК и в два раза большего количества соматических примордиальных клеток цисты (ПКЦ). ГСК находятся в тесном контакте с клетками хаба посредством формирования комплексов клеточной адгезии между ними, а ПКЦ нормально располагаются во втором ряду за ГСК и контактируют с хабом с помощью цитоплазматических выростов, которые изолируют индивидуальные ГСК друг от друга. Деление ГСК приводит к образованию новой ГСК и гониабласта (сперматогония). Деление ПКЦ приводит к появлению новой ПКЦ и соматической клетки цисты, пара последних обволакивает гониабласт, образуя цисту. Гониабласт претерпевает четыре митотических деления внутри цисты, формируя 2-х, 4-х, 8-ми и 16-ти клеточный синцитий ранних герминальных клеток, окруженных двумя неделящимися клетками цисты. Герминальные клетки в составе 16-ти клеточной цисты переключаются на программу роста первичных сперматоцитов, после чего подвергаются мейотическому делению, что приводит к появлению 64 сперматид (Fuller, 1998; White-Cooper, 2010; Spradling et al., 2011).
Набор локальных сигналов из хаба необходим для поддержания и самообновления ГСК. Клетки хаба секретируют цитокин Unpaired (Upd) для активации сигнального пути JAK-STAT (Janus kinase-signal transducer and activator of transcription) в обеих популяциях прилегающих стволовых клеток, что необходимо для их самообновления и поддержания (Kiger et al., 2001; Tulina and Matunis, 2001; Leatherman and DiNardo, 2008; 2010). Сигнальный путь Hedgehog (Hh) необходим для самообновления и пролиферации ПКЦ, но не ГСК (Michel et al., 2012; Amoyel et al., 2013). Сигнальный путь BMP (Bone Morphogenetic Protein) функционирует в ГСК и ПКЦ, и тоже нужен для регуляции их самообновления и дифференцировки (Shivdasani and Ingham, 2003; Kawase et al., 2004; Schulz et al., 2004). Известно также, что условия питания, инсулиновый сигнальный путь и путь, опосредуемый комплексом трансляционной репрессии Nanos/Pumilio, а также эпигенетические факторы вносят вклад в поддержание ГСК в семенниках (Forbes and Lehmann, 1998; Wang and Lin, 2004; Matunis et al., 2012).
Гены, экспрессия которых требуется для самообновления и поддержания ГСК и дифференцировки их потомков, регулируются на уровне транскрипции, процессинга мРНК и трансляции. РНК-хеликазы, содержащие DEAD-бокс, производят АТФ-зависимое расплетание РНК и ремоделинг рибонуклеопротеиновых комплексов, участвуя во всех аспектах метаболизма РНК. DEAD-бокс содержащие белки подсемейства DDX3 найдены у широкого круга эукариотических организмов от дрожжей до человека. Они участвуют в ядерном экспорте мРНК, е расплетании, регуляции транскрипции, инициации трансляции, контроле клеточного цикла и апоптозе (Schrder, 2010; Linder and Jankowsky, 2011). Человеческие гены DDX3 расположены один на Х-хромосоме (DDX3X), а другой в нерекомбинирующем участке Y-хромосомы (DDX3Y or DBY) (Lahn and Page, 1997). DDX3X экспрессируется в различных тканях, тогда как экспрессия DBY обнаружена только в мужских герминальных клетках (Ditton et al., 2004). Ген, кодирующий DBY, расположен в участке Y-хромосомы, получившем название AZF (AZoospermia Factor). Делеции в этом участке ассоциированы с мужским бесплодием. Нарушения в экспрессии DBY приводят к гипосперматогенезу, а его делеция вызывает Сертоли-клеточный синдром (Sertoli Cell-Only Syndrome, SCOS) (Kamp et al., 2001; Foresta et al., 2000; Lardone et al., 2007; Gueler et al., 2012). SCOS характеризуется полным отсутствием герминальных клеток при сохранении соматических клеток Сертоли. Однако биологический механизм потери герминальных клеток при отсутствии экспрессии DBY остается невыясненным.
Belle (bel) - единственный гомолог DDX3 у Drosophila. Bel - существенный ген
для выживания и развития, поскольку все известные нулевые аллели bel летальны на
эмбриональной стадии (Johnstone et al., 2005). РНК-хеликаза Belle функционирует в
трансляционной регуляции экдизонового каскада (Ihry et al., 2012). Найдено также,
что Belle является компонентом машины РНК-сайленсинга (Zhou et al., 2008). В
фолликулярных клетках яичников Belle является важным регулятором сигнального
пути Notch, нарушение экспрессии Belle приводит к отсрочке дифференцировки
фолликулярных клеток, в норме регулируемой путем Notch, что вызывает
последующие нарушения в формировании передне-задней полярности
развивающегося ооцита (Poulton et al., 2011). В культуре клеток Drosophila S2 Belle контролирует сегрегацию хромосом в анафазе митоза (Pek and Kai, 2011). Показано, что экспрессия Belle в гонадах необходима для фертильности, как самцов, так и самок (Johnstone et al., 2005). Экстремально высокая функциональная плейотропность Belle затрудняет ясное понимание е функций в организме. Полученные в ходе работы данные свидетельствуют, что Belle имеет существенные внутриклеточные функции в мужских герминальных клетках для поддержания и деления ГСК и сперматогониев в семенниках Drosophila.
Цель и задачи работы
Целью работы являлся анализ клеточных функций РНК-хеликазы Belle (DDX3) в
поддержании и дифференцировке ранних герминальных клеток в процессе
сперматогенеза у Drosophila melanogaster. Для этого были поставлены следующие
задачи:
-
Изучить влияние нарушения экспрессии Belle на поддержание и функционирование герминальных и соматических клеток в семенниках;
-
Выяснить способ потери ранних герминальных клеткок в семенниках с нарушенной экспрессией Belle;
-
Проанализировать влияние зиготической экспрессии Belle на рост и развитие гонад личинок третьего возраста;
-
Оценить регуляторный эффект Belle на экспрессию белков клеточного цикла в семенниках;
-
Проанализировать возможность спасения ранних герминальных клеток в семенниках путем эктопической экспрессии трансгенных конструкций, кодирующих циклин В и циклин А, на фоне тканеспецифического РНКi-нокдауна Belle в герминальных клетках.
Научная новизна работы
В настоящей работе впервые было продемонстрировано, что РНК-хеликаза Belle (DDX3) необходима внутриклеточно для поддержания и пролиферации ГСК и сперматогониев в семенниках Drosophila. При нарушении экспрессии Belle у мутантных особей или при РНКi-нокдауне Belle в герминальных клетках происходит массовая потеря ранних герминальных клеток, включая стволовые, в результате преждевременной клеточной гибели, что полностью прекращает процесс сперматогенеза. Анализ семенников личинок третьего возраста показал, что закладка герминальных тканей у мутантов bel проходит нормально. Однако уже на ранних стадиях сперматогенеза наблюдаются герминальные клетки с аномально большим размером. Мы предположили, что это связано с задержкой деления в G2M фазовом переходе и нарушением регуляции митоза. Было обнаружено значительное снижение уровня экспрессии митотических циклинов А и В на фоне гипоморфной мутации bel в семенниках. Предложена модель, согласно которой нарушение экспрессии Belle вызывает резкое снижение дозы циклинов в митотически-активных ранних герминальных клетках семенника, арест на стадии входа в митоз и последующую гибель клеток. Мы достигли частичного спасения ранних герминальных клеток, включая ГСК, в семенниках и восстановления фертильности самцов путем эктопической экспрессии трансгенной конструкции, кодирующей циклин В, на фоне тканеспецифического РНКi-нокдауна Belle в герминальных клетках.
Практическая значимость
Мутации, ведущие к нарушениям гаметогенеза, критически влияют на возможность воспроизводства и поддержания видов. В настоящей работе было показано, что РНК-хеликаза Belle (DDX3) требуется как внутриклеточный фактор для поддержания и пролиферации ГСК и их потомков сперматогониев в семенниках D.melanogaster. Нарушение экспрессии Belle в результате мутаций или герминального РНКi-нокдауна приводит к массовой потере герминальных клеток, включая стволовые. При этом популяции соматических клеток цисты и хаба поддерживаются в таких семенниках. Клетки цисты в семенниках Drosophila являются функциональными аналогами клеток Сертоли у млекопитающих (Spradling et al., 2011). Подобный фенотип, тотальная потеря герминальных клеток при сохранении соматических клеток Сертоли, был описан у человека в случае делеции гена DBY (DDX3Y) гомологичного bel и известен как Сертоли-клеточный синдром (SCOS). Это позволяет предположить консервативные функции белков DDX3 в сперматогенезе. По-видимому, общий молекулярно-биологический механизм лежит в
основе вызываемых нарушений у человека и Drosophila. Понимание молекулярно-клеточных функций DBY в поддержании герминальных клеток человека чрезвычайно затруднено. Данное исследование, проведенное на модели Drosophila, впервые позволило выяснить, что роль РНК-хеликаз подсемейства DDX3 в поддержании и пролиферации ГСК в семенниках связана с контролем митотических делений через регуляцию уровня митотических циклинов. Таким образом, результаты работы имеют большое значение для практического понимания механизмов, нарушение которых может приводить к бесплодию у человека.
Положения, выносимые на защиту
-
Показано, что РНК-хеликаза Belle требуется внутриклеточно для митотических делений и выживания герминальных стволовых клеток и сперматогониев в семенниках Drosophila.
-
Найдено, что соматические клетки хаба и цисты поддерживаются в семенниках мух, мутантных по bel, и у мух с нокдауном bel в герминальных клетках.
-
Выявлено, что ранние герминальные клетки у мух, мутантных по bel, и у мух с нокдауном bel в герминальных клетках теряются посредством клеточной смерти, а не посредством избыточной дифференцировки.
-
Установлено, что РНК-хеликаза Belle функционирует как положительный регулятор экспрессии циклина В, что существенно для поддержания и дифференцировки герминальных стволовых клеток семенников Drosophila.
Апробация работы
Результаты, полученные в данной работе, были представлены на следующих
научных симпозиумах и конференциях: International Scientific Conference on
Programmed cell death in biology and medicine (Москва, Россия, 4-5 июня, 2012), V
Всероссийская научно-практическая конференция «Стволовые клетки и
регенеративная медицина» (Москва, Россия, 18-21 ноября, 2013), XXVI Зимняя молодежная научная школа «Переспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, Россия,10-14 февраля, 2014, третья премия на конкурсе молодых ученых), International conference on bioorganic chemistry, biotechnology and bionanotechnology (Москва, Россия, 15-19 сентября, 2014, первая премия на конкурсе молодых ученых), VII Российский симпозиум «Белки и пептиды» (Новосибирск, Россия, 12-17 июля, 2015).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 3 статьи в международных реферируемых журналах.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, раздела «Материалы и методы», результатов, обсуждения, а также выводов и списка цитируемой литературы, в который входит 235 ссылок. Работа изложена на 117 страницах печатного текста, содержит 7 таблиц и 27 рисунков.
Cигнальный путь Headgehog
Сигнальный путь JAK-STAT консервативен от беспозвоночных до млекопитающих. Как у Drosophila, так и у других организмов сигналинг JAK-STAT играет важную роль в различных клеточных процессах, в том числе в поддержании и пролиферации стволовых клеток. У Drosophila, в отличие от млекопитающих, организация пути JAK-STAT проще, так как его компоненты представлены в единственном виде, за исключением лигандов (Рис. 2). Это делает Drosophila идеальным модельным объектом для изучения сигнального пути JAK-STAT. У Drosophila известно три цитокиновых лиганда этого пути: Unpaired (Upd), Upd2 и Upd3. Их селективное действие обеспечивает тканеспецифичность сигналинга, несмотря на то, что паттерны их экспрессии могут частично перекрываться. Эти лиганды способны связываться с трансмембранным рецептором на клеточной поверхности, который кодируется геном domeless (dome). Dome относится к цитокиновым рецепторам, которые не имеют собственной киназной активности и в ответ на связывание сигнальных молекул фосфорилируются белками JAK (Janus kinase), обладающими тирозин-киназной активностью. У Drosophila ген hopscotch (hop) кодирует единственного представителя JAK киназ. С фосфорилированным рецептором Dome у Drosophila взаимодействует транскрипционный фактор STAT92E (STAT), который содержит фосфотирозин-связывающий SH2 (Src Homology 2) домен. Взаимодействие STAT с рецептором приводит к его фосфорилированию киназой JAK и активации. В результате STAT димеризуется и транслоцируется в ядро, где активирует гены-мишени (Arbouzova and Zeidler, 2006).
Каждый этап сигналинга JAK-STAT тонко регулируется, так как некорректная активация сигнального пути приводит к различным нарушениям как у Drosophila, так и у млекопитающих. У людей нарушение пути JAK-STAT ассоциировано с канцерогенезом в различных тканях и лейкемией.
Сигнальный путь JAK-STAT играет важную роль в развитии репродуктивной системы Drosophila. Клетки хаба секретируют лиганд Upd, активируя путь JAK-STAT как в ГСК, так и в ПКЦ (Kiger et al., 2001; Tulina et al., 2001). Активация пути JAK-STAT в обоих типах стволовых клеток необходима для поддержания их адгезии к клеткам хаба. При нарушении сигналинга происходит потеря как соматических, так и герминальных стволовых клеток. В тоже время эктопическая активация сигналинга приводит к избыточной пролиферации внутри семенника ранних соматических и герминальных клеток (Kiger et al., 2001; Tulina et al., 2001; Leatherman and DiNardo, 2008; Leatherman and DiNardo, 2010; Sinden et al., 2012). Было показано, что активация STAT только в ПКЦ является достаточной для самообновления обоих популяций стволовых клеток, тогда как активация STAT автономно в ГСК, по-видимому, необходима, главным образом, для поддержания адгезии к клеткам ниши (Leatherman and DiNardo, 2008; Leatherman and DiNardo, 2010).
До конца не ясно, каким образом STAT регулирует клеточную адгезию стволовых клеток. Исследования показывают, что сигналинг JAK-STAT в ГСК влияет на уровень экспрессии и локализацию E-кадгерина, компонента комплексов клеточной адгезии, нарушение экспрессии которого влечет за собой потерю стволовых клеток из ниши (Leatherman and DiNardo, 2008; Voog et al., 2008; Leatherman and DiNardo, 2010). Более того, показано, что активность STAT необходима для реорганизации цитоскелета и ре-дифференцировки сперматогониев (Brawley and Matunis, 2004; Sheng et al., 2009). STAT способен связываться с промотором гена chickadee и активировать его транскрипцию в ГСК и ПКЦ (Shields et al., 2014). Этот ген, кодирующий профилин Drosophila, необходим для локализации E-кадгерина в составе комплексов адгезии и, таким образом, для поддержания ГСК. Тем не менее, автономный сигналинг JAK-STAT сам по себе не достаточен для самообновления ГСК.
Были идентифицированы другие гены-мишени STAT: zink-finger homeodomain 1 (zfh1) и chronologically inappropriate morphogenesis (chinmo), которые кодируют транскрипционные репрессоры. Они экспрессируются в ПКЦ и играют существенную роль в их самообновлении, а также в промотировании экспрессии лигандов пути BMP, тем самым способствуя поддержанию ГСК в недифференцированном состоянии (Flaherty et al., 2010; Leatherman and DiNardo, 2008). Zfh1 и Сhinmo не экспрессируются в ГСК, таким образом, STAT регулирует различные мишени в ГСК и ПКЦ. Оверэкспрессия Zfh1 и Сhinmo вызывает эктопическое накопление как ПКЦ, так и ГСК (Flaherty et al., 2010; Leatherman and DiNardo, 2008).
Другой интересной особенностью Сhinmo является его способность к активации экспрессии DoublesexM (DsxM) в ПКЦ, канонического фактора детерминации пола у самцов. Нарушение экспрессии Сhinmo приводит к «maleo-female» конверсии и формированию в семенниках соматических клеток с морфологией напоминающей фолликулярные клетки яичников (Ma et al., 2014). Позднее были проведены эксперименты, в которых в семенниках были удалены ПКЦ посредством эктопической экспрессии в них фактора Grim, индуцирующего апоптоз. В результате этих экспериментов, ранние недифференцирующиеся герминальные клетки продолжали поддерживаться и накапливаться в семенниках, независимо от их положения относительно ниши. Поскольку Upd не распространяется дальше первого слоя клеток, прилегающих к нише, то только прилегающие к хабу герминальные клетки, всё ещё получали активный сигналинг JAK-STAT. Герминальные клетки, которые были удалены от ниши, не экспрессировали STAT, но поддерживали активный сигналинг BMP (Lim et al., 2012). Эти данные подтверждают то, что сигналинг JAK-STAT не достаточен для поддержания ГСК, но необходим для их адгезии к клеткам хаба.
К настоящему моменту, помимо Zfh1 и chinmo обнаружены и другие мишени сигналинга JAK-STAT в семенниках Drosophila. Так, Socs36E (suppressor of cytokine signaling) экспрессируется в ПКЦ, но не в ГСК и активирует ингибиторную петлю обратной связи. Он выступает в роли репрессора сигналинга JAK-STAT в ПКЦ, предотвращая вытеснение ими ГСК с позиций возле хаба, ограничивая адгезионные взаимодействия ПКЦ с хабом, опосредованные -интегрином (Issigonis et al., 2009). По всей видимости, наличие петли обратной связи обеспечивает равновесие в конкуренции между герминальными и соматическими стволовыми клетками за нишу (Issigonis et al., 2009; Singh et al., 2010). В семенниках сигнальный путь JAK-STAT регулируется также и на эпигенетическом уровне. Показано, что комплекс ремоделинга нуклеосом NURF экспрессируется только на апикальном конце семенника и его экспрессия препятствует дифференцировке стволовых клеток, посредством активации сигналинга JAK-STAT (Cherry et al., 2010).
Функциональные особенности DEAD-бокс содержащих РНК-хеликаз
Регуляция взаимодействия стволовых клеток с нишей и друг с другом зависит от уровня экспрессии факторов, ответственных за формирование комплексов адгезии. Уровень активации сигналинга JAK-STAT определяет степень сродства герминальных стволовых клеток к хабу через регуляцию уровня экспрессии E-кадгерина, который необходим для адгезии между ГСК и хабом (Leatherman and DiNardo, 2008; Leatherman and DiNardo, 2010). Формирование данных комплексов существенно для передачи сигналов от клеток хаба к ГСК. Показано, что активация BMP-рецепторов в семенниках происходит локально в области кадгерин-зависимых межклеточных контактов между клетками хаба и ГСК (Michel et al., 2011).
С другой стороны, сигналинг JAK-STAT позитивно регулирует экспрессию лигандов сигналинга BMP, исходящего от ПКЦ к ГСК (Leatherman and DiNardo, 2010). В конечном итоге, активация сигналинга JAK-STAT в соматических клетках усиливает активацию фактора pMAD в ГСК и гониабластах. Кроме того, на S2 клетках показана способность Bam, являющегося основной мишенью сигналинга BMP, в комплексе с Bgcn подавлять экспрессию E-кадгерина (Shen et al., 2009). Это может быть существенным фактором, способствующим дальнейшей дифференцировке герминальных клеток. Однако насколько данный механизм реализуется в семенниках не ясно. Компонент сигнального пути JAK-STAT Socs36E способен ингибировать в ПКЦ активность пути JAK-STAT по принципу обратной связи (Issigonis et al., 2009; Singh et al., 2010). Однако недавно показано, что Socs36E также негативно регулирует сигналинг EGFR в ПКЦ. В Socs36E мутантных семенниках сигналинг EGFR гиперактивируется в ПКЦ, что приводит к конкурентному вытеснению ГСК с позиции возле хаба (Amoyel et al., 2016). Socs36E репрессирует активацию JAK-STAT и EGFR, а также способствует снижению экспрессии -интегрина в ПКЦ (Callus and Mathey-Prevot, 2002; Issigonis et al., 2009). Не так давно, был найден ещё один фактор Madm (Mlf1-adaptor molecule), который имеет схожие функции с Socs36E. Он тоже регулирует баланс между ГСК и ПКЦ через регуляцию -интегрина и его функции зависят от сигналинга JAK-STAT. Помимо этого Madm способен регулировать активацию сигналинга EGFR через регуляцию уровня экспрессии pERK (Singh et al., 2016). Совместно данные сигнальные пути способствуют достижению равновесия в конкуренции за нишу с одной стороны, и регуляцию взаимодействия между двумя популяциями стволовых клеток с другой стороны. Данное взаимодействие способствует физическому экранированию ГСК друг от друга и ограничению поддерживающего сигналинга от хаба к гониабластам и сперматогониям, способствуя их дифференцировке.
Ассиметричное деление и репрограммирование герминальных клеток ГСК физически взаимодействуют с клетками хаба посредством образования адгезионных комплексов. Компонентом данных комплексов является E-кадгерин, экспрессия которого детектируется на поверхности клеток хаба и в зоне их контактов с ГСК. -катенин (Armadillo у Drosophila) и APC2 (гомолог Adenomatous polyposis coli млекопитающих) внутриклеточно взаимодействуют с E-кадгерином в составе комплексов адгезии и принимают участие в регуляции ориентации веретена деления ГСК. В норме одна центросома расположена непосредственно вблизи хаба, в то время как другая в процессе интерфазы перемещается на противоположный полюс ГСК (Yamashita et al. 2003; Yamashita et al. 2007). Белок ядерного матрикса Megator регулирует ассиметричные деления через митотический комплекс контрольной точки сборки веретена деления SAC (spindle assembly checkpoint). Нарушение экспрессии данного белка приводит к снижению уровня и нарушению локализации APC2 и E-кадгерина в ГСК (Liu et al., 2015). Было показано, что ПКЦ также в норме делятся ассиметрично. Данный процесс нуждается в функциональных центросомах, транспортном белке Dynein и белке Moesin, ответственном за связь актиновых филаментов с мембраной. Эти компоненты необходимы для ориентации веретена деления в процессе клеточного цикла ПКЦ (Cheng et al., 2011). Однако сравнительно мало данных имеется о молекулярных механизмах регуляции процесса ассиметричного деления.
Логично предположить, что возобновление популяции стволовых клеток в процессе старения или воздействия внешних факторов может проходить посредством симметричного деления. И действительно, ряд данных демонстрирует возможность возобновления популяции стволовых клеток, как в процессе симметричного деления, так и посредством репрограммирования герминальных клеток, находящихся на стадии трансамплификационных делений (Brawley and Matunis, 2004; Kai and Spradling, 2004; Cheng et al., 2008). В работе Cheng с соавторами было показано, что частота симметричных делений ГСК у Drosophila с возрастом возрастает. Эти данные позволяют предположить, что симметричное деление ГСК может быть механизмом для возобновления популяции ГСК, которая истощается с возрастом (Cheng et al., 2008). Ещё одним механизмом возобновления ГСК может служить реокупация ниши клетками, которые уже приступили к дифференцировке. Если такие клетки вновь будут получать поддерживающие факторы из ниши, они могут редифференцироваться в стволовые клетки. С помощью температурочувствительной мутации stat было показано, что клетки, приступившие к стадии трансамплификационных делений, способны реокупировать нишу при возвращении на пермиссивную температуру (Brawley and Matunis, 2004). Подобные эффекты наблюдаются и в случае оогенеза. В данных экспериментах кратковременная индукция экспрессии Bam под промотором белка теплового шока в ГСК приводила к активации трансамплификационных делений в стволовых клетках и формированию герминального синцития. Однако спустя некоторое время после индукции клетки восстанавливали фенотип характерный для ГСК (Kai and Spradling, 2004), что может говорить о консервативности механизма репрограммирования герминальных клеток в стволовые, как у самцов, так и у самок Drosophila.
Анализ клеточной смерти при помощи метода TUNEL
В ряде работ было показано участие РНК-хеликазы DDX3 в регуляции клеточного цикла. При этом по опубликованным данным DDX3 может регулировать как G1/S, так и G2/M переходы клеточного цикла. На культуре клеток HeLa было продемонстрировано, что снижение уровня экспрессии DDX3 приводит к задержке перехода G1/S клеточного цикла и снижению уровня экспрессии циклина E (Lai et al., 2010). В другой работе, демонстрирующей те же эффекты, температурочувствительная мутация в гене DDX3 приводит к падению уровня экспрессии мРНК циклина А в культуре клеток золотистого хомячка, что указывает скорее на транскрипционный уровень регуляции (Fukumura et al., 2003). Ещё одной предположительной мишенью клеточного цикла, которая может регулироваться DDX3, является циклин D1. В работе по изучению туморогенных свойств DDX3 было продемонстрировано, что на фоне снижения экспрессии DDX3 происходит увеличение экспрессии данного циклина наряду со снижением экспрессии p21waf1 (Chang et al., 2006). При этом функции самого белка могут зависеть от белков клеточного цикла. Известно, что DDX3 может фосфорилироваться по остатку треонина-204 посредством комплекса циклин В/CDC2, что приводит к его инактивации (Sekiguchi et al., 2007). Таким образом, локализация и функции DDX3 зависят от фазы клеточного цикла, и его модификации могут способствовать этим процессам. Показано, что DDX3 может взаимодействовать с DDX5 и регулировать опосредованный им транспорт мРНК из ядра в цитоплазму в процессе G2/M перехода клеточного цикла. При этом данные взаимодействия зависят от уровня фосфорилирования обоих белков (Choi and Lee, 2012). В работе на ранних эмбрионах мыши было продемонстрировано, что нокдаун DDX3 приводит к уменьшению количества бластоцитов и увеличению количества апоптозов. Предполагается, что на фоне данных нарушений активируется p53-зависимый путь, что приводит к индукции апоптозов и задержке в клеточном цикле (Li et al., 2014).
Другой представитель DDX3 хеликаз белок DED1 у Schizosaccharomyces pombe принимает участие в регуляции трансляции мРНК циклинов B-типа (Cig2 и Cdc13). Мутации в гене ded1 приводят к задержке клеточного цикла в G2/M переходе и снижают уровень трансляции мРНК циклинов B (Daga and Jimenez, 1999; Grallert et al., 2000). Таким образом, хеликаза DDX3 принимает участие в регуляции клеточного цикла у различных организмов. К сожалению, в настоящий момент набор данных не достаточен для четкого понимания её роли в этих процессах и несколько противоречив.
Туморогенез
К настоящему времени накопилось довольно много данных об участии РНК-хеликазы DDX3 человека в процессах канцерогенеза. Впервые канцерогенные функции DDX3 были обнаружены в случае гепатоклеточной карциномы, где наблюдалось увеличение уровня экспрессии мРНК DDX3, что ассоциировалось с усилением канцерогенеза (Huang et al., 2004).
В настоящий момент накоплено довольно большое количество данных, согласно которым РНК-хеликаза DDX3 может выступать в роли онкоактиватора. DDX3 может участвовать в канцерогенезе при раке молочной железы. Было продемонстрировано, что BPDE (benzopyrene diol epoxide) – канцероген, который содержится в табачном дыме, вызывает увеличение уровня экспрессии DDX3, что ассоциируется с избыточной пролиферацией и неопластической трансформацией эпителиальных клеток молочной железы (Botlagunta et al., 2008). В данной работе на культуре эпителиальных клеток MCF10A показано, что белок DDX3 взаимодействует с промотором E-кадгерина и подавляет его экспрессию, что приводит к эпителиально-мезинхимальной трансформации, сопровождающейся увеличением подвижности и инвазивных свойств клеток (Botlagunta et al., 2008). Регуляция экспрессии E-кадгерина это не единственный пример, который демонстрирует канцерогенные свойства белка DDX3, обусловленные регуляцией им молекул адгезии. Ещё одним примером регуляции молекул адгезии посредством DDX3 может являться -катенин, который, участвует с одной стороны в стабилизации адгезионных комплексов и с другой стороны в Wnt-сигналинге, в качестве транскрипционного фактора. В ответ на активацию сигнального пути Wnt, DDX3 способен связываться с казеин-киназой 1 (CK1) и стимулировать фосфорилирование эффектора данного сигнального пути Disheveled, что приводит к стабилизации свободного цитоплазматического -катенина (Cruciat et al., 2013) и последующей его транслокации в ядро. Также было показано, что DDX3 способен позитивно регулировать трансляцию Rac1, что также приводит к стабилизации -катенина (Chen et al., 2015). Усиление канцерогенных свойств различных типов опухолей наблюдается и в случае опосредованного DDX3 увеличения экспрессии транскрипционного фактора Snail, который участвует в репрессии транскрипции молекул адгезии (Sun et al., 2011). Совместно, эти данные говорят о том, что белок DDX3 способен выступать в роли канцерогена, участвуя в регуляции экспрессии адгезионных молекул и клеточной подвижности.
В противоположность этим данным РНК-хеликаза DDX3 может выступать также и в роли онкосупрессора. Так, например, DDX3 способен взаимодействовать с промотором p21waf1, что приводит к активации его транскрипции. Данное взаимодействие приводит к нарушению формирования колоний в различных клеточных линиях (Chao et al., 2006; Chang et al., 2006). DDX3 в норме подавляет транскрипцию циклина D1 и может выступать в роли онкосупрессора, а нарушение его экспрессии приводит к увеличению пролиферативной активности клеток и подавлению апоптоза (Chang et al., 2006). Экспрессия DDX3 регулируется p53 (Wu et al., 2011). У пациентов с раком толстой кишки высокий уровень экспрессии DDX3 ассоциировался с позитивным прогнозом, а низкий уровень с плохим прогнозом и частым метастазированием. Высокая частота мутаций в сигнальном пути p53 и дерегуляция пути Wnt совокупно с взаимодействием DDX3 с этими онкогенными путями может объяснить позитивную прогностическую ассоциацию с уровнем DDX3 (Su et al., 2015). Инактивация p53 и как следствие потеря DDX3 усиливает канцерогенез через дерегуляцию экспрессии Е-кадгерина и ассоциируется с плохим прогнозом выживаемости и высоким числом рецедивов при немелкоклеточном раке легкого (Wu et al., 2014). В совокупности эти данные могут говорить о том, что DDX3 может выступать в роли онкосупрессора. По всей видимости, онкосупрессорные или онкоактиваторные функции DDX3 зависят от природы опухоли. Необходимы дальнейшие исследования, для более точного выяснения молекулярных механизмов и роли DDX3 в канцерогенезе. В семиномах, опухолях герминальных клеток яичка, найдена повышенная экспрессия DDX3Y (DBY), но функциональность этого наблюдения не определена (Gueler et al., 2012).
Поддержание соматических клеток в семенниках мух с мутацией bel
DEAD-бокс содержащая РНК-хеликаза Belle является единственным представителем подсемейства DDX3 у Drosophila (Johnstone et al., 2005). Ген bel экспрессируется повсеместно и все известные строгие мутации этого гена летальны и ассоциированы с нарушением роста и развития на стадии личинок. Однако наиболее изучены функции Belle у Drosophila в клетках зародышевого пути. Известно, что высокий уровень экспрессии bel наблюдается в этих клетках в норме и необходим для фертильности самцов и самок (Johnstone et al., 2005). Belle является существенным фактором для фертильности самок. Оогенез у мутантных самок развивается морфологически нормально до 9 стадии, после чего большинство яйцевых камер дегенерирует, тогда как оставшиеся продуцируют зрелые ооциты с нарушенным дорсальным аппендажем (Johnstone et al., 2005). Гипоморфные аллели bel вызывают нарушения на поздних стадиях сперматогенеза, такие как дефекты сегрегации хромосом в мейозе, ненормально крупные производные митохондрий, ассоциированные сразу с несколькими ядрами и дезорганизация кластеров удлиненных сперматид. Эти нарушения приводят к стерильности или пониженной фертильности самцов (Johnstone et al., 2005).
Как в семенниках, так и в яичниках в герминальных клетках Belle находится в цитоплазме и колокализуется с другой DEAD-бокс содержащей РНК-хеликазой Vasa (DDX4) в составе специфичных для герминальных тканей Drosophila околоядерных гранул, называемых nuage, а также в полярных гранулах на заднем полюсе ооцитов (Johnstone et al., 2005; Kibanov et al., 2011). Гранулы nuage присутствуют в питающих клетках яичника, а так же в премейотических герминальных клетках у самцов, и являются центрами процессинга и регуляции трансляции РНК (Findley et al., 2003; Snee and Macdonald, 2004). Кроме того, им отводится ключевая роль в биогенезе и процессинге коротких piРНК, которые участвуют в подавлении мобильных элементов в яичниках, а также в регуляции некторых мРНК белок-кодирующих генов в семенниках (Lim and Kai, 2007; Malone et al., 2009; Kibanov et al., 2011). Belle также экспрессируется в соматических клетках гонад, в яичниках её экспрессия детектируется во всех фолликулярных клетках (Johnstone et al., 2005; Poulton et al., 2011). Согласно данным, полученным на имагинальных дисках глаз Drosophila, в норме Belle детектируется в цитоплазме. Однако при добавлении лептомицина B (LMB), ингибитора белка ядерного экспорта CRM1/XPO1 (chromosomal region maintenance 1/exportin 1) происходит накопление Belle в нуклеоплазме. Из чего авторы делают вывод, что Belle, подобно DDX3 у млекопитающих, способна к перемещению между ядром и цитоплазмой (Ambrus and Frolov, 2010). Другим примером локализации Belle в составе РНП-комлексов является её локализация в составе гранул по морфологии напоминающих P-тельца в нейронах Drosophila. Данные гранулы содержат белковые компоненты характерные для P-телец, такие как, например dFMR, и являются центрами трансляционной репрессии мРНК. Было продемонстрировано, что Belle частично колокализуется с dFMR в составе этих гранул (Beckham et al., 2008). В составе данных комплексов Belle возможно участвует в их ремоделинге и регуляции трансляции мРНК. Однако пока не установлены мишени, которые данный белок регулирует у Drosophila.
В фолликулярных клетках яичников потеря Belle ассоциирована с отсрочкой активации метаболического пути Notch и дерепрессии белка Delta. Эти изменения приводят к задержке дифференцировки фолликулярных клеток и нарушению поздних стадий оогенеза. Подобный фенотип наблюдается также при нарушении экспрессии нуклеазы Dicer1, которая является ключевым компонентом биогенеза микроРНК у Drosophila. Эти данные позволяют предположить участие Belle в трансляционной регуляции сигналинга Notch с участием микроРНК (Poulton et al., 2011). Возможно, что Belle принимает участие также в endo-siРНК-сайленсинге. В подтверждение этому было показано, что Belle коиммунопреципитируется с AGO2, FMR1, VIG и AGO1, которые являются компонентами endo-siРНК и микроРНК комплексов сайленсинга (Zhou et al., 2008; Ulvila et al., 2006). Работы по исследованию функций белка DDX3 на культуре клеток человека демонстрируют, что данный белок также может участвовать в сайленсинге РНК (Kasim et al., 2013). Интересно отметить, что участие Belle в piРНК-сайленсинге, специфичном для герминальных тканей, выявлено не было (Kibanov et al., 2011).
Участие Belle в регуляции трансляции или транскрипции на данный момент изучено слабо. Было показано, что подобно своему гомологу DDX3, Belle может взаимодействовать с фактором eIF4E и участвовать в репрессии трансляции мРНК bruno в яичниках (Yarunin et al., 2011). Bruno как трансляционный репрессор подавляет трансляцию мРНК oskar, ключевого фактора, обеспечивающего правильную передне-заднюю поляризацию ооцита (Kim-Ha et al., 1995). В яичниках мутантов bel экспрессия белка Bruno была увеличена, а уровень Oskar был значительно снижен. Однако данное взаимодействие может быть не прямым, поскольку физическое взаимодействие Belle с мРНК Bruno показано не было (Yarunin et al., 2011). Belle может регулировать трансляцию транскрипционного фактора E74A. На фоне мутации bel происходит накопление мРНК E74A в цитоплазме, но при этом отсутствует белковый продукт данного гена (Ihry et al., 2012). Данных для понимания роли Belle в регуляции транскрипции и сплайсинга также недостаточно. На культуре S2 клеток было продемонстрировано, что белок с цинковыми пальцами Zn72D способен коиммунопреципитироваться с Belle. При помощи генетического и биохимического анализов в данной работе было показано, что данное взаимодействие необходимо для регуляции мРНК mle, компонента комплекса дозовой компенсации MSL (Male Specific Lethal) (Worringer et al., 2009). Авторы предполагают, что Belle совместно с Zn72D участвует в сплайсинге, а также связывании сплайсированной формы мРНК mle и регуляции её трансляции. Тем не менее, полученных данных слишком мало, чтобы судить о функционировании Belle в сплайсинге.
Ряд опубликованных данных свидетельствует об участии Belle в контроле клеточного цикла. Уровень экспрессии ингибитора циклин-зависимой киназы Dacapo (гомолога p21/p27 у млекопитающих) в имагинальных дисках глаз был значительно снижен у мутантов bel, что препятствовало аресту клеточного цикла в G1 фазе, индуцированному комплексом E2F/pRB (Ambrus and Frolov, 2010). На культуре клеток Drosophila S2 показано, что Belle контролирует сегрегацию хромосом в анафазе митоза, обеспечивая хромосомную локализацию фактора Barren, компонента конденсинового комплекса 1 (Pek and Kai, 2011).
Таким образом, Belle, подобно всем DEAD-бокс содержащим РНК-хеликазам, возможно участвует в различных аспектах метаболизма РНК, таких как регуляция трансляции, транскрипции, ремоделинг РНП-комплексов, РНК-сайленсинг и, возможно, регуляция сплайсинга и экспорта РНК. Ряд имеющихся к настоящему времени данных позволяет говорить о мультифункциональности белка, но, к сожалению, их недостаточно для понимания его роли в регуляции данных процессов. Нарушения экспрессии гомологов Belle у человека ассоциированы с различными патологиями, такими как, например бесплодие и канцерогенез. Возможно исследования данного белка у Drosophila, позволят лучше понять механизмы, которые приводят к данным паталогиям.